يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

اشتقاق خلايا القلب السلف من الخلايا الجذعية الجنينية

8.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52047

⸱

يناير 12, 2015

 ,  , 
1Cardiac Surgery, University of Michigan, 2Leon H Charney Division of Cardiology, New York University School of Medicine

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

في هذا البروتوكول ، سيتم توضيح اشتقاق الخلايا السلفية للقلب من كل من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر والإنسان. تتمثل إحدى الاستراتيجيات الرئيسية في هذا البروتوكول في إثراء الخلايا السلفية للقلب بقياس التدفق الخلوي باستخدام مراسلي الفلورسنت المصممة في خطوط الخلايا الجذعية الجنينية.

الملخص

تتمتع الخلايا السلفية للقلب (CPCs) بالقدرة على التمايز إلى خلايا عضلة القلب وخلايا العضلات الملساء (SMC) والخلايا البطانية وتحمل وعدا كبيرا في العلاج الخلوي ضد أمراض القلب. من بين الطرق المختلفة لعزل CPCs ، يجذب تمايز الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) إلى CPCs اهتماما كبيرا في هذا المجال نظرا لأن الخلايا الجذعية الجنينية يمكن أن توفر مصدرا غير محدود للخلية. نتيجة لذلك ، تم تطوير العديد من الاستراتيجيات لاشتقاق التكلفة لكل بنود من ESCs. في هذا البروتوكول ، يتم وصف تمايز وتنقية CPCs الجنينية من كل من الخلايا الجذعية الجذعية للفئران والإنسان. نظرا لصعوبة استخدام علامات سطح الخلية لعزل CPCs الجنينية ، تم تصميم ESCs باستخدام مراسلي الفلورسنت الذين يتم تنشيطهم بواسطة تعبير إعادة تركيب cre الخاص ب CPC. وبالتالي ، يمكن إثراء CPCs عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS). يوضح هذا البروتوكول إجراءات تكوين الأجسام الجنينية (EBs) من ESCs لمواصفات CPC وإثرائها. يمكن لاحقا زراعة CPCs المعزولة لتمايز النسب القلبي والمقايسات البيولوجية الأخرى. تم تحسين هذا البروتوكول من أجل اشتقاق قوي وفعال للتكلفة المحورية لكل من ESCs بالماوس والإنسان.

المقدمة

لا تزال أمراض القلب السبب الرئيسي في العالم اليوم، وظلت معدلات الوفاة دون تغيير تقريبا في العقدين الماضيين (جمعية القلب الأمريكية). وهناك حاجة ماسة لوضع استراتيجيات علاجية جديدة لمنع بشكل فعال أو عكس فشل القلب. واحد استراتيجية واعدة هي العلاج القائم على الخلايا بعد التطور السريع للخلايا الجذعية علم الأحياء 1. وفي هذا الصدد، يمكن أن تكلفة النقرة متعددة القدرات تكون مصدرا ممتازا للخلية العلاج نظرا لقدرتها على التكاثر ولكن ملتزمة فقط إلى القلب النسب التمايز. لذلك، طريقة فعالة وقوية لتوليد وعزل تكلفة النقرة هو من أهمية كبيرة للدراسات العلاج بالخلايا القلب.

يركز هذا البروتوكول على تكلفة النقرة الجنينية التي تم تحديدها خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر وكيفية توليدها من المجالس الاقتصادية والاجتماعية. تم عزلها تكلفة النقرة مختلفة من قلوب الجنينية والكبار، حتى من الكوسا العظام 2. أثناء تطور الجنين، morphoge العظامالبروتينات المغنطيسية (أفضل الممارسات الإدارية)، من نوع مجنح أفراد الأسرة الموقع التكامل MMTV (Wnts) وإشارات العقدية لحث التزام Mesp1 + الأديم المتوسط ​​متعددة القدرات 3. Mesp1 + خلايا ثم تفرق في تكلفة النقرة الجنينية 4. وعادة ما يتم وضع علامة هذه تكلفة النقرة التي كتبها HCN4، NK2 علبة مثلية 5 (Nkx2-5)، Isl لLIM علبة مثلية 1 (Isl1)، T-مربع 5 (Tbx5)، والعضلية عامل محسن 2C (Mef2c)، تشكل الحقول القلب الابتدائية والثانية، و المساهمة في أجزاء كبيرة من القلب أثناء تخلق القلب 5-10. كلا Nkx2-5 + وIsl1 + / Mef2c + تكلفة النقرة قادرة على التمايز إلى العضلية، والخلايا العضلات الملساء (SMCS)، والخلايا البطانية 5-8. وبالتالي هذه تكلفة النقرة سوف تؤدي إلى الأوعية الدموية في القلب وكذلك أنسجة القلب وهم مصدر خلية مثالية لعلاج القلب خلية القاعدة. ونتيجة لذلك، كان توليد تكلفة النقرة في المختبر وتركيز البحث رئيسيا في الدراسات القلب والأوعية الدموية. منذ المجالس الاقتصادية والاجتماعية لها التوسع غير المحدود قدرةالثانية تمثل الخلايا ICM في مرحلة الكيسة الأريمية، ويعتبر التفريق بين المجالس الاقتصادية والاجتماعية في تكلفة النقرة الجنينية بعد مرحلة التطور الجنيني الطبيعي نهج منطقي وفعال للحصول على تكلفة النقرة.

