يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الكمي من الظواهر في الوجهية القيطم

9.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52062

⸱

نوفمبر 6, 2014

 , 
1Biology Department, Virginia Commonwealth University

في هذه المقالة

ملخص

وقد تم تطوير طريقة لقياس حجم فموي وجهي وشكل الضفدع الأجنة المورق. في هذا البروتوكول، ويتم الجمع بين قياسات حجم التقليدية مع morphometrics الهندسية للسماح لتحليلات أكثر تطورا التنمية الوجهية والعيوب.

الملخص

أصبح القيطم أداة هامة لتشريح الآليات التي تحكم تطوير القحفي والعيوب. وهناك طريقة لقياس تطور الوجهية تسمح لتحليل أكثر دقة من الظواهر الوجهية على إلغاء مع المواد التي يمكن وراثيا أو جزيئيا التلاعب التعبير الجيني أو وظيفة البروتين. باستخدام اثنين من صور ثلاثية الأبعاد من رؤساء الجنينية، يتم قياس حجم الأبعاد التقليدية مثل فموي وجهي العرض والطول ويتميز بتصميم داخلي متطور. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام مقياس استدارة من فتحة الفم الجنينية لوصف شكل الفم. يتم تنفيذ morphometrics هندسية من هذه الصور ثنائية الأبعاد أيضا لتقديم وجهة نظر أكثر تعقيدا من التغيرات في شكل المنطقة الوجهية. يتم تعيين المعالم إلى نقاط محددة في المنطقة الوجهية ويتم إنشاؤها الإحداثيات. ويستخدم تحليل المكون الرئيسي للحد من إحداثيات تاريخية لمكونات المبدأ الذي يميز ثم العلاجالمجموعات. يتم عرض هذه النتائج على أنها مؤامرة مبعثر فيه الأفراد مع الأشكال الوجهية مماثلة العنقودية معا. ومن المفيد أيضا إجراء تحليل التمايز وظيفة، مقارنة إحصائية مواقف المعالم بين مجموعات العلاج اثنين. يتم عرض هذا التحليل على شبكة التحول حيث ينظر التغيرات في المركز التاريخي كما ناقلات. تم فرضه شبكة على هذه النواقل بحيث يتم عرض نمط تزييفها لإظهار حيث تغيرت مواقف تاريخية كبيرة. وتستند التغييرات في شكل تحليل التمايز وظيفة على مقياس إحصائي، وبالتالي يمكن تقييمها من قبل ذات القيمة ص. هذا التحليل هو بسيط ويمكن الوصول إليها، والتي تتطلب فقط المجسام والبرامج مجانية، وبالتالي سيكون البحث والتدريس المورد الثمين.

المقدمة

من بين الأنواع الأكثر انتشارا وتدميرا من العيوب الخلقية الإنسان هي تلك التي تؤثر على الفم والوجه، مثل الشقوق الوجهية 1. الأطفال الذين يعانون من الهياكل الوجهية تالف الخضوع لعمليات جراحية متعددة طوال حياتهم والنضال مع تشوهات الوجه، والكلام والسمع ومشاكل تناول الطعام. وبالتالي، تسهيل البحوث العلمية الجديدة في تطوير والقحف الوجهية أمر بالغ الأهمية للوقاية والعلاج من هذه الأنواع من العيوب الخلقية في الإنسان. وقد برز القيطم المورق كأداة جديدة لتشريح الآليات التي تحكم تطوير القحفي (تشمل بعض الأمثلة 2،3،4 -11). وبالتالي، يمكن لطريقة الكمي لتحليل حجم وشكل التغييرات خلال تنمية الرأس والوجه من هذا النوع أن تكون قوية جدا 3.

هنا، نقدم مثل هذا الأسلوب. الجمع بين القياسات التقليدية الحجم مع morphometrics الهندسية مقتبسة من دراسة القيطم 12 وثروة من الدراسات تحليل شكل الوجه البشري 13-15. الهدف من هذا البروتوكول هو السماح للباحثين لقياس حجم الوجه وأشكال التمييز بين الظواهر الوجهية المختلفة أثناء التطور العادية وغير العادية. وهذا التحليل يسمح للتمايز بين أفضل العيوب القحفي خفية مثل تلك الناشئة عن الآثار المستمرة للجينات و / أو العوامل البيئية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا الأسلوب الكمي أيضا تكشف حتى تحسن طفيف أو إنقاذ عيب فموي وجهي. وبالتالي هذا يجعله دليلا مفيدا في تحليل العلاجات المحتملة.

