مقالة منهجية

تقييم بتكوين لHIV-1 مغلف مثلوثي بروتينات سكرية باستخدام خلية القاعدة ELISA الفحص

DOI:

10.3791/51995

⸱

سبتمبر 14, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre de recherche du CHUM, Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مطلوب فهم مطابقات المستضدات السطحية الفيروسية لتقييم تحييد الأجسام المضادة وتوجيه تصميم الجينات المناعية الفعالة للقاح. نصف هنا اختبار ELISA القائم على الخلايا والذي يسمح بدراسة التعرف على فيروس نقص المناعة البشرية -1 الثلاثي المعبر عنه على سطح الخلايا المنقولة بواسطة أجسام مضادة محددة مضادة ل Env.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> تتوسط البروتينات السكرية لغلاف فيروس نقص المناعة البشرية -1 (Env) في دخول الفيروس إلى الخلايا المستهدفة وهي ضرورية للدورة المعدية. يمكن أن يؤدي فهم كيف تكون هذه البروتينات السكرية قادرة على تغذية عملية الاندماج من خلال تغييراتها التوافقية إلى تصميم أغراض مناعية أفضل وأكثر فعالية لاستراتيجيات اللقاح. نصف هنا اختبار ELISA القائم على الخلايا والذي يسمح بدراسة التعرف على فيروس نقص المناعة البشرية -1 ثلاثي الأبعاد بواسطة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. بعد التعبير عن فيروس نقص المناعة البشرية -1 الثلاثي Env على سطح الخلايا المنقولة ، يتم تحضين الأجسام المضادة المضادة ل Env الخاصة بالتشكل مع الخلايا. ثم يتم استخدام الجسم المضاد الثانوي المترافق مع بيروكسيداز الفجل وتفاعل تلألؤ كيميائي بسيط للكشف عن الأجسام المضادة المقربة. هذا النظام مرن للغاية ويمكنه اكتشاف التغيرات التوافقية Env التي يسببها CD4 القابل للذوبان أو البروتينات الخلوية. يتطلب الحد الأدنى من المواد ولا توجد معدات أو دراية عالية التخصص. وبالتالي ، يمكن إنشاء هذه التقنية لفحص المستضدات والأجسام المضادة ذات الإنتاجية المتوسطة إلى العالية ، مثل الأجسام المضادة المعزولة حديثا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس نقص المناعة البشري نوع 1 (HIV-1) الدخول، بوساطة بروتينات سكرية مثلوثي المغلف الفيروسية (بيئية) هو الخطوة الأولى للدورة المعدية. كونها مستضد الفيروسية تتعرض الوحيد المقدم على سطح virions وبيئية مثلوث يتسبب تحييد الأجسام المضادة وnonneutralizing. على هذا النحو، فإنه يمثل المرشح المثير للتصميم مستمنع اللقاح. ومع ذلك، مع تجارب التطعيم بيئية في أشكال قابلة للذوبان أو المؤتلف أثارت ردود فعالية مع الحد الأدنى فقط مقابل معظم الأساسي HIV-1 يعزل 1-3. ومع ذلك، لاحظ فعالية جزئية في تجدد الاهتمام RV144 محاكمة لقاح 4 في HIV-1 بيئية كمرشح مستمنع. وقد أيد ذلك عن طريق دراسة حديثة أن تصف-أثار اللقاح الأجسام المضادة المناهضة للبيئية كافية لتوليد درجة معينة من الحماية ضد فيروس نقص المناعة البشرية والتحديات SIV 5.

بعد أن تم توليفها في الشبكة الإندوبلازمية، وglycoprote بيئيةفي السلائف، gp160، يخضع لمختلف التعديلات بعد متعدية التي تعتبر بالغة الأهمية لقدرته على تغذية عملية الانصهار الفيروسية. مقدمة بيئية يجب طيها بشكل صحيح والزميلة في أرتب قبل المشقوق إلى خارج هيولي gp120 و gp41 عبر الغشاء مفارز لها 6-10، مع التفاعلات noncovalent الحفاظ على اتصال gp120 gp41-. آلية الخلية المصابة مسؤولة أيضا عن glycosylating بيئية مشددة، تضم نحو 50٪ من إجمالي كتلتها 11،12. بنية معقدة الناتجة يسمح بيئية ليكون مرنا conformationally 13،14، مع توفير metastability التي يعتقد بيئية للسماح للتكيف وإخفاء بعض الحواتم المناعية للغاية التي لولاها أن تتعرض 15-19، وتسليط الضوء على أهمية فهم أفضل للالتشكل مختلفة عينات بيئية من قبل مثلوث الأصلي.

