مقالة منهجية

عزل الوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية وزراعتها على المسامية مصفوفة العظام

30K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/51999

⸱

فبراير 9, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Depto. Materiales Metálicos y Cerámicos, Instituto de Investigaciones en Materiales, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), 2Depto. of Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), 3Depto. Biología Celular y Tisular, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), 4Depto de Biología Celular, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), 5Depto. Genetica y Biología Molecular, Cinvestav-IPN, 6Subd. de Investigación, Centro Nacional de la Transfusión Sanguínea, Secretaria de Salud

في هذه المقالة

ملخص

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) لديها إمكانية تمايز نحو سلالة بانيات العظم عندما يتم تحفيزها بعوامل قابلة للذوبان أو مواد حيوية محددة. يقدم هذا العمل خيارا جديدا لتوصيل الخلايا الجذعية الجذعية من الغشاء الأمنيوسي البشري (AM-hMSCs) الذي يستخدم مصفوفة عظام الأبقار Nukbone (NKB) كسقالة.

الملخص

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) لديها إمكانية تمايز نحو سلالة بانيات العظم عندما يتم تحفيزها بعوامل قابلة للذوبان أو مواد حيوية محددة. يقدم هذا العمل خيارا جديدا لتوصيل الخلايا الجذعية الجذعية من الغشاء الأمنيوسي البشري (AM-hMSCs) الذي يستخدم مصفوفة عظام الأبقار Nukbone (NKB) كسقالة. وبالتالي ، فإن تطبيق الخلايا الجذعية الجذعية في عمليات الإصلاح وتجديد الأنسجة يعتمد بشكل أساسي على التنفيذ الفعال لتقنيات وضع هذه الخلايا في الأنسجة المضيفة. لهذا السبب ، اكتسب تصميم المواد الحيوية والسقالات الخلوية أهمية في السنوات الأخيرة لأن الخصائص الطبوغرافية للسقالة المختارة يجب أن تضمن الالتصاق والتكاثر والتمايز في سلالة الخلية المرغوبة في البيئة المكروية للأنسجة المصابة. يستخدم هذا الخيار لتوصيل الخلايا الجذعية الجذعية من الغشاء الأمنيوسي البشري (AM-hMSCs) مصفوفة عظام الأبقار كسقالة خلوية وهو تقنية استزراع فعالة لأن الخلايا تستجيب للخصائص الطبوغرافية لمصفوفة عظام الأبقار Nukbone (NKB) ، أي الانتشار على السطح ، والتغطية الكبيرة التي يسهل اختراقها واستعمار عمق المادة الحيوية ، بعد عملية عزل الخلية. نقدم إجراء عزل واستزراع الخلايا الجذعية الجذعية على مصفوفة بقري.

المقدمة

الزوج هناك وتجديد tissuesis واحد من الأهداف themain العلوم الطبية لأن الآفة في ororgan الأنسجة يمكن أن يكون تعجيزية، وفي بعض الحالات، قاتلة. في السياق، والعاملين الصحيين والباحثين يبحثون باستمرار التقنيات والأساليب والأدوات اللازمة لتوفير alternativesto علاجية جديدة تعزز هناك عملية زوج-تجديد الأنسجة التالفة. لذلك، ركزت العلوم الطبية الحيوية على دراسة الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة)، وخاصة الخلايا الجذعية البالغة، لأن هذا النسب خلية يمثل نموذجا مثاليا لدراسة عملية تجديد الأنسجة، وذلك بسبب قدرته على التفريق إلى الأدمة، أرومية متوسطة، والأديم الباطن الأنساب الخلية الا لجعل العلاج مع اللجان الدائمة واقعا، يجب أن يصاحب توصيف إمكانات thetherapeutic من اللجان الدائمة من تنفيذ تقنيات زراعة الخلايا الجديدة باستخدام المواد الحيوية والسقالات الخلوية التي تضمن السلوك المطلوب من اللجان الدائمة في النسيج المضيف.

