يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

خيارات نيون في الموقع بروتوكول التهجين لXist RNA جنبا إلى جنب مع المناعي من هيستون تعديل في كروموسوم X-التعطيل

13.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52053

⸱

نوفمبر 26, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

لقد قمنا بتطوير بروتوكول التهجين الفلوري في الموقع (FISH) المخصص بسهولة مع التألق المناعي. يسمح ذلك بإجراء فحص مفصل لديناميكيات الحمض النووي الريبي مع نظرة ثاقبة متزامنة لبنية الكروماتين والتنظيم النووي وتنظيم النسخ على مستوى الخلية الواحدة.

الملخص

الجمع بين RNA فلوري التهجين في الموقع (FISH) مع المناعي (المناعية FISH) في يخلق التقنية التي يمكن استخدامها على مستوى خلية واحدة للكشف عن ديناميات المكانية للتوطين RNA مع البصيرة في وقت واحد في توطين البروتينات أو تعديلات جينية وغيرها من التفاصيل والتي يمكن التي أبرزها المناعي. X-كروموسوم تعطيل هو نموذج لفترة طويلة غير المشفر RNA (lncRNA) بوساطة إسكات الجينات. -X غير نشط نص معين (Xist) تراكم lncRNA (وتسمى سحابة Xist) على واحد من اثنين X-الكروموسومات في الإناث الثدييات هو خطوة حاسمة لبدء كروموسوم X-تعطيل. Xist RNA يتفاعل مباشرة أو غير مباشرة مع مختلف الانزيمات تعديل الكروماتين ويقدم المناظر الطبيعية جينية مميزة لغير نشط X-كروموسوم (شي). واحد السمة المميزة جينية معروف من شي هي هيستون H3 ثلاثي ميثيل يسين 27 (H3K27me3) التعديل. هنا، نحن تصف المناعية FISH بسيطة وسريعةبروتوكول للكشف عن Xist RNA باستخدام RNA FISH مع تحقيقات قليل النوكليوتيد متعددة إلى جانب المناعي من H3K27me3 لدراسة توطين Xist RNA وتعديلات جينية المرتبطة بها. استخدام نتائج تحقيقات قليل النوكليوتيد في فترة حضانة أقصر والكشف عن أكثر حساسية من Xist RNA مقارنة في المختبر كتب تحقيقات RNA (riboprobes). يوفر هذا البروتوكول أداة قوية لفهم ديناميات lncRNAs وما يرتبط بها من تعديله جينية، هيكل الكروماتين، والتنظيم النووية وتنظيم النسخي.

المقدمة

الثدييات X-كروموسوم تعطيل (XCI) هو استراتيجية للتعويض عن الخلل في العاشر مرتبطة جرعة الجينات بين XX XY و، حيث واحد من اثنين X-الكروموسومات في الإناث هو transcriptionally المعطل 1. X-كروموسوم تعطيل هو نظام نموذج رائع لفترة طويلة RNA غير المشفر (lncRNA) البحوث. وينظم X-كروموسوم تعطيل من قبل lncRNAs متعددة، وتمت دراسة على نطاق واسع على مدى العقود القليلة الماضية لكشف آليات الحديث المتبادل بين lncRNAs، النسخ، هيكل الكروماتين وتنظيم النووية 2 و 3.

مركز X تعطيل (XIC) تقع على الصبغي X-هو موضع الجيني معقدة تتألف من عدد من الجينات إنتاج الرنا غير الترميز 4. -X غير نشط نص معين (Xist) lncRNA في الثدييات eutherian هو واحد من هذا القبيل lncRNA التي تلعب دورا حاسما في كروموسوم X-تعطيل 5،6. النصوص Xist تحيط موقع فوالبنية شي لبدء كروموسوم X-تعطيل، وتبدو وكأنها سحابة عندما تصور باستخدام RNA FISH. ويشار إلى هذا التشكيل ب "Xist الغيمة" 7. منذ Xist RNA يتفاعل مع مختلف الانزيمات تعديل الكروماتين، ويلاحظ شارك في توطين الغيوم Xist مع تعديلات جينية مختلفة لونين الصمت والنسخ القمعي خلال كروموسوم X-تعطيل 8. على سبيل المثال، يتفاعل Xist RNA مع polycomb مجمع القمعي 2 (PRC2) وهي المسؤولة عن H3K27me3 وتفضي إلى حالة لونين القمعية 9. وقوع سحابة Xist على زيان والتي تشترك في التعريب مع تعديل H3K27me3 المكثف يمثل المشهد المغاير الاختياري للشي 10،11.