حتى الآن، وقد تم تطوير العديد من التقنيات وبنجاح تستخدم لدراسة بيئية الفصل بتكوينفي نفس الفئة. ومع ذلك، فإنها تختلف في حدودها، التي غالبا ما تقتصر على سياقات بيئية محددة. على سبيل المثال، الرنين مأكل السطح أو فحوصات مناعي التشكل باستخدام الاجسام المضادة المحددة (MABS)، تعتمد إما على جزيئات أحادى بيئية قابلة للذوبان أو تذوب التي هي معروفة لتكون مختلفة immunogenetically من أشكال مثلوثي على 20،21. تشير الدراسات الحديثة أيضا أن الانقسام يؤثر على التشكل بيئية مما أدى إلى تعرض الحواتم معترف بها أساسا nonneutralizing الأجسام المضادة 14،22،23.

نحن هنا تصف بالتفصيل طريقة تسمح لتحديد سريع وسهل من التشكل من-أعرب cellularly بيئية أرتب 18،24-26. بعد ترنسفكأيشن عابر بيئية في خط خلية ملتصقة البشري الربط الأجسام المضادة بيئية محددة يتم الكشف باستخدام رد فعل لمعان كيميائي بسيط. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لوصف تفضيل متعلق بتكوين جزئي من التشكل depen-الأجسام المضادة دنت. وهكذا، وهذا الفحص يوفر طريقة قوية ومرنة للغاية الكشف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. يوم 1 - خلية ثقافة

  1. لوحة 2 × 10 4 عظمية البشري (ملتحقا) خلايا لكل بئر في مبهمة، 96-جيدا لوحة خلية ثقافة مناسبة للقراءة التلألؤ. استخدام Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 100 U / مل البنسلين، الستربتومايسين. احتضان حتى اليوم التالي عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.

2. يوم 2 - Polyethylenimine (PEI) ترنسفكأيشن

  1. إعداد مزيج ترنسفكأيشن وفقا لخطوات لاحقة. ضبط كميات الكواشف والحمض النووي وفقا لعدد من الآبار التي سيتم transfected مع نفس بيئية.
  2. أنبوب A: إضافة 10 نانوغرام تات ترميز البلازميد (مثل PTAT-III 27) و 150 نانوغرام بيئية ترميز البلازميد إلى 5 ميكرولتر DMEM تستكمل مع 25 ملي HEPES.
  3. مطلوب البلازميد تات ترميز فقط عند استخدام تات التي تعتمد بيئية ترميز البلازميدات مثل pSVIII.
  4. أنبوب B: إضافة 450 نانوغرام PEI (من 1ميكروغرام / حل ميكرولتر) إلى 5 ميكرولتر DMEM.
  5. إضافة محتوى أنبوب إلى أنبوب A. B ميكس بدقة قبل vortexing لمدة 10 ثانية واحتضان مزيج ترنسفكأيشن 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية).
  6. إضافة 10 ميكرولتر من مزيج ترنسفكأيشن لكل بئر من 96 لوحة جيدا. احتضان لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.

3. يوم 4 - ELISA

  1. أداء جميع التجارب في درجة حرارة الغرفة لتقليل الإلتقام ممكن من المجمعات بيئية / الأجسام المضادة.
  2. إعداد 250 مل من غسل العازلة في لوحة تستخدم في نفس الوقت. غسل العازلة غير المالحة 1X تريس مخزنة (TBS) ودرجة الحموضة 7.5 (50 ملي تريس الكلورين، ودرجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم)، على أن تستكمل مع 1 ملم MgCl 2 و 1.8 مم CaCl 2.
  3. إعداد 125 مل من حجب العازلة في لوحة بإضافة 1٪ غير دهن الحليب الجاف و 5 ملي تريس 8.0 درجة الحموضة لغسل العازلة.
  4. إزالة وسائل الإعلام ثقافة الخلية ومزيج ترنسفكأيشن (طاف) من لوحة 96 جيدا.
  5. إضافة 100 μ؛ ل من حجب العازلة لكل بئر واحتضان 20 دقيقة في RT.
  6. إزالة طاف وإضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة (أو مصل) لكل بئر، المخفف إلى التركيز المناسب في عرقلة العازلة. عادة، استخدام تركيز 1 ميكروغرام / مل. احتضان 1 ساعة على RT.
  7. غسل 3X مع 100 ميكرولتر عرقلة العازلة ومن ثم تكرار عملية غسل 3X مع 100 ميكرولتر غسل العازلة.
  8. إزالة طاف، إضافة 100 ميكرولتر حجب العازلة، واحتضان 5 دقائق على RT.
  9. إزالة طاف وإضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية، المخفف 1/3000 في عرقلة العازلة. تختلف الأجسام المضادة الأمثل وفقا لتخفيف الخلافات المصنعة. احتضان 40 دقيقة في RT.
  10. غسل 3X مع 100 ميكرولتر عرقلة العازلة ومن ثم تكرار عملية غسل 3X مع 100 ميكرولتر غسل العازلة.