ويتمثل التحدي الرئيسي في التغلب عليها في تنفيذ ثقافة مع اللجان الدائمة في تجديد العظام هو لتأمين التصاق الخلايا على مادة بيولوجية محددة، الذي يعرض عموما بنية مسامية مع adistribution المسام تتراوح بين ميكرومتر إلى ملليمترات وقد استخدمت ولكن في كثير من الأحيان تتطلب الكواشف المتطورة والمعدات والإجراءات التي تغير سلوك الخلايا. هذه الإجراءات هي مناسبة لتقدير في المختبر، ولكن ليس لاستقراء وتنفيذها في النظم المفتوحة المعقدة، مثل الإنسان أو في المقايسات الجسم الحي. التقنيات التي تركز على ضمان التصاق الخلية إلى تصاميم عشوائية، مثل مواد مسامية العظام، وقد تم دراسة من قبل التصاق المواد إلى قاع الآبار الثقافة والكولاجين والبوليمرات الاغاروز المستخدمة. لهذه الأساليب، تم الإبقاء على الخلايا التي تم المصنفة على السطح في المسام وعلى السطح العلوي. ومع ذلك، لا يمكن ضمان هذا الجانب في في الجسم الحيالنظام، الذي سوائل الجسم المحيطة مادة بيولوجية يمكن سحب الخلايا من موقع المطلوب على السقالات المسامية هو استخدام التحفيز بالموجات فوق الصوتية، الأمر الذي يتطلب معدات متطورة ولكن يشجع على التعبير عن علامات بانيات العظم في فحوصات في المختبر 5. استخدام الثقافات مستمرة تتطلب المفاعلات الحيوية، والتي تضمن توزيع متجانس من المواد الغذائية في مستنبت. ومع ذلك، يتم فقدان نسبة كبيرة من الخلايا المستزرعة عند استبدال مستنبت نظرا لمعدل التدفق التي تستخدم في هذه التقنية والتمسك المتوسط ​​على الجدران للمعدات. هذه القضايا تزيد من الكتلة الخلوية ما هو ضروري لهذا النوع من الثقافة والوقت للحصول على عدد كاف من خلايا 7. وهكذا، فإن المنهجية المقدمة في هذا العمل تمثل تقنية التي ينبغي استقراء لفي الجسم الحي النظم لأن المصنف الخلايا في كتلة متناهية الصغر على المواد السطحية العليا، وبعد appropriأكل مرات الحضانة، والتزمت 60٪ من كتلة الخلوية الأولية. وعلاوة على ذلك، لا يتطلب هذا الأسلوب إضافة المحاثات بانيات العظم (على سبيل المثال، ديكساميثازون، وحمض الأسكوربيك، أو بيتا سكرولي) أو المحفزات بالموجات فوق الصوتية للحث على تمايز بانيات العظم وصيانة النمط الظاهري العظمية بسبب NKB هو عظمي والسقالات osteoinductive 8، طريقة للثقافة اللجان الدائمة من الغشاء الذي يحيط بالجنين البشري (AM-hMSCs) على مادة بيولوجية العظام macroporous الواردة في هذا representsapossibility العمل على إدراج الخلايا في أنسجة العظام التالفة ولحث على تمايز لنسب بانية للعظم.

البروتوكول

تم إجراء هذا البحث وفقا للإعلان الرابطة الطبية العالمية هلسنكي بشأن السلوك الأخلاقي للبحوث التي تجرى على البشر وتمت الموافقة من قبل مجلس أخلاقيات البحوث في كلية الحقوق دي لطب، UNAM (مشروع رقم 101-2012).