نهج واحد التطبيقية على نطاق واسع للحصول على تكلفة النقرة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية هو تجميع المجالس الاقتصادية والاجتماعية في EBS 11. لتحسين كفاءة التفريق، وقد استخدمت العوامل الكيميائية ونمو محددة على أساس المعرفة للتنمية القلب 12-14. ومع ذلك، لا توجد علامات جنة البرنامج والتنسيق نهائية، لا سيما لا علامات على سطح الخلية، والتي تحظى بقبول واسع في هذا المجال. لمعالجة هذه المسألة، صممت المجالس الاقتصادية والاجتماعية للاحتفال Isl1 + أو Mef2c + تكلفة النقرة ومشتقاتها مع الصحفيين الفلورسنت باستخدام نظام لجنة المساواة العرقية / loxP. وطرقت recombinase لجنة المساواة العرقية في تحت سيطرة Isl1 / Mef2c المروج / محسن. تعديل RFP بروتين فلوري أو YFP الجين يقودها المروج التأسيسي يمكن تفعيلها من خلال استئصال توقف flox كودون مع لجنة المساواة العرقية recombinase(ISL1: لجنة المساواة العرقية، pCAG-flox وقفة وflox-GFP أو طلب تقديم العروض / Isl1-لجنة المساواة العرقية، Rosa26YFP / Mef2c-لجنة المساواة العرقية، Rosa26YFP) 5،6. وحالما يتم التفريق بين المجالس الاقتصادية والاجتماعية في تكلفة النقرة الحقل القلب الثانية، سوف Isl1 / Mef2c المروج / محسن لجنة المساواة العرقية مدفوعة تفعيل صحفيين الفلورسنت وتكلفة النقرة يمكن تغنى FACS تنقية. لفترة وجيزة، يتم استخدام EB طريقة التجميع لبدء ESC التمايز. لتعزيز كفاءة التمايز، ويتم التعامل مع الخلايا المتمايزة مع حمض الاسكوربيك (AA) وعوامل النمو مثل BMP4، Activin ألف وVEGF 13،15. هذا البروتوكول يسمح قوية وذات كفاءة التفريق CPC باستخدام كل من الفأر والمجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. اشتقاق الفأر الجنينية تكلفة النقرة من ماوس المجالس الاقتصادية والاجتماعية