وتأتي التقنيات الوراثية الخلوية، مثل DNA / RNA FISH شوطا طويلا من الطريقة التقليدية باستخدام تحقيقات radiolabelled 12 إلى التقنيات الحديثة والمتقدمة مع تعزيز الحساسية والتصوير الفلورسنت باستخدام المجسات قليل النوكليوتيد متعددة 13،14. FISH DNA / RNA إلى جانب المناعي وقد استخدم بشكل روتيني كأداة الخلوي لفهم تنظيم الزمانية المكانية النووية، RNA الترجمة، وهيكل الكروماتين والتعديلات. إعداد التحقيق الأكثر القياسي لRNA FISH ينطوي على استخدام البلازميد أو البكتيرية الصبغي الاصطناعي (BAC) استنساخ ووضع العلامات لاحقا إما مع الترجمة نيك أو فتيلة العشوائي 15. ومع ذلك، ما يقرب من 70٪ من الجينات في الفئران و 40٪ من الجينات في البشر تظهر تداخل الحس والعقاقير النصوص 16، وبالتالي تتطلب طريقة FISH حبلا محددة من أجل التمييز الشعور والعقاقير النصوص. في المختبر تحقيقات RNA كتب (riboprobe ) غالبا ما تستخدم لحبلا محددة RNA FISH 17،18. ومع ذلك، وهذا ينطوي إعداد استنساخ البلازميد أو منتج PCR مع T7، SP6 أو T3 المروج وriboprobes تجميع. وعلاوة على ذلك، riboprobes المستمدة من genomجيم DNA أو كدنا] غالبا ما تحتوي على مناطق غير محددة والعناصر المتكررة، مما يؤدي إلى ارتفاع الضوضاء في الخلفية. وثمة مسألة أخرى هي أن riboprobes، والتي هي بضع مئات من النيوكليوتيدات في الطول واحتواء fluorophores متعددة، لا يمكن أن تخترق بفاعلية في النواة. للتحايل على هذا، تم وضع عدة تحقيقات قليل النوكليوتيد أقصر المسمى مع fluorophore واحد في نهاية التي لديها حساسية جيدة، وقوة الإشارة موحدة، وسهولة تنقية ومعالجة 14. وبالإضافة إلى ذلك، [أليغنوكليوتيد DNA عادة ما تكون أكثر استقرارا من الحمض النووي الريبي. طبقنا استراتيجية مماثلة باستخدام [أليغنوكليوتيد في Xist RNA FISH 19 مع المناعي لفهم ديناميات جينية من شي الناجمة عن Xist lncRNA خلال عملية كروموسوم X-تعطيل. يصف هذا البروتوكول خلق تحقيقات قليل النوكليوتيد والإعداد المناسب من الخلايا، وكذلك الاستفادة من RNA المناعي وFISH. Xist RNA FISH باستخدام oligonucle متعددةotides هو نهج فعال من حيث التكلفة في المدى الطويل إذا يتم تنفيذ Xist RNA FISH بشكل روتيني في مختبر واحد. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد lncRNAs في الخلايا في حين رسم في وقت واحد شارك في التعريب مع تعديلات جينية أو عوامل. واحد الميزة الرئيسية لبروتوكول هي القدرة على تعديله بسهولة لتناسب مصالح المرء البحوث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد التحقيق