1. عزل الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان

  1. إعداد كاشف
    1. يعد حل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) والملحق مع 1٪ محلول مضاد فطري للمضادات الحيوية.
    2. إعداد Dulbecco لتعديل متوسطة النسر، ارتفاع نسبة الجلوكوز (HG-DMEM)، وإضافة 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ للمضادات الحيوية مضاد فطري solution.Sterilize هذه الوسيلة الثقافة عن طريق الترشيح من خلال 0.2 ميكرون التصفية.
    3. يعد حل كولاجيناز الثاني في 100 U / مل في HG-DMEM بدون FBS أو حل للمضادات الحيوية مضاد فطري.
    4. تعقيم الأدوات الجراحية التالية، والتي هي بحاجة للعزلة، عن طريق التعقيم: مقص القياسيةالصورة، ملقط تشريح بسيطة، ودفع غرامة نقطة وملقط مسننة ومقبض مشرط (# 4).
  2. عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من الغشاء الذي يحيط بالجنين البشري
    1. عقد الحبل السري مع يد واحدة ومع جهة أخرى، فصل الغشاء الذي يحيط بالجنين (AM)، الذي يبدو وكأنه ورقة شفافة، للحصول على جزء من ما يقرب من 5 سم 2. إذا كان المقطع المشيمه موجود في العينة، فصل المشيمه الكامنة عن طريق تشريح اليدوي كما قسم المشيمه هو أكثر سمكا من السلى.
    2. إزالة الدم المتبقي مع ثلاثة يغسل من 5 مل من برنامج تلفزيوني وإزالة جلطات مع ملقط بسيطة. جعل قطع صغير في AM مع مشرط لتوليد شظايا من حوالي 0.5 سم 2.
  3. الهضم الأنزيمي من الغشاء الذي يحيط بالجنين
    1. احتضان AM مع 5 مل من 0.125٪ التربسين / 0.5 ملي EDTA الحل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي. الطرد المركزي في 250x ج و 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم إزالة الحل التربسين بواسطة التخلص من طاف.
    2. إضافة 15 مل من نوع كولاجيناز II الحل واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 جو مع اهتزاز بعض الأحيان وفقا ليفا وآخرون. 9
    3. مباشرة بعد الهضم مع كولاجيناز II، إضافة 15 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج و 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    4. تجاهل طاف ويغسل بيليه الخليوي مع 15 مل من PBS الحل وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج و 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تجاهل طاف.
    5. resuspend الكرية الخلوي في 10 مل من HG-DMEM عن طريق هز بلطف.
  4. توسيع الخلايا الجذعية الوسيطة
    1. البذور 2 مل من تعليق خلية (1 × 10 4 خلية / سم 2) في قارورة الثقافة، وإضافة 2 مل من HG-DMEM واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي. القضاء على الخلايا غير ملتصقة عن طريق تغيير ثقافة المتوسط ​​بعد 5-7أيام.
    2. بعد هذا الوقت، وتغيير ثقافة المتوسط ​​كل 3 أيام للحصول على 7-10 أيام إضافية للحصول على التقاء الخلوي من 90٪.
    3. استرداد الخلايا واحتضان لهم لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 جو مع 0.125٪ محلول التربسين / EDTA (trypsinization).
    4. مباشرة بعد trypsinization، وجمع الخلايا مع ماصة ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل والطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق.
    5. تجاهل طاف و resuspend بيليه الخلوي في 10 مل من HG-DMEM.
    6. تعليق زراعة الخلايا في اثنين من 75 سم 2 قوارير ثقافة (5 مل في كل قارورة)، والحفاظ على الثقافة حتى 90٪ التقاء.
    7. كرر الخطوات من 1.4.3. إلى 1.4.6، حتى مرور 9 أو ثقافة فرعية.
    8. استعادة الخلايا عن طريق trypsinization كما في الخطوات 1.4.3 إلى 1.4.5 لالتدفق الخلوي أو غيرها من الدراسات.