  1. إعداد الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS) طبقة المغذية.
    1. دافئ المتوسطة MEF (10٪ FBS في DMEM) إلى 37 درجة مئوية.
    2. إعداد الجيلاتين المغلفة لوحات.
      1. إضافة 1 مل من 0.1٪ الجيلاتين في الماء في بئر من لوحة 6 جيدا أو 5 مل في صحن 10 سم.
      2. ترك لوحات أو أطباق في 37 ° C أو درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. نطمح الجيلاتين قبل استخدامها.
    3. ذوبان الجليد المشع MEFS بسرعة في حمام مائي 37 ° C، مع الهز لطيف.
    4. نقل الخلايا برفق إلى 15 مل أو 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 5 مل من قبل تحسنت المتوسطة MEF. دوامة الخلايا ببطء وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
    5. الخلايا resuspend في المتوسط ​​MEF وعدد خلايا قابلة للحياة. استخدام وحدات التخزين التالية من MEF المتوسطة: 2 مل لخلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا و10 مل للخلايا من طبق 10 سم.
    6. لوحة الخلايا إلى 6 لوحات جيدا أو 10 سم في أطباق 1-2× 10 6 في لوحة / طبق.
    7. احتضان لوحات MEF / أطباق عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لا يقل عن 24 ساعة قبل استخدامها.
      ملاحظة: تجاهل لوحات MEF / أطباق القديمة من أسبوع.
  2. إعداد المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس
    1. ثقافة Isl1-لجنة المساواة العرقية. Rosa26YFP / Mef2c-لجنة المساواة العرقية. Rosa26YFP الماوس المجالس الاقتصادية والاجتماعية على MEFS حتى 90٪ متموجة. استخدام ES المتوسطة الخلية تتكون من 410 مل DMEM، 75 مل FBS، 0.1 ملي MEM NEAA، 2 مم L-الجلوتامين، 0.1 ملي البيروفات، و 100 U القلم / بكتيريا، و 0.1 ملم β المركابتويثانول.
    2. إعداد الجيلاتين المغلفة 6 لوحات جيدا كما هو موضح في 1.1.2.
    3. نضح المتوسطة من لوحات وشطف الخلايا مع DPBS.
      1. نضح DPBS وإضافة 0.4 مل 0.25٪ التربسين في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 5 دقائق. إضافة 1 مل قبل تحسنت المتوسطة ES لوقف رد الفعل التربسين.
    4. حصاد الخلايا والخلايا الطرد المركزي في 200 x ج ونضح المتوسطة. Resuspend الخلايا في 1 مل المتوسطة خلية ES وعدد الخلايا.
    5. المجالس الاقتصادية والاجتماعية لوحة على لوحات الجيلاتين المغلفة في كثافة 3 × 10 4 / سم 2. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 لمدة 2 أيام عندما تصل المجالس الاقتصادية والاجتماعية حوالي 90٪ متموجة. تغيير المتوسطة كل يوم.
    6. عندما المجالس الاقتصادية والاجتماعية هي 90٪ متموجة، كرر الخطوات من 1.2.2-1.2.5 تماما لإزالة مغذيات MEF.
  3. حمل حزب الشيوعى الصينى التمايز عن طريق تشكيل EB
    1. إعداد التمايز المتوسطة على النحو التالي: 36 مل IMDM، 12 مل F12 هام، و2 مم L-الجلوتامين، 0.34 مل BSA (7.5٪)، 0.25 مل N2، 0.5 مل B27، 50 ميكروغرام / مل AA، و 0.45 مم 1-thioglycerol.
    2. نضح المتوسطة من الخلايا وشطف مع DPBS. نضح DPBS وإضافة 0.4 مل 0.25٪ التربسين في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. إضافة 1 مل التمايز المتوسطة إلى الكف عن رد فعل وماصة صعودا وهبوطا لتفريق مجموعات الخلايا إلى خلايا واحدة.
