توضح هذه المقالة منهجية مفصلة للتمييز كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في العضلية عن طريق تحوير انتقائي مسار WNT، تليها تحليل التدفق الخلوي من علامات مرجعية لتقييم تجانس وهوية السكان.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التمايز كفاءة عالية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان لالعضلية وتوصيف بواسطة التدفق الخلوي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هناك حاجة ملحة لوضع نهج للإصلاح القلب التالفة، واكتشاف العقاقير العلاجية الجديدة التي ليس لها آثار سامة على القلب، وتحسين استراتيجيات لنموذج بدقة أمراض القلب. لا تزال إمكانية استغلال الإنسان الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) التكنولوجيا لتوليد عضلة القلب "في طبق" لهذه التطبيقات لتوليد حماسة عالية. في السنوات الأخيرة، والقدرة على توليد خلايا بكفاءة cardiomyogenic من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) قد تحسنت كثيرا، وتقدم لنا فرصا جديدة لنموذج المراحل المبكرة جدا من التنمية البشرية القلب لا يمكن الوصول إليها على خلاف ذلك. على النقيض من العديد من الطرق السابقة، وصفت بروتوكول التمايز cardiomyocyte هنا لا يتطلب تجميع خلية أو إضافة Activin A أو BMP4 ويولد بقوة الثقافات من الخلايا التي هي ايجابية للغاية لتروبونين القلب الأول وT (TNNI3، TNNT2)، iroquois- بروتين الدرجة homeodomainIRX-4 (IRX4)، ميوسين التنظيمية سلسلة ضوء 2، شكل الإسوي البطين / عضلة القلب (MLC2v) والميوسين التنظيمية سلسلة ضوء 2، شكل الإسوي الأذيني (MLC2a) بعد يوم 10 في جميع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) وخطوط hiPSC اختبار ل التاريخ. خلايا يمكن passaged ويحتفظ به لأكثر من 90 يوما في الثقافة. استراتيجية بسيطة من الناحية الفنية لتنفيذ وفعالة من حيث التكلفة. توصيف العضلية المستمدة من الخلايا المحفزة غالبا ما تتضمن تحليل علامات مرجعية، سواء على مستوى مرنا والبروتين. لتحليل البروتين، والتدفق الخلوي هو أداة تحليلية قوية لتقييم نوعية الخلايا في الثقافة وتحديد الفئات السكانية التجانس. ومع ذلك، والتباين الفني في إعداد العينات يمكن أن تؤثر بشكل كبير نوعية التدفق الخلوي البيانات. وبالتالي، يجب توحيد بروتوكولات تلطيخ تسهيل المقارنات بين استراتيجيات التمايز المختلفة. وفقا لذلك، بروتوكولات تلطيخ الأمثل لتحليل IRX4، MLC2v، MLC2a، TNNI3، وTNNT2 التدفق الخلوي موصوفة.
المقدمة
توليد العضلية من hPSCs، بما في ذلك HESC وhiPSC، يمكن أن تعمل لتكون نموذجا في المختبر من العمليات التنموية القلب الإنسان في وقت مبكر جدا، وتوفير نظرة ثاقبة مراحل لا يمكن الوصول إليها إلا للدراسات الميكانيكية. ويوفر هذا النظام نموذجا فرصا فريدة لدراسة المسارات الجزيئية التي تتحكم في التزام النسب القلب ومواصفات مصير الخلية. في السنوات الأخيرة، والقدرة على توليد خلايا cardiomyogenic بكفاءة من hPSCs قد تحسنت كثيرا 1-15. ومع ذلك، من بين البروتوكولات هناك خط الخلية الاختلاف فيما يتعلق الكفاءة في توليد خلايا cardiomyogenic والتوقيت في الخلايا التي تبدي علامات غرفة محددة (على سبيل المثال، البطين والأذين). من....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الحل وإعداد وسائل الإعلام
- HESC مصفوفة المؤهلين طلاء محلول المخزون
- ذوبان الجليد ببطء HESC مصفوفة المؤهلة (5 مل) على الجليد في 4 درجة مئوية خلال الليل. الاستغناء مأخوذة إلى ما قبل المبردة، 1.5 مل العقيمة أنابيب microcentrifuge وتخزينها مباشرة في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: تختلف حجم قسامة استنادا الكثير وعادة ما يتراوح 270-350 ميكرولتر. توفر الشركة المصنعة التفاصيل بشأن حجم قسامة المطلوبة لتحقيق تركيز 1X على التخفيف إلى 25 مل كما هو موضح في الخطوة....