2. إعداد مصفوفة العظام المسامية القرص (NKB)

  1. الرطب الأقراص NKB (قطر، 12 مم؛ سمك، 2 مم).، واحتضان كل قرص بين عشية وضحاها مع 3 مل من HG-DMEM بدون FBS في جو مرطب من CO 2 5٪ عند 37 درجة مئوية، وفقا لFassina آخرون 5
  2. بعد عملية التبول، ضع القرص في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وتدور في 250 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة الزائد مستنبت. ضع القرص في 24 لوحة جيدا ثقافة الخلية.
    1. إضافة 500 ميكرولتر من HG-DMEM واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 25 درجة مئوية. ضمان عدم وجود فقاعات موجودة على القرص NKB لصالح التوزيع الصحيح من العناصر الغذائية والخلايا.
    2. إذا لوحظ الفقاعات على القرص، ويهز وإضافة 300 ميكرولتر من مستنبت واحتضان لمدة 15 دقيقة في جو مرطب من CO 2 5٪ عند 37 درجة مئوية. بعد هذا الوقت إزالة 300 ميكرولتر من مستنبت مص من خلال جدار خلية ثقافة جيدا وتأكد من عدم وجود فقاعات النموذج.
  3. ضع القرص في الجديدة 24 لوحة جيدا باستخدام ملقط بسيطة.

= "jove_title"> 3. ثقافة الوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية على المسامية الأبقار مصفوفة

  1. البذور تعليق الخلوي (5 × 5 10 AM-hMSCs في 100 ميكرولتر من HG-DMEM) من ثلاث ثقافات فرعية، على سطح القرص مادة بيولوجية المبللة قبل واحتضان لمدة 30 دقيقة في جو مرطب من CO 2 5٪ في 37 ° C. تنفيذ هذه الخطوة ببطء وبشكل مستمر على الوجه العلوي للمادة بيولوجية للسماح للخلايا للتفاعل مع تضاريس جميع سقالة. ملاحظة: هذا الإجراء يحقق 60٪ من الخلايا تعلق على مادة بيولوجية هو مبين في الجدول 1.
  2. إضافة 1.5 مل من HG-DMEM عند 37 درجة مئوية، والحفاظ على الثقافة لمدة 3 أيام في جو مرطب من CO 2 5٪ عند 37 درجة مئوية. لا تولد الاضطراب في إضافة مستنبت لتجنب أن ترسب الخلايا على الجزء السفلي من لوحة الثقافة الطبق. هذه هي المرة الأولي.

4. خلية علامات سطح توصيف بواسطة التدفق Cytometry

  1. فصل الخلايا من 9 تشرين ثقافة فرعية قبل البذر لهم على القرص المصفوفة. استخدام 0.25٪ التربسين / 1 ملم EDTA واصلاحها لمدة 30 دقيقة في الجليد الباردة 2٪ الفورمالديهايد. بعد التثبيت، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 0.05٪.
  2. منع غير محددة وملزمة من قبل احتضان الخلايا مع الغلوبولين المناعي البشري 20٪ لمدة 3 دقائق على الجليد واحتضان 0.1 × 10 6 خلية مأخوذة مع فيكوإيريترين (PerCP) -conjugated ماب ضد CD73، FITC مترافق ماب CD90،-PE مترافق ماب ضد CD34 ، FITC مترافق ماب CD45 وPE-مترافق ماب CD105 لمدة 1 ساعة عند 25 درجة مئوية في الظلام. مطابقة نمط إسوي FITC مترافق MAB، سوف PE-مترافق ماب andPerCP مترافق ماب خدمة الضوابط سلبية.
  3. حساب مستويات التعبير من علامات سطح باستخدام أي برنامج للحصول على البيانات وتحليلها.

5. خلية كشف التصاق بواسطة المجهر الإلكتروني

  1. شطف عينات خلايا القرص في 3 أيام الثقافة مرتين مع PBSوfixthe العينات مع 4٪ (ت / ت) غلوتارالدهيد solutionin 0.1 M عازلة نا-كاكوديلات (درجة الحموضة 7.2).
  2. تحضير العينات للمراقبة مجهرية، كما ذكرت سابقا من قبل ريفيرا-N وآخرون. (10) ومراقبة باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح في الجهد الكهربائي من 15 كيلو فولت وفي التكبير من 500X و2000X.