4. الحصول على البيانات

  1. إزالة طاف من لوحة وإضافة 30 ميكرولتر 1X تعزيز لمعان كيميائي (ECL) الركيزة لكل بئر.
  2. اكتساب الكيميائيإشارة iluminescence ل1 ثانية / جيد على لوحة مناسبة للقارئ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وقت القراءة قد تختلف وفقا للاختلافات الأجهزة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام الإجراء العام المذكورة أعلاه، فإننا تكييفها بروتوكول لفحص تأثير ذوبان CD4 (sCD4) وcoexpressed CD4 الخلوي على تعرض الحواتم CD4i على أي البرية من نوع (WT) تحور أو بيئية، كما هو موضح سابقا 18،24، 25،28 الشكل 1 يمثل تخطيطي الإجراء العام وتعرض الحواتم CD4i بعد العلاج مع sCD4 أو coexpression من CD4 الخلوي 18. في الشكل 2، كنا sCD4 للحث بيئية التغييرات متعلق بتكوين التي تعرض CD4i MABS 17B 48d الحواتم والتي تتداخل في موقع ملز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحسين هذا الاختبار للكشف عن تفاعل MABS محددة مع HIV-1 أعرب مثلوثي بيئية على سطح الخلية. مرة واحدة تم تأسيس البروتوكول، فإنه يمكن استخدامها في المديين المتوسط ​​والانتاجية العالية مع انخفاض تكاليف المواد العامة وكميات صغيرة من الأجسام المضادة. لأن هذا الاختبار هو القائم على ترنسفكأيشن، فإنه يمكن بسهولة أن تتكيف لcoexpression من البروتينات الخلوية مثل CD4 لدراسة آثارها على التشكل بيئية.

ومع ذلك، فإن قاعدة ترنسفك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور جيمس روبنسون لله هدية سخية من A32، 17B، 48d، و C11 MABS. تم الحصول على 121 PGT من خلال برنامج الكاشف NIH الإيدز، شعبة الإيدز، NIAID، المعاهد الوطنية للصحة (القط # 12343). وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة كندا للإبداع الزعيم برنامج # 29866، من قبل التشغيل CIHR # 257792، من قبل مؤسسة FRQS من شباب العلماء منح # 24639 لAF وبمنحة متصلة CRCHUM وكذلك من قبل CIHR المنحة حافزا # 126630 لAF وMR. AF هو المستفيد من FRSQ Chercheur Boursier جديد 1 الزمالة # 24639. وأيد MV من قبل جائزة بحوث الدكتوراه CIHR # 291485.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خلايا HOSATCCCRL-1543
صفيحة زراعة الأنسجة البيضاء غير الشفافة ، 96 بئر ، BD مسطحةالقاع 353296
بولي إيثيلينيمين ، خطي ، 25,000 ميجاواتPolysciences23966محضر في محلول 1 مجم / مل
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Invitrogen11995
Goat Anti-Human IgG ، بيروكسيداز مترافقبيرس31413
ركيزة تلألؤ كيميائي محسنةPerkinElmerNEL105001EA
TriStar LB 941 ، قارئ الألواحBerthold Technologies

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
  2. Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
  3. Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
  4. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
  5. Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
  6. Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
  7. Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
  8. Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
  9. Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
  10. Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
  11. Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
  12. Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
  13. Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
  14. Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
  15. Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
  16. Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
  17. Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
  18. Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
  19. Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
  20. Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
  21. Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
  22. Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
  23. Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
  24. Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
  25. Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
  26. Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
  27. Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
  28. Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
  29. Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
  30. Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
  31. Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
  32. Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
  33. Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
  34. Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
  35. Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
  36. Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
  37. Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
  38. Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
  39. Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

1 CD4

مقالات ذات صلة