    4. الطرد المركزي المجالس الاقتصادية والاجتماعية في 200 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل المتوسطة.
      1. في resuspend 1 × 10 6 </ سوب> المجالس الاقتصادية والاجتماعية في 1 مل التمايز المتوسطة. عدد الخلايا، والثقافة الخلايا في انخفاض مفرزة طبق بتري في تركيز 1 × 10 5 خلية / مل في التمايز المتوسطة عند 37 درجة مئوية لمدة الأول EB التجميع.
    5. بعد يومين من تشكيل EB، ونقل EBS من الأطباق إلى 50 مل أنابيب. تدور في 200 x ج لمدة 1 دقيقة. إزالة المتوسطة وشطف EBS مع 10 مل DPBS دون الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+.
    6. نضح DPBS وإضافة 1 مل 0.25٪ التربسين. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 4.5 مل التمايز المتوسطة لوقف التفاعل. الماصة صعودا وهبوطا لفصل EBS إلى خلايا واحدة.
    7. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق. خلايا المتوسطة و resuspend نضح في 1 مل التمايز المتوسطة.
    8. عدد الخلايا، وتمييع 2 × 10 6 خلايا إلى 1 × 10 5 خلية / مل في التمايز المتوسطة. إضافة VEGF، BMP4 وActivin ألف من المتوسط ​​في تركيز النهائي من 5 نانوغرام / مل، 0.8 نانوغرام / مل، و 5 نانوغرام / مل على التوالي. Cultuإعادة الخلايا في طبق بتري لتشكيل EB الثاني عند 37 درجة مئوية.
    9. 40 ساعة بعد تشكيل EB الثاني، ونقل EBS إلى 50 مل أنابيب. شطف مع DPBS مرة واحدة، فصل EBS مع 1 مل 0.25٪ التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الماصة صعودا وهبوطا لفصل EBS إلى خلايا واحدة.
    10. resuspend الخلايا في Stempro-34 متوسطة مع 5 نانوغرام / مل VEGF، 10 نانوغرام / مل bFGF و 12.5 نانوغرام / مل FGF10. لوحة الخلايا في 2 × 10 5 / سم 2 في لوحات الجيلاتين المغلفة. الثقافة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 32 ساعة قبل CPC العزلة.
  4. عزل mCPCs
    1. نضح المتوسطة وشطف مع DPBS. إضافة 0.5 مل 0.25٪ التربسين لوحات الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إضافة 4.5 مل التمايز المتوسطة لوقف التفاعل. الماصة صعودا وهبوطا لفصل EBS إلى خلايا واحدة. جمع الخلايا عن طريق خلايا الطرد المركزي و resuspend في 2٪ FBS / PBS لFACS تنقية.
    2. تشغيل المجالس الاقتصادية والاجتماعية غير متمايزة على فارز كما سيطرة سلبية. تغيير الجهد لضبط الموسيقي إلى الأمامثالثا (FSC) والتشرذم الجانب (SSC) لتحديد السكان المطلوب. استخدام الأمام مبعثر مقابل مبعثر الجانب وارتفاع مبعثر الأمام مقابل عرض لاستبعاد الحطام وصدرة. في اختيار من الفئات السكانية الفرعية، وفقا لتوزيع الضوابط ESC، رسم بوابة YFP إيجابية على الرسم البياني للقضاء على تألق ذاتي الخلية. جمع YFP + تكلفة النقرة من YFP + النابضة.
    3. لوحة لتكلفة النقرة المنقى (خلايا YFP +) في 6 لوحات جيدا مع التمايز المتوسطة (1.3.1). ثقافة 3-5 أيام إضافية عند 37 درجة مئوية لمدة التفريق بين تكلفة النقرة في العضلية وSMCS.