  1. الحصول أليغنوكليوتيد] فريدة متعددة في Xist ([أليغنوكليوتيد 20-30 النوكليوتيدات طول، 63-65 درجة مئوية درجة حرارة انصهار، الجدول 1) مع تعديل 5'-الأمينية وتعليق في الماء.
  2. تجمع كميات متساوي المولية من [أليغنوكليوتيد مع 5'-الأمينية تعديل (إجمالي 4.5 ميكروغرام) وتسمية مع أمين رد الفعل صبغة الفلورسنت التالية تعليمات الشركة المصنعة.
    1. حل [أليغنوكليوتيد المجمعة في 5 ميكرولتر النهائية من nuclease خالية من المياه وإضافة 3 ميكرولتر من 1 M بيكربونات الصوديوم إلى حل قليل النوكليوتيد.
    2. إضافة 2 ميكرولتر DMSO إلى قارورة-أمين صبغ رد الفعل ودوامة لفترة وجيزة.
    3. مزيج الحل قليل النوكليوتيد مع صبغ رد الفعل في DMSO واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في الظلام.
  3. تنقية تحقيقات قليل النوكليوتيد fluorescently المسمى من قبل العمود G-25 تليها هطول الأمطار الإيثانول.
    1. العمود الطرد المركزي G-25 في 750 x ج لمدة 1 دقيقة لإزالة عازلة تخزين الزائد.
    2. إضافة 40 ميكرولتر nuclease خالية من الماء إلى الخليط وضع العلامات وردت في الخطوة 1.2.3 وتنطبق على العمود G-25. أجهزة الطرد المركزي في 750 x ج لمدة 2 دقيقة.
    3. إضافة 50 ميكرولتر nuclease خالية من الماء، و 10 ميكرولتر 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) و 250 ميكرولتر الإيثانول إلى التحقيق تنقيته من الخطوة 1.3.2. متجر في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في 21،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    4. غسل أليغنوكليوتيد] عجلت مرة واحدة مع 1 مل من الايثانول 70٪.
    5. اعادة تعليق في 50 ميكرولتر nuclease خالية من الماء أو TE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 1 ملم EDTA) لتركيز النهائي من ما يقرب من 10 ميكرومتر.
  4. تمييع تحقيقات قليل النوكليوتيد fluorescently المسمى إلى تركيز النهائي من 250 نانومتر مع العازلة التهجين (10٪ الفورماميد، 2X SSC [300 مم كلوريد الصوديوم، و 30 ملي سيترات الصوديوم]، 2 ملغ / مل BSA، و 10٪ كبريتات ديكستران).
    ملاحظة: مع هذا البروتوكول FISH سريع، قليل النوكليوتيد صتم تصميم الجلباب في Xist وتستخدم بتركيز أعلى من بروتوكول FISH العادي باستخدام المجسات قليل النوكليوتيد من أجل تقصير فترة حضانة لالتهجين.

2. الانزلاق إعداد

ملاحظة: الشرائح يمكن أن تكون على استعداد لالمناعية FISH باستخدام الماوس الجذعية الجنينية (ES) أو هيئة مضغي الشكل (EB) التفريق خلايا 20 و 21 من قبل أي من تزايد بشكل مباشر على شريحة تعامل بولي يسين أو باستخدام cytospin مع التعليق الخلية. هنا، يظهر إعداد الشريحة التي cytospin.