6. خلية انتشار الفحص

  1. لعينات الخلايا القرص الذي يحتوي 1.5 مل من مستنبت، إضافة 150 ميكرولتر من تلوين حيوي (AB) وفقا لمبادئ توجيهية الصانع واحتضان الخلايا في جو مرطب من CO 2 5٪ عند 37 درجة مئوية.
  2. على الفور بعد إضافة AB (0 ساعة) وكل 24 ساعة حتى وصلت 7 أيام من زراعة الخلايا، وقياس الامتصاصية في 570 نانومتر مع طول موجة إشارة من 600 نانومتر.

7. وحدة تشكيل مستعمرة (كفو) 11

  1. الثقافة 100 خلية لكل 100 ملم زراعة الأنسجة ديسكين HG-DMEM واحتضان لمدة 14أيام في جو مرطب من CO 2 5٪ عند 37 درجة مئوية.
  2. غسل الثقافة مع PBS وصمة عار مع 0.5٪ الكريستال البنفسجي في الميثانول لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. تغسل الصحون مع PBS مرتين والاعتماد على المستعمرات مرئية باستخدام عدادة الكريات.

النتائج

الوسيطة الإنسان العزلة الخلايا الجذعية

بعد الفصل الميكانيكي للAM من المشيماء باستخدام تشريح حادة (الشكل 1)، وقد حصلت على السكان الخلية ملتصقة بواسطة التربسين وكولاجيناز II الهضم. هؤلاء السكان خلية تعلق في صحن الثقافة سيقدم العرض تشبه الخلايا الليفية مورفولوجيا الخلايا في مرحلة ما بعد 3 أيام العزلة كما هو مبين في صورة مجهرية ضوئية (الشكل 2A) وصورة مجهرية الإلكترون المسح الضوئي (الشكل 2B). ومشيمة المستخدمة في هذا العمل تم الحصول عليها من الأمهات المانحة صحية أبلغ withprevious الموافقة.

توصيف الخلية عن طريق التدفق الخلوي

كان عدد السكان الخلية التي تم الحصول عليها من AM رد الفعل بقوة إلى CD90 علامات الوسيطة سطح + (93.5٪ ± 6.85) وCD73 + وCD105 + (79٪ ± 3.46) وأظهر رد فعل سلبي على علامات المكونة للدم مثل CD34- وCD45. وهكذا،كانت AM-hMSCs المستخدمة في هذا العمل الوسيطة، في المعلومات accordancewith ذكر سابقا من قبل ليفا وآخرون. (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك، هذه النتيجة تتزامن مع خصائص نمط ظاهري مناعي التي تم تأسيسها من قبل الجمعية الدولية للعلاج الخلوي (ISCT) للخلايا الجذعية الوسيطة.

التصاق الخلايا على مصفوفة العظام

وتظهر الميكروسكوب الضوئي سلوك AM-hMSCs سبعة أيام بعد طبقات على NKB. وتمت تغطية سطح مادة بيولوجية مع الخلايا كروية (يوم واحد)، وبعض الخلايا نشر تعلق على ما يبدو على سطح مصفوفة البقري في اليوم السابع. في أعلى التكبير، ظهرت الخلايا تنتشر لتكون على اتصال وثيق عبر عمليات filipodial (فلوريدا) (الشكل 4).

انتشار الخلايا على مصفوفة العظام

وأظهرت نتائج الفحص AB انخفاض طفيف في الامتصاصية النسبي ش شمعة في المتر المربع (RAU) من الأبقار حالة المصفوفة (+ مصفوفة العظام) بعد 1 يوم من الحضانة ومن ثم في اليوم الخامس، وجود سقالة يستحث زيادة في تكاثر الخلايا ذات دلالة إحصائية في مقارنة مع الثقافة التي تؤدى في غياب البقري مصفوفة (العظم المصفوفة) (الشكل 5).