- ذوبان الجليد ببطء HESC مصفوفة المؤهلة (5 مل) على الجليد في 4 درجة مئوية خلال الليل. الاستغناء مأخوذة إلى ما قبل المبردة، 1.5 مل العقيمة أنابيب microcentrifuge وتخزينها مباشرة في -20 درجة مئوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في اليوم 0، والخلايا هي 100٪ متموجة مع التشكل المدمجة والحد الأدنى من الحطام الخلية. في أيام 1-2، ومن الشائع أن نلاحظ موت الخلايا كبير (40-50٪)، ولكن سوف تحتفظ مورفولوجيا الخلايا المرفقة المضغوط (الشكل 1A). خلال هذا الوقت، وسائل الاعلام هو البرتقال وعكر. وسائل الإعلام وردي يشير موت الخلايا المفرط، وفي هذه الحالة، تأكيد مع الأزرق التريبان والتوقف إذا تجاوز موت الخلايا 70٪. خلايا سيتعافى خلال أيام 3-4 وسيزيد كثافة. خلال أيام 5-6، يحدث الحد الأدنى من موت الخلايا وبقع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
حاسمة لنجاح بروتوكول التمايز هو استخدام نوعية عالية من الثقافات hPSCs التي تم passaged على مستوى خلية واحدة على الأقل لمدة خمس فقرات قبل بداية التمايز. ويلاحظ كفاءات مماثلة التمايز بشكل روتيني بين مختلف خطوط hPSC إذا كانت 100٪ متكدسة في بداية التمايز ومستقلة من خط الخلية. ويلاحظ كفاءة الأمثل إذا التقاء الخلايا في بداية التمايز هو ≤95٪ أو> 100٪. ولذلك، ينبغي أن يكون الأمثل كثافة البذر وتوقيت الركض بعناية لكل خط لتحقيق 100٪ الطبقات الوحيدة متكدسة في بداية التمايز. في هذا الصدد، و.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة 4R00HL094708-03، لجنة جائزة كلية جديد MCW شؤون البحث العلمي، ومؤسسة كيرن (أموال بدء التشغيل) في كلية الطب في ويسكونسن (RLG). مجلس المنح البحثية لذو فكرة هونغ كونغ خطة البحوث T13-706 / 11 (KRB). U01 HL099776، CIRM TR3-05556، CIRM DR2A-05394، وAHA تأسست جائزة الباحث (JCW). AHA زمالة ما بعد الدكتوراه 12POST12050254 (برنامج العمل والميزانية). نشكر الأمل كامبل في التدفق الخلوي الأساسية من معهد أبحاث الدم ويسكونسن للمساعدة في جمع البيانات ومراجعة متأنية للمخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم
الشركة
رقم فهرسي
التعليقات
محلول < td colspan = "4" > المواد < / قوي > الخلوي السائبة < td colspan = "4" ><قوي > أجسام مضادة وضوابط النمط المتماثل < / قوي > ماوس في النمط المتماثل < td colspan = "4" >< strong>TaqMan Probesets ل qRT-PCR< / strongLife
| <قوي>ثقافة الخلية< / strong> | |||
|---|---|---|---|
| BD Matrigel ، مصفوفة مؤهلة من hESC | BD Biosciences | 354277 | |
| محلول انفصال خلايا Accutase | تقنيات الخلايا الجذعية | 7920 | |
| ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيوم | تقنيات الحياة | 14190-136 | |
| ثنائي سلفوكسيد الميثيل (DMSO ، Hybri-Max ، معقم مفلتر) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| بيكربونات الصوديوم | Sigma Aldrich | 53817 | |
| حامض الستريك | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 مثبط ثنائي هيدروكلوريد p160ROCK الانتقائي | R & D Systems | 1254 | |
| L-Ascorbic acid-2-phosphate sesqui المغنيسيوم ملح هيدرات | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| سيلينيت الصوديوم | Sigma Aldrich | S5261-10G | |
| Transferrin (Optiferrin & ndash; محدد ، خال من ، مؤتلف للإنسان) | Invitria | 777TRF029 | |
| عامل نمو الخلايا الليفية 2 (FGF2) | R & D Systems | 4144-TC-01M | |
| تحويل عامل النمو beta 1 (TGF & beta ؛ 1) | Peprotech | 100-21 | |
| DMEM / F12 مع L-Glutamine و 15 mM HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
| الأنسولين | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| RPMI 1640 مع L-Glutamine | Life Technologies | 11875-093 | |
| مكمل B-27 مطروحا منه تقنيات الأنسولين | A1895601 | ||
| B-27 (مع الأنسولين) | Life Technologies | 17504-044 | |
| مصل الجنين | الأبقار Life Technologies | 10437 | |
| Flow Cytometry Recodes< / قوي > | |||
| فوسفات ملحي مخزن (10x) | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| محلول الملح المتوازن من هانك بدون Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup> | Life Technologies | 14175-095 | |