  1. نضح مستنبت في صحن 6 جيدا. يغسل مع PBS (درجة حرارة الغرفة)، ونضح بدقة.
  2. إضافة 0.5 مل من التربسين إلى الطبق 6-جيدا، واحتضان لمدة 5-10 دقيقة عند 37 ° C.
  3. إضافة 5 مل من المتوسط ​​وتفريق الخلايا عن طريق pipetting بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات.
  4. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة.
  5. تجاهل المتوسطة لد بتعليق بلطف الخلايا في 2 مل PBS.
  6. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، وتمييع تعليق خلية في 4 × 10 5 خلية / مل من برنامج تلفزيوني.
  7. تجميع الشرائح، بطاقة مرشح وغرفة مع مقطع ووضعها في فتحات مناسبة في الدوار من cytospin. إضافة 250 ميكرولتر من كل عينة أعدت في الخطوة 2.6 في كل غرفة من وحدات تجميعها في cytospin. أجهزة الطرد المركزي في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. ملء 3 الجرار coplin على الجليد مع 40 مل كل من الجليد الباردة PBS، CSK عازلة (10 أنابيب ملي، ودرجة الحموضة 6.8، 100 مم كلوريد الصوديوم، 300 ملي السكروز، 3 ملي MgCl 2)، وعازلة CSKT (CSK عازلة مع 0.5٪ تريتون X-100)، على التوالي.
  9. بعد الانتهاء من cytospin، ونقل بسرعة الشريحة في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة واحتضان لمدة 5 دقائق.
  10. نقل الشريحة إلى الجليد الباردة CSK العازلة واحتضان لمدة 1 دقيقة.
  11. نقل الشريحة إلى عازلة الجليد الباردة CSKT واحتضان لمدة 5 دقائق.
  12. نقل الشريحة مرة أخرى في الجليد الباردة CSK BUFفر واحتضان لمدة 1 دقيقة.
  13. نقل الشريحة إلى 4٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

3. المناعي

  1. ضع الشرائح في جرة coplin مع PBST (1X PBS مع 0.1٪ توين-20) لعدة ثوان.
  2. ضع الشرائح في الميل السماح عازلة المتبقية لتتدفق الشريحة. يمسح بعناية السائل الزائد خارج الشريحة ووضعها في مربع الماصة طرف فارغة بالماء. تراكب الشريحة مع 40 ميكرولتر من عرقلة الحل (1X PBS، 1٪ BSA، 0.1٪ توين-20)، ضع بلطف ساترة، واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة ساترة، وإزالة عرقلة الحل، وإضافة 40 ميكرولتر من الأجسام المضادة هيستون H3K27me3 الأساسي المخفف لتركيز 1: 500 في عرقلة الحل. ضع ساترة مرة أخرى على الشريحة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: إن المانع ريبونوكلياز في عرقلة الحل قد يكون من المفيد للحفاظ على الحمض النووي الريبي في هذا RNA FISH بروتوكول عندما تستخدم الأجسام المضادة.
  4. غسل الشريحة 2 مرات في الجرار coplin مليئة PBST، لمدة 5 دقائق لكل منهما، في حين هز بلطف الغسيل.
  5. ضع الشرائح في الميل السماح عازلة المتبقية لتتدفق الشريحة. يمسح بعناية السائل الزائد ووضع الشريحة مرة أخرى إلى المربع تلميح. تراكب مع 40 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (1: 500) مخففة في عرقلة الحل، ووضع ساترة، واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام. للخطوات التالية، والحفاظ على الشريحة في الظلام في جميع الأوقات.
  6. غسل 2 مرات في coplin الجرار مع PBST كما في الخطوة 3.4.