وحدة تشكيل مستعمرة

وCFU هو فحص تقليديا للخلايا الجذعية. وAM-hMSCs معزولة في هذا العمل الحفاظ قدرتها على تشكيل المستعمرات المنفصلة في 14 يوما في الثقافة.

figure-results-1
الشكل 1: عزل الغشاء الذي يحيط بالجنين. (A) الحبل السري (UC) يعقد مع يدا واحدة لتحديد المنطقة التي يتم الحصول الغشاء الذي يحيط بالجنين. (ب) الغشاء الذي يحيط بالجنين (AM) يشبه فيلم شفافة دون innervations الدم.

ve_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> figure-results-2
الشكل 2: الخصائص المورفولوجية للخلايا الجذعية من الغشاء الذي يحيط بالجنين البشري لوحظت الثقافات AM-hMSC في 3 أيام بعد العزلة باستخدام المجهر الضوئي وأظهرت التشكل تشبه الخلايا الليفية.

figure-results-3
الرقم 3: التدفق الخلوي توصيف وكانت الخلايا من الغشاء الذي يحيط بالجنين البشري خلايا معظمهم الوسيطة لأنها كانت إيجابية للعلامات الوسيطة (CD73، CD90، CD105)، كما يتضح من الرسم البياني تشريد للحق، والسلبية للعلامات المكونة للدم (CD34 وCD45)، وهو ما أكدته تشريد الرسم البياني إلى اليسار. وتظهر المستضدات في رسوم بيانية الحمراء، في حين أن السيطرة على isotypesfor PE وFITC fluorochromes لوحظ فيأسود.

figure-results-4
الشكل 4:.. التصاق الخلية على الأبقار مصفوفة العظام سلسلة من الصور تظهر SEM مرفق من الخلايا لمسام مادة بيولوجية (A) رؤية بانورامية من المسام NKB مع عدة خلايا انضمت إلى مادة بيولوجية في ولاية كروية (CS) و بالارض (CF) على سطح مادة بيولوجية، هو أيضا ممكن أن نقدر العظام ثغرة تشير باسم (لاك) في ثلاثة أيام الثقافة على مصفوفة الأبقار. (B) التضخيم من الخلية في عملية التكيف على سطح المواد من خلال التوقعات filipodial (C) التفاعل بين خليتين الالتزام وسويت بالأرض على مصفوفة البقري (C1، خلية 1؛ وC2، خلية 2). يرجى النقر هنا لضدiew نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
تم تقييم انتشار الخلايا على البقري العظام مصفوفة تكاثر الخلايا التي كتبها تخفيض AB وأعرب في وحدات الامتصاصية النسبية على طول 7 أيام من زراعة: الرقم 5. وأظهرت النتائج تأثير مصفوفة العظام (+ مصفوفة العظام) في AM-hMSCs انتشار الذي كان مختلفا بشكل ثابت في المقارنة مع الحالة السلبية (العظم المصفوفة). (* P <0.05)

figure-results-6
الشكل 6: كفو الفحص من اللجان الدائمة مطلي مبدئيا كثافة متفاوتة وحضنت لمدة 14 يوما (يعني * / - SD، ن = 10).

خلايا التقيد التصاق الخلية (٪)
الخلايا على القاع 187667 ± 1208 62.47
خلايا على منصة الاعدام 312333 ± 1208 37.53

الجدول 1: كفاءة التصاق على مصفوفة الأبقار وخلايا انضمت إلى قاع الطبق لوحة والخلايا التمسك على منصة الاعدام احصي بواسطة عدادة الكريات بعد أن تعافى من قبل trypsinization.The البيانات الواردة في الجدول تتوافق مع اثنين من التجربة مستقلة لثلاث نسخ ± الانحراف المعياري

المناقشة

وأظهرت الخلايا الجذعية التي تم الحصول عليها من الغشاء الذي يحيط بالجنين البشري (الشكل 1) مورفولوجيا تشبه الخلايا الليفية، على غرار خلايا اللحمة المتوسطة (الشكل 2)، وكانت أساسا اللجان الدائمة. وبالإضافة إلى ذلك، كشف التدفق الخلوي المقايسات أن هذه الخلايا كانت إيجابية للعلامات خلية الوسيطة (CD73، CD90، وCD105) والسلبية للعلامات النسب المكونة للدم (CD34، CD45) (الشكل 3). أيضا، وAM-hMSCs معزولة في هذا العمل الحالي القدرة على تشكيل CFUs (الشكل 6). وبالمثل، فإن الخلايا الجذعية الوسيطة معزولة في هذا النموذج احتفظت القدرة على نعلق على osteoinductor مادة بيولوجية (الشكل 4)، وتتكاثر على منصة الاعدام (الشكل 5).