2. اشتقاق الإنسان الجنينية تكلفة النقرة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية البشرية

  1. إعداد مغذيات
    1. إعداد الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFS) طبقة المغذية على النحو المبين أعلاه في كثافة 2 × 10 4 / سم 2.
  2. الحفاظ على المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان
    1. الحفاظ على ISL1 البشري: لجنة المساواة العرقية، pCAG-flox وقفة وflox-GFP أو طلب تقديم العروض المجالس الاقتصادية والاجتماعية بشكل روتيني على MEF باستخدام المتوسطة HESC منتظم (خروج المغلوب DMEM / F-12 385 مل، 100 مل ريال خروج المغلوب، 2 مم L-الجلوتامين، 0.1 ملي NEAA، 0.1 ملم β المركابتويثانول، 10 نانوغرام / مل FGF الأساسي). قبل التمايز القلب، ونقل المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان في حالة حرة المغذية لا يقل عن 2 الممرات.
  3. إعداد المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان في حالة التغذية المجانية
    1. إعداد لوحات المغلفة للثقافة المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان.
      1. ذوبان الجليد matrigel في 4 درجات مئوية خلال الليل. وضع أنبوب 50 مل على الجليد وإضافة 30 مل الباردة DMEM / F12 المتوسط ​​في أنبوب.
      2. إضافة 1 مل matrigel في المتوسط ​​البارد وتخلط جيدا. إضافة 1 مل البارد matrigel-DMEM / 12 المتوسطة في بئر من لوحة 6 جيدا أو 5 مل في صحن 10 سم.
      3. ترك لوحات / أطباق في 4 درجات مئوية خلال الليل أو درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. نضح المتوسطة قبل استخدامها.
    2. تقسيم المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان على لوحات: وسائل الإعلام نضح من لوحة MEF وشطف المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان مع DPBS. ثم يضاف 1 مل dispase (1 ملغ / مل) إلى بئر من لوحة 6 جيدا. احتضان خلايا في 37 ° Cحاضنة حتى حواف المستعمرات بداية لفصل.
    3. إزالة حل dispase. شطف مع DPBS مرتين، ثم يضاف 2.5 مل / في المتوسط ​​mTeSR جيدا أو المتوسطة MEF مكيفة إلى اللوحة.
    4. تتخلص من الخلايا باستخدام مكشطة الخلية وبعناية الماصة صعودا وهبوطا لكسر المستعمرات ESC الإنسان في كتل صغيرة.
    5. نقل كتل ESC وتمييع 1: 3 في لوحات المغلفة.
    6. إضافة 2 مل / جيد المتوسطة mTeSR أو المتوسطة MEF مكيفة وتغيير المتوسطة يوميا.
    7. ثقافة المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان في mTeSR المتوسطة أو المتوسطة MEF مكيفة على لوحات المغلفة لا يقل عن 2 الممرات.
  4. حمل حزب الشيوعى الصينى التمايز من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان
    1. عندما تكون الخلايا ~ 90٪ متموجة، نضح المتوسطة وشطف مع DPBS. ثم احتضان hESCs في 0.5 ملغ / مل Dispase عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    2. شطف hESCs مع DPBS مرتين، وإزالة الخلايا من لوحات مع رافع الخلية، resuspend ثم المشابك خلية في التمايز المتوسطة (DMEM / F12 تحتوي على 18٪ FBS، 0.1 ملي NEAA، 2 ممL-الجلوتامين، 0.1 ملم β المركابتويثانول و 50 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك).
    3. نقل الخلايا في 6 جيدا لوحات مرفق منخفضة للغاية لتشكيل EB.
    4. تغيير التمايز المتوسطة اليوم التالي.
    5. استبدال المتوسط ​​كل 3 أيام، والحفاظ على EBS في الثقافة تعليق.
  5. عزل HCPCS
    1. جمع EBS في موعد أقصاه يوم 9 من التمايز لعزل حزب الشيوعى الصينى الإنسان.
    2. نضح المتوسطة وشطف EBS مع DPBS مرتين. إضافة 0.5 مل 0.25٪ التربسين إلى كل بئر من لوحات ثقافة 6 جيدا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. إضافة حجم مساو من التمايز المتوسطة لوقف التفاعل. الماصة صعودا وهبوطا لفصل EBS إلى خلايا واحدة. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend الخلايا في 2٪ FBS / DPBS. تصفية الخلايا مع 40 ميكرومتر مصفاة الخلية وFACS تنقيته-طلب تقديم العروض + خلايا CPC كما وصفها في 1.4.3.
    4. لوحة فرز HCPCS على لوحات المغلفة geltin. HCPCS الثقافة في التمايز المتوسطة لمدة 7-9 أيام على التمايز إلى خلايا cardiomyocyte والعضلات الملساء. بعد 7 أيام والطلاء، والثقافة الخلايا مع 5٪ خروج المغلوب ريال في DMEM / F12 المتوسطة المتفاوتة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين بروتوكول اشتقاق تكلفة النقرة من عدة خطوط الخلايا ES. يتم تجميع المجالس الاقتصادية والاجتماعية لتشكيل EBS على التمايز إلى تكلفة النقرة. يتم الاحتفاظ المجالس الاقتصادية والاجتماعية بشكل روتيني على مغذيات MEF (الشكل 1A، F) وتتم إزالة مغذيات قبل التمايز. على تجميع المجالس الاقتصادية والاجتماعية في EBS في التمايز المتوسطة (الشكل 1B، G)، تعامل EBS شكلت الثانية مع BMP4 وActivin A لتعزيز تمايز الأديم المتوسط ​​في خطوط الخلايا الماوس (الشكل 1...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يجمع هذا البروتوكول بين طريقة تستخدم عوامل النمو لتوجيه تمايز الخلايا الجذرية المتمركزة والتمايز التلقائي للسلفونات المحيطة المحيطة البشرية إلى CPCs. يتم استخدام نسب CPC المميزة بمراسل الفلورسنت لتحديد وعزل CPCs بكفاءة بواسطة FACS. تحتفظ CPCs المنقاة ب FACS بالقدرة على التمايز إلى خلايا عضلة القلب والعضلات الملساء والخلايا البطانية ولها ملف تعريف تعبير مماثل للخلايا في الجسم الحي. وبالتالي ، يمكن أن تكون هذه CPCs بمثابة مورد كبير لعلاج القلب القائم على الخلايا بسبب قدرتها على تكوين كل من هياكل عضلة القلب والأوعية الدموية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور ليونيد جناتوفسكي على قراءته الدقيقة والنقدية للورقة. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (HL109054) ومركز صموئيل وجان فرانكل للقلب والأوعية الدموية ، جامعة ميشيغان (الصندوق الافتتاحي) إلى WZ ومن قسم ليون إتش تشارني لأمراض القلب ، كلية الطب بجامعة نيويورك إلى BL.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