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Phosflow perm buffer III | BD Biosciences | 558050 | |
| 16٪ Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28906 | |
| الميثانول | سيجما ألدريتش | 179957-4L | |
| الأسيتون | Mallenckrodt للكيماويات | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| مصل الماعز | تقنيات الحياة | 16210-064 | |
| محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪ | Life Technologies | 15250-061 | |
| 5 مل أنبوب بوليسترين دائري القاع (بدون غطاء) Corning | 352008 | لإعداد خلايا لقياس التدفق الخلوي | |
| 5 مل أنبوب البوليسترين القاع المستدير (مع 35 & micro; غطاء مصفاة الخلية M) | كورنينج | 352235 | لتحضير الخلايا لقياس التدفق |
| 2 مل لمبات مطاطية | فيشر ساينتيك | 03-448-24 | |
| 9 "زجاج البورسليكات غير الموصل ماصات باستور | بيو إكسبريس | P-2904-2 | |
| 0.65 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، متخرجة ، خضراء | GeneMate | C-3259-G | |
| 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، متخرجة ، أحمر | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 عداد الخلايا الآلي | BioRad | 145-0102 | |
| شرائح العد ل TC20 | BioRad | 145-0011 | |
| 6 آبار لوحة معالجة بثقافة الأنسجة المسطحة | 353046 | 20 | |
| مل محاقن | BD Plastipak | 300613 | لتعقيم الفلتر من aliquots |
| مرشحات حقنة معقمة ، 0.2 & ميكرو ؛ م بولي إيثر سلفون | VWR | 28145-501 | لتعقيم المرشح من aliquots |
| 250 مل نظام الترشيح ، 0.22 & micro ؛ م بولي إيثر سلفون ، تعقيم ، 431096 كورنينج منخفض الربط | لتعقيم المرشح للوسائط السائبة ؛ | ||
| نظام تصفية 500 مل ، 0.22 وميكرو ؛ م بولي إيثرسلفون ، تعقيم ، منخفض | الارتباط 431097 كورنينج | لتعقيم المرشح للوسائط | |
| مضاد ل TNNI3 (استنساخ: 284 (19C7)) Abcam | ab19615 | الجسم المضاد الأساسي | |
| Anti-TNNT2 (استنساخ: 1C11) Thermo | Scientific | MA1-16687 | الجسم المضاد الأساسي |
| المضاد ل MYL2 (MLC2v ، استنساخ: 330G5) | أنظمة متشابكة | 310111 | الأجسام المضادة الأولية |
| المضادة ل MYL7 (MLC2a ، الاستنساخ: 4E7) | Abcam | AB131661 | الجسم المضاد الأساسي |
| المضاد IRX4 ؛ | Bioss | BS-9464R | الجسم المضاد الأساسي |
| Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للفأر IgG1 ؛ | Life Technologies | A21121 | الجسم المضاد الثانوي |
| Alexa Fluor 647 الماعز المضاد للفأر IgG2a | Life Technologies | A21241 | الجسم المضاد الثانوي |
| Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للفأر IgG2b | Life Technologies | A21141 | الجسم المضاد الثانوي |
| Phycoerythrin(PE) الماعز المضاد للأرانب IgG | R & D Systems | F0110 | الأجسام المضادة الثانوية |
| الفأر IgG1 | BD Biosciences | 557273 | التحكم في النمط المتنظير |
| IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | التحكم في النمط المتشابه |
| الأرنب IgG-PE | R & D Systems | IC105P | التحكم |
| >ACTB | Life Technologies | Hs01060665 | |
| Brachyury T | Life Technologies | Hs00610080 | |
| CASQ2 | Life Technologies | Hs00154286 | |
| IRX4 | Life Technologies | Hs01100809 | |
| ISL1 | Life Technologies | Hs00158126 | |
| MESP1 | Life Technologies | Hs01001283 | |
| MYH11 (SMMHC) | Life Technologies | Hs00224610 | |
| MYH6 | Life Technologies | Hs01101425 | |
| MYL2 (MLC2v) Life | Technologies | Hs00166405 | |
| MYL7 (MLC2a) | Technologies | Hs01085598 | |
| MYOG | Life Technologies | Hs01072232 | |
| NKX2.5 | Life Technologies | Hs00231763 | |
| NPPA | Life Technologies | Hs01081097 | |
| POU5F1 | Life Technologies | Hs04260367 | |
| SOX17 | Life Technologies | HS00751752 | |
| TNNI1 | Life Technologies | Hs00913333 | |
| TNNI2 | Life Technologies | Hs00268536 | |
| TNNI3 | Life Technologies | HS00165957 | |
| TNNT2 | Life Technologies | Hs00165960 |
المراجع
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Lian, X., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