لهذه الأسباب، فإن الطريقة ثقافة AM-hMSCs على macroporous مادة بيولوجية العظام التي تم استخدامها في هذا العمل يمثل فرصة لإدراج الخلايا داخل الأنسجة والعظام المصابين وحمل اح لهاntiation إلى النسب بانية للعظم. لا يتطلب هذا النظام الثقافة إضافة المحاثات عظمية للحفاظ على عملية التمايز النمط الظاهري بناء العظم وبانيات العظم بسبب NKB هو مادة عظمي andosteoinductive 8. استخدام الأنسجة النفايات، مثل المشيمة البشرية، يمثل بديلا بسيطا والأخلاقي للوصول إلى السكان من الخلايا الجذعية مع القدرة على التمايز إلى اللجان الدائمة، بالمقارنة مع المصادر الأخرى التي تنطوي على كثير من الأحيان أساليب الغازية أو العائد خلية منخفضة.

طريقة الثقافة المقترح يمكن استقراء لفي الجسم الحي النظم لأن المصنف الخلايا في كتلة متناهية الصغر على المواد السطحية العليا، والخلايا استعمار والتمسك سطح مادة بيولوجية كامل بعد العصر الحضانة المناسبة. وعلاوة على ذلك، ليس مطلوبا من الكواشف المتطورة والمعدات والإجراءات، على عكس الطرق القائمة عند تنفيذ هذه التقنية هي cultureas-الشامل الصغرى كذلكترسب بطيء وثابت من قسامة الخلوية على المواد للتأكد من أن الخلايا تتفاعل بشكل تفضيلي مع بيولوجية، وليس مع الجزء السفلي من لوحة. نقطة حرجة أخرى هي استخدام المواد المبللة مسبقا قبل زراعة الخلايا، وهذا يضمن أن الخلايا سيكون لها العناصر الغذائية الضرورية من مستنبت عندما يتم دمجها في المواد بغض النظر إذا كانوا على السطح أو داخل المسام. وأخيرا، فإن استخدام وسيلة بيولوجية osteoinductive أمر بالغ الأهمية لهذه العملية لأنه يتجنب بالإضافة للعوامل الخارجية للحث والحفاظ على بانيات العظم التمايز. الحد من هذه التقنية هو أنه يقوم على إمكانات osteoinductive من المصفوفة الأبقار. ومع ذلك، فإن نظام الثقافة المقترحة يمكن استقراء إلى أي مادة مسامية مع توزيع المسام بين 20 إلى 200 ميكرومتر. ولذلك، فإن الإجراء المعروضة في هذا العمل هو طريقة بديلة لزراعة الخلايا الجذعية الوسيطة في مختلف المواد رويعمل قبعة للهندسة الأنسجة، وخاصة بالنسبة للتجديد العظام.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