تقنية تقنية تقنيةتقنيةتقنية تقنيةتقنيةتقنيةتقنيةتقنيةتقنية
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
FBSThermo ScentificSH30070.03E
Knockout SRLife10828028
Knockout DMEMLife10829018
DMEMLife11965118
NEAALife11140050
تقنيةGlutaMAXLife 35050061
N2Life17502048
B27Life12587010
Ham' تقنية s F12Life11765062
IMDMLife12440061
Pen / StrepLife15140122
PyruvateLife11360070
DispaseLife17105041
Stempro-34Life10639011
DMEM / F12Lifetechnology 11330032
BSA تكنولوجياالحياة 15260037
Trypsin تكنولوجياالحياة 25200056
حمض الأسسكوبيك  سيجماA5960
1-ثيوجليسرولسيجماM1753
2-ميركابتو إيثانولسيجماM3148
VEGFR & D293-VE
Bmp4R& D314-BP
ActivinAR& د338-AC
bFgfR & D233-FB
Fgf10R & D345-FG
mTeSRتقنيات الخلايا الجذعية5850
MatrigelBD Biosciences354277

المراجع

  1. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12 (6), 689-698 (2013).
  2. Passier, R., van Laake, L. W., Mummery, C. L. Stem-cell-based therapy and lessons from the heart. Nature. 453 (7193), 322-329 (2008).
  3. Bondue, A., Blanpain, C. Mesp1: a key regulator of cardiovascular lineage commitment. Circulation Research. 107 (12), 1414-1427 (2010).
  4. Bondue, A., et al. Mesp1 acts as a master regulator of multipotent cardiovascular progenitor specification. Cell Stem Cell. 3 (1), 69-84 (2008).
  5. Bu, L., et al. Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages. Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).
  6. Lei, I., Gao, X., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF protein component BAF250a regulates cardiac progenitor cell differentiation by modulating chromatin accessibility during second heart field development. The Journal of Biological Chemistry. 287 (29), 24255-24262 (2012).
  7. Lei, I., Liu, L., Sham, M. H., Wang, Z. SWI/SNF in cardiac progenitor cell differentiation. Journal of Cellular Biochemistry. 114 (11), 2437-2445 (2013).
  8. Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
  9. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
  10. Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field. Developmental Biology. 287 (1), 134-145 (2005).
  11. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
  12. Wada, R., et al. Induction of human cardiomyocyte-like cells from fibroblasts by defined factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12667-12672 (2013).
  13. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  14. Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107 (14), 1912-1916 (2003).
  15. Wamstad, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151 (1), 206-220 (2012).
  16. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  17. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  18. Gaj, T., Gersbach, C. S. 3rd, Barbas, T. A. L. E. N. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  19. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  20. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  21. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  22. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature. biotechnology. 25 (9), 1015-1024 (2007).
  23. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293(2011).
  24. Kouskoff, V., Lacaud, G., Schwantz, S., Fehling, H. J., Keller, G. Sequential development of hematopoietic and cardiac mesoderm during embryonic stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (37), 13170-13175 (2005).
  25. Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation: Research in Biological Diversity. 76 (9), 958-970 (2008).
  26. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-1857 (2012).
  27. Bizy, A., et al. Myosin light chain 2-based selection of human iPSC-derived early ventricular cardiac myocytes. Stem Cell Research. 11 (3), 1335-1347 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Erratum: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 8/10/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells.

The following author is now listed as a co-corresponding author:

Lei Bu

استكشف المزيد من المقالات

فرز الخلايا المنشط بالفلورةتكوين الأجسام الجنينيةتمايز الخلاياقياس التدفق الخلويأطباق مطلية بالجيلاتينالمعالجة بعوامل النموتحليل سلالات الخلاياتعبير المراسل الفلوري
اشتقاق خلايا القلب السلف من الخلايا الجذعية الجنينية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.