مزيج من قياسات الوجه وmorphometrics الهندسية التي نقدمها هنا يسمح للتحليل الإحصائي أشمل من كل من حجم وشكل المنطقة الوجهية من البروتوكولات الحالية التي تستخدم إلى حد كبير واحد فقط أو 15-18 الآخرين. وعلاوة على ذلك، فإننا نقدم طريقة بسيطة لتقييم كل من الإنسي والجانبية للطائراتوجه دون الحاجة إلى معدات التصوير المتطورة ثلاثية الأبعاد المستخدمة في الدراسات الحالية 13،19.

نحن لشرح هذا البروتوكول على القيطم المورق الأجنة تعامل مع مثبط مستقبلات حمض الريتينويك أن يدفع تنمية الوجهية غير طبيعية والحنك المشقوق متوسط ​​2،3. وقد كشفت الكمي لأبعاد وشكل المنطقة الوجهية في هذه الأجنة التغيرات في midface التي هي مماثلة للبشر مع الشقوق الحنكية مماثلة ونماذج الماوس 20،21. ومع ذلك، فإن هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتقييم آثار المركبات الأخرى على التنمية الوجهية مثل المواد الطبيعية، ومبيدات الأعشاب، أو بروتينات مثل عوامل النمو. وعلاوة على ذلك، حجم وشكل التغييرات الوجهية الناجمة عن اضطراب في التعبير الجيني عن طريق الخسارة أو الربح من التجارب وظيفة (باستخدام morpholinos العقاقير أو Crispers / Talens) كما يمكن كميا باستخدام هذا البروتوكول. أخيرا، قمنا بتطوير هذه الطريقة specificaLLY لتقييم القيطم التشكل. ومع ذلك، يتم تعديله بسهولة لتحليل أي الفقاريات. ويمكن أن تشمل أيضا تطبيقات أخرى باستخدام هذا البروتوكول لمقارنة وثيقي الصلة للدراسات تطورية أو بيئية. في حين أن المثال نحن نقدم هنا يستخدم هذا البروتوكول لوصف تحليل المنطقة الوجهية، يمكن بسهولة تعديله لتحليل مناطق أخرى، أجهزة، أو الهياكل.

وهذا البروتوكول الكمي فموي وجهي أصبح مصدرا قيما للمجتمع البحوث، وكذلك أداة تعليمية ممتازة للطلاب الجامعيين كدليل الفيديو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تمت الموافقة على جميع التجارب التي أجريت باستخدام القيطم المورق من قبل IACUC (بروتوكول # AD20261).