4. RNA FISH مع قليل النوكليوتيد تحقيقات

  1. قبل الدافئة مربع الماصة طرف فارغة بالماء في الجزء السفلي لمنع الشرائح من الجفاف عند 37 درجة مئوية لمدة RNA FISH في الخطوة 4.3.
  2. ضع الشرائح في الميل السماح عازلة المتبقية لتتدفق الشريحة. يمسح بعناية السائل الزائد خارج الشريحة من الخطوة 3.6 و ضع الشريحة في مربع الماصة طرف مع واتإيه في الأسفل. إضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة FISH (10٪ الفورماميد في 2X SSC) على الشريحة واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة FISH الحل غسيل، وإضافة 8 ميكرولتر من تحقيقات قليل النوكليوتيد على الشريحة ضع زلة تغطية، ونقل الشريحة إلى مربع الماصة طرف قبل تحسنت مع المياه في أسفل؛ احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
  4. ضع 3 الجرار coplin قبل تحسنت في حمام مائي عند 37 درجة مئوية مع غسل العازلة FISH، FISH غسل عازلة مع دابي، و2X SSC.
  5. بعد 1-2 ساعة الحضانة لRNA FISH، وطرح الشريحة في المخزن المؤقت قبل تحسنت غسل FISH.
  6. احتضان شريحة لبضع دقائق حتى تسقط ساترة الخروج من الشريحة.
  7. ضع الشريحة مرة أخرى في غسل العازلة، وتستمر الحضانة لمدة 5 دقائق.
  8. نقل الشريحة إلى جرة coplin آخر مع درجة حرارة ما قبل FISH غسل العازلة مع 0.5 نانوغرام / مل دابي واحتضان لمدة 5 دقائق.
  9. تحويل الشريحة إلى جرة coplin أخرى مع تدفئته قبل 2X SSC واحتضان لمدة 5 ميلن.
  10. ضع الشرائح في الميل السماح عازلة المتبقية لتتدفق الشريحة. يمسح بعناية السائل الزائد ووضع الشريحة مرة أخرى إلى مربع طرف الجاف. إضافة 4 ميكرولتر من antifade مع دابي على الشريحة ووضع ساترة.
  11. ختم ساترة مع طلاء الأظافر ومراقبة تحت المجهر. ويمكن تخزين الشريحة في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة بضعة أشهر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وتظهر الصور التمثيلية للسريع المناعية FISH في الشكل 1A. تم الكشف عن التعاون توطين Xist RNA السحابية وH3K27me3 إشارة على زيان في تمييز الخلايا الإناث. في اليوم 12 على التمايز، وكان أكثر من 90٪ من خلايا EB سحابة Xist (الشكل 1B). تحقيقات قليل النوكليوتيد قصيرة اخترقت بكفاءة في نوى، مما يؤدي إلى تصور المترجمة شارك ما يقرب من جميع H3K27me3 إشارات مع Xist RNA (الشكل 1C، 97٪، ن = 150).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الورقة، قدمنا ​​سريع بروتوكول المناعية FISH أن يستغرق أقل من 5 ساعة لاستكمال إعداد الشرائح، Xist RNA FISH، والمناعي للH3K27me3. وبالمقارنة مع النهج المناعية FISH العام لXist RNA الكشف، الذي يحتاج عادة الحضانة بين عشية وضحاها RNA FISH، هذا البروتوكول ليس فقط يخفف كثيرا من الوقت الذي يقضيه ولكن أيضا يحسن حساسية المناعة FISH باستخدام المجسات قليل النوكليوتيد.

منذ Xist وكتب غاية خلال كروموسوم X-تعطيل وجدت نسخة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر Hongjae Sunwoo على النصيحة المفيدة لتصميم قليل النوكليوتيدات في RNA FISH. نشكر أيضا سيرينيتي كورتيس على تحرير المخطوطة. تم دعم نيويورك من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه للبحث في الخارج من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS). تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (RO1-GM102184) ، ومؤسسة أبحاث March of Dimes (# 6-FY12-337) ، وصندوق التنمية ومنحة الوصي في المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال إلى Y.O.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قليل
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
النوكليوتيدات مع تعديل 5 'أمينوIDT
Alexa Fluor 488 Reactive DyeLife TechnologiesA32750
MicroSpin G-25 أعمدةGE Healthcare27-5325-01
Cytospin 2Shandon59900102
ألبومين مصل البقر ، درجة البيولوجيا الجزيئية (للمخزن المؤقت للتهجين)روش10715859103
هيستون H3K27me3 الجسم المضادالنشط الحافز61017
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse ، متصاصللغاية Life TechnologiesA21424
ProLong Gold الكاشف المضاد للبهتانLife TechnologiesP36931

المراجع

  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
  3. Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
  4. Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
  5. Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
  6. Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
  7. Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
  8. Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
  9. Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
  10. Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
  11. Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
  12. Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
  13. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  14. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
  15. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
  16. Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
  17. Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
  18. Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
  19. Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
  20. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
  21. Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
  22. Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. Genetics. 182, 685-698 (2009).
  23. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
  24. Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
  25. Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
  26. Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171(2004).
  27. Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

H3K27me3
خيارات نيون في الموقع بروتوكول التهجين لXist RNA جنبا إلى جنب مع المناعي من هيستون تعديل في كروموسوم X-التعطيل
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.