في هذا البروتوكول ، سيتم توضيح اشتقاق الخلايا السلفية للقلب من كل من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر والإنسان. تتمثل إحدى الاستراتيجيات الرئيسية في هذا البروتوكول في إثراء الخلايا السلفية للقلب بقياس التدفق الخلوي باستخدام مراسلي الفلورسنت المصممة في خطوط الخلايا الجذعية الجنينية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
اشتقاق خلايا القلب السلف من الخلايا الجذعية الجنينية
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
تتمتع الخلايا السلفية للقلب (CPCs) بالقدرة على التمايز إلى خلايا عضلة القلب وخلايا العضلات الملساء (SMC) والخلايا البطانية وتحمل وعدا كبيرا في العلاج الخلوي ضد أمراض القلب. من بين الطرق المختلفة لعزل CPCs ، يجذب تمايز الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) إلى CPCs اهتماما كبيرا في هذا المجال نظرا لأن الخلايا الجذعية الجنينية يمكن أن توفر مصدرا غير محدود للخلية. نتيجة لذلك ، تم تطوير العديد من الاستراتيجيات لاشتقاق التكلفة لكل بنود من ESCs. في هذا البروتوكول ، يتم وصف تمايز وتنقية CPCs الجنينية من كل من الخلايا الجذعية الجذعية للفئران والإنسان. نظرا لصعوبة استخدام علامات سطح الخلية لعزل CPCs الجنينية ، تم تصميم ESCs باستخدام مراسلي الفلورسنت الذين يتم تنشيطهم بواسطة تعبير إعادة تركيب cre الخاص ب CPC. وبالتالي ، يمكن إثراء CPCs عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS). يوضح هذا البروتوكول إجراءات تكوين الأجسام الجنينية (EBs) من ESCs لمواصفات CPC وإثرائها. يمكن لاحقا زراعة CPCs المعزولة لتمايز النسب القلبي والمقايسات البيولوجية الأخرى. تم تحسين هذا البروتوكول من أجل اشتقاق قوي وفعال للتكلفة المحورية لكل من ESCs بالماوس والإنسان.
المقدمة
لا تزال أمراض القلب السبب الرئيسي في العالم اليوم، وظلت معدلات الوفاة دون تغيير تقريبا في العقدين الماضيين (جمعية القلب الأمريكية). وهناك حاجة ماسة لوضع استراتيجيات علاجية جديدة لمنع بشكل فعال أو عكس فشل القلب. واحد استراتيجية واعدة هي العلاج القائم على الخلايا بعد التطور السريع للخلايا الجذعية علم الأحياء 1. وفي هذا الصدد، يمكن أن تكلفة النقرة متعددة القدرات تكون مصدرا ممتازا للخلية العلاج نظرا لقدرتها على التكاثر ولكن ملتزمة فقط إلى القلب النسب التمايز. لذلك، طريقة فعالة وقوية لتوليد وعزل تكلفة النقرة هو من أهمية كبيرة للدراسات العلاج بالخلايا القلب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. اشتقاق الفأر الجنينية تكلفة النقرة من ماوس المجالس الاقتصادية والاجتماعية
- إعداد الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS) طبقة المغذية.
- دافئ المتوسطة MEF (10٪ FBS في DMEM) إلى 37 درجة مئوية.
- إعداد الجيلاتين المغلفة لوحات.
- إضافة 1 مل من 0.1٪ الجيلاتين في الماء في بئر من لوحة 6 جيدا أو 5 مل في صحن 10 سم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين بروتوكول اشتقاق تكلفة النقرة من عدة خطوط الخلايا ES. يتم تجميع المجالس الاقتصادية والاجتماعية لتشكيل EBS على التمايز إلى تكلفة النقرة. يتم الاحتفاظ المجالس الاقتصادية والاجتماعية بشكل روتيني على مغذيات MEF (الشكل 1A، F) وتتم إزالة مغذيات قبل التمايز. على تجميع المجالس الاقتصادية والاجتماعية في EBS في التمايز المتوسطة (الشكل 1B، G)، تعامل EBS شكلت الثانية مع BMP4 وActivin A لتعزيز تمايز الأديم المتوسط في خطوط الخلايا الماوس (الشكل 1.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يجمع هذا البروتوكول بين طريقة تستخدم عوامل النمو لتوجيه تمايز الخلايا الجذرية المتمركزة والتمايز التلقائي للسلفونات المحيطة المحيطة البشرية إلى CPCs. يتم استخدام نسب CPC المميزة بمراسل الفلورسنت لتحديد وعزل CPCs بكفاءة بواسطة FACS. تحتفظ CPCs المنقاة ب FACS بالقدرة على التمايز إلى خلايا عضلة القلب والعضلات الملساء والخلايا البطانية ولها ملف تعريف تعبير مماثل للخلايا في الجسم الحي. وبالتالي ، يمكن أن تكون هذه CPCs بمثابة مورد كبير لعلاج القلب القائم على الخلايا بسبب قدرتها على تكوين كل من هياكل عضلة القلب والأوعية الدموية.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
نشكر الدكتور ليونيد جناتوفسكي على قراءته الدقيقة والنقدية للورقة. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (HL109054) ومركز صموئيل وجان فرانكل للقلب والأوعية الدموية ، جامعة ميشيغان (الصندوق الافتتاحي) إلى WZ ومن قسم ليون إتش تشارني لأمراض القلب ، كلية الطب بجامعة نيويورك إلى BL.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
تقنية تقنية تقنيةتقنيةتقنية تقنيةتقنيةتقنيةتقنيةتقنيةتقنية
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| FBS | Thermo Scentific | SH30070.03E | |
| Knockout SR | Life | 10828028 | |
| Knockout DMEM | Life | 10829018 | |
| DMEM | Life | 11965118 | |
| NEAA | Life | 11140050 | |
| تقنية | GlutaMAX | Life 35050061 | |
| N2 | Life | 17502048 | |
| B27 | Life | 12587010 | |
| Ham' تقنية s F12 | Life | 11765062 | |
| IMDM | Life | 12440061 | |
| Pen / Strep | Life | 15140122 | |
| Pyruvate | Life | 11360070 | |
| Dispase | Life | 17105041 | |
| Stempro-34 | Life | 10639011 | |
| DMEM / F12 | Life | technology 11330032 | |
| BSA | تكنولوجيا | الحياة 15260037 | |
| Trypsin | تكنولوجيا | الحياة 25200056 | |
| حمض الأسسكوبيك | سيجما | A5960 | |
| 1-ثيوجليسرول | سيجما | M1753 | |
| 2-ميركابتو إيثانول | سيجما | M3148 | |
| VEGF | R & D | 293-VE | |
| Bmp4 | R& D | 314-BP | |
| ActivinA | R& د | 338-AC | |
| bFgf | R & D | 233-FB | |
| Fgf10 | R & D | 345-FG | |
| mTeSR | تقنيات الخلايا الجذعية | 5850 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
المراجع
- Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
- Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).
- Bon....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 8/10/2016. Citeable Link.
A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.
The following author is now listed as a co-corresponding author:
Lei Bu