ونحن نعترف المنح الدراسية والدعم المالي المقدم من المجلس الوطني لCiencia بحوث والتكنولوجيا (CONACYT No.49887)، كلية الحقوق دي لطب-UNAM DGAPA IN201510 وDGAPA IN216213. سلفادور كوريا من المعهد الوطني للPerinatología للمساعدة مع المواد البيولوجية؛ وBiocriss، SA دي C. V للتبرع Nukbone. نشكر أيضا إلى ING. هيكتور مارتينيز من IIM، UNAM وM EN C فابيولا جونزاليس من CINVESTAV للحصول على المساعدة الفنية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الفوسفات المعقم المخزن الملحيجيبكو ، تقنيات الحياةزراعة الخلايا
البنسلين - ستربتومايسينجيبكو ، تقنيات الحياةزراعة الخلايا
FBSجيبكو ، تقنيات الحياةزراعة الخلايا
وسط النسر المعدل من دولبكو (DMEM) مع نسبة عالية من الجلوكوزجيبكو ، تقنيات الحياة11965118كولاجيناز زراعة الخلايا
من النوع الثانيجيبكو ، تقنيات الحياةزراعة الخلايا
3 ملي كلوريد الكالسيومSIGMA_ALDRICHC5670زراعة الخلايا
التربسين / 0.5 ملي مولار حل EDTAجيبكو ، تقنيات الحياةزراعة الخلايا
محلول تريبان الأزرقجيبكو ، تقنيات الحياةزراعة الخلايا
فيكوريثرين (PerCP) - مترافق CD73BD Pharmigen562245السيتومرية
FITC- CD90 ،BD Pharmigen562245الخلوية
PE-CD34BD Pharmigen562245خلوية
FITC-CD45BD Pharmigen562245السيتومرية
PE-CD105BD Pharmigen562245العصارة الخلوية
BD FACSCalibur Flow CellularBD PharmigenBD FACSكليبورخلوية
alamarBlue (AB)LIFE TECHNOLOGIESDAL1025مقايسة خلايا الانتشار
SUNRISE-readerTECAN ، ألمانيافحص خلايا انتشارشروق الشمس
10010023 10378016 26140111 17101015 R001100 15250061

المراجع

  1. Alviano, F., et al. Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro. BMC Developmental Biology. 7, 1-14 (2007).
  2. Anker, P. S., et al. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta. Stem Cells. 22 (4), 1338-1345 (2004).
  3. Seebach, C., Schultheiss, J., Wilhelm, K., Frank, J., Henrich, D. Comparison of six bone-graft substitutes regarding to cell seeding efficiency, metabolism and growth behaviour of human mesenchymal stem cells (MSC) in vitro. Int J Care Injured. 41, 731-738 (2010).
  4. Meseguer-Olmo, L. J., et al. In vitro growth kinematics of human osteoblasts on porous hydroxyapatite ceramics. Rev. Ortop. Traumatol. 50, 224-232 (2006).
  5. Fassina, L., et al. Low-power ultrasound as a tool to culture human osteoblasts inside cancellous hydroxyapatite. Bioinorganic Chemistry and Applications. 2010, 1-8 (2010).
  6. Fassina, L., et al. Ultrasonic and Electromagnetic Enhancement of a Culture of Human SAOS-2 Osteoblasts Seeded onto a Titanium Plasma-Spray Surface. Tissue Engineering Part C: Methods. 15, 233-242 (2009).
  7. Gomes, M. E., Holtorf, H. L., Reis, R. L., Mikos, A. G. Influence of the porosity of starch-based fiber mesh scaffolds on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells cultured in a flow perfusion bioreactor. Tissue Eng. 12, 801-809 (2006).
  8. Rodriguez-Fuentes, N., et al. Nukbone(R) promotes proliferation and osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells from human amniotic membrane. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434, 676-680 (2013).
  9. Leyva-Leyva, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cell subpopulations from human amniotic membrane with dissimilar osteoblastic potential. Stem Cells and Development. 22, 1275-1287 (2013).
  10. Rivera, N., et al. Blackwater fever like in murine malaria. Parasitology Research. 112, 1021-1029 (2013).
  11. Pochsmpally, R. Colony Forming Units Assays for MSCs. Mesenchymal Stem Cells. Methods and Protocols. Procko, D. J., Phinney, D. G., Bunnell, B. A. , Humana Press. New York, NY. (2008).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

غشاء أمينوسي بشريمصفوفة عظمية بقريةعزل الخلايازراعة الأنسجةقياس التدفق الخلويوحدات تشكيل المستعمراتالمجهر الإلكتروني الماسحالمجهر الضوئيتكاثر الخلايا
عزل الوسيطة الإنسان الخلايا الجذعية وزراعتها على المسامية مصفوفة العظام
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.