1. إعداد الكواشف والمواد المطلوبة

  1. الكواشف:
    1. جعل 1 لتر من 10X MBS (المالحة تعديل بارت) حل 22. إضافة كلوريد الصوديوم (880 ملم)، وبوكل (10 ملم)، MgSO 4 (10 ملم)، HEPES (50 ملي، ودرجة الحموضة 7.8)، وNaHCO 3 (25 ملم) إلى 1 لتر من الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة إلى 7.8 مع هيدروكسيد الصوديوم.
    2. جعل 1 لتر من 1X MBS عن طريق تمييع 100 مل من 10X MBS حل في 900 مل من الماء المقطر. إضافة 0.7 مل من 1 M CaCl 2 الحل.
    3. جعل 1 لتر من 0.1X MBS عن طريق تمييع 100 مل من محلول 1X MBS في 900 مل من الماء المقطر. ل1 لتر من 0.1X MBS حل، إضافة 1 مل من 10 ملغ / مل حل الجنتاميسين للاستخدام في الثقافة الجنين.
    4. جعل MBS عالية الملح عن طريق إذابة 4 مل من 5 M كلوريد الصوديوم في 100 مل من 10X MBS. ثم إضافة الماء المقطر حتى الحجم الكلي هو 1 L.
    5. جعل 70٪ من الإيثانول عن طريق تمييع 100٪ هthanol إلى 70٪ من الإيثانول باستخدام الماء المقطر.
    6. جعل BMS-543 عن طريق إعداد محلول المخزون 10 ملي في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO).
    7. جعل بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) وذلك بإضافة 4 جم من مسحوق امتصاص العرق إلى 50 مل من الماء المقطر. الحرارة على طبق ساخن لحوالي 65 درجة مئوية، وعند هذه النقطة إضافة 5 M هيدروكسيد الصوديوم قطرة من الحكمة حتى يزيل الحل.
      1. مرة واحدة يزيل الحل، وإزالة من الحرارة وإضافة 50 مل 2X PBS و 100 ميكرولتر توين-20. السماح لتبرد لRT على الجليد. ضبط درجة الحموضة ما بين 7.2 و 7.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك.
    8. جعل الفوسفات مخزنة محلول ملحي مع توين (PBT) عن طريق إذابة 8 جم كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام بوكل، 1.44 غرام من نا 2 هبو 4 و 0.24 غرام من KH 2 PO 4 في 800 مل من الماء المقطر. باستخدام حمض الهيدروكلوريك، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4. إضافة 2 مل من توين-20. ضبط الحجم النهائي مع الماء المقطر ليساوي 1 L.
    9. جعل حل السيستين عن طريق إذابة 1 غرام من السيستين في 50 مل من الماء المقطر أو 0.1X MBS. إضافة 1.5 مل من هيدروكسيد الصوديوم 5 M لالثانية ضبط درجة الحموضة إلى 7.8.
    10. جعل 10٪ بنزوكاين حل سهم من خلال إضافة 10 غرام من مسحوق بنزوكاين إلى 100 مل 100٪ ETOH. القتل الرحيم لمن الذكور البالغين والأجنة جاهزة للتثبيت، وتمييع للحل 0.05٪.
    11. تقديم حلول التخزين الخصيتين وذلك بإضافة 1 مل من مصل العجل إلى 9 مل من العازلة L15.
  2. أدوات والمعدات المطلوبة:
    1. الحصول على المعدات المدرجة في جدول المواد والمعدات، كما هو موضح في الشكل رقم 1.
    2. تعديل اداة ماصة. وضع غيض من الزجاج ماصة باستور في اللهب من موقد بنسن. تدوير غيض ماصة حتى يذوب ويشكل نهاية مختومة مدورة.
    3. تتسطح النمذجة الطين في قاع طبق بتري البلاستيك، وتذليل لتغطية لوحة كاملة (أي حجم يمكن استخدامها) (الشكل 1Aiv).
      1. اضغط برفق إبرة مستقيمة إغاظة في طبق مبطنة الطين في زاوية 45 درجة. عقد إبرة هناك، وببطء تحريك بيتريطبق أفقيا لإنشاء خط الاكتئاب (الشكل 1Bi). تكرار للعدد المطلوب من الصفوف.
      2. استخدام نهاية أداة الزجاج ماصة لجعل الضحلة، منخفضات دائرية في كل صف من طبق مبطنة الطين لوضع رؤساء الجنين (الشكل 1Bii) والمساعدة في تنظيم الأجنة في حين التصوير.
      3. للتصوير الفوتوغرافي، وملء الطبق مع PBT (الشكل 1Biii). بين الاستخدامات، ويغسل جيدا في طبق وسطح الطين مع الماء المعقم، تليها 70٪ من الإيثانول.

2. القيطم المورق الأجنة الثقافة والمانع العلاجات

  1. التخصيب في المختبر وثقافة البيض القيطم:
    1. الحصول على وثقافة القيطم المورق أجنة باستخدام معيار نشرت وسائل 22،23.
    2. باختصار، الموت ببطء ذكر بالغ من قبل الانغمار في حل بنزوكاين 0.05٪. تشريح الخصيتين وتخزينها في المخزن التخزين الخصيتين. حقنالإناث البالغات مع موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (HCG)، وجمع البيض في MBS عالية الملح، وإخصاب في المختبر مع الخصيتين تشريح (الشكل 2A، B).
    3. الأجنة الثقافة في 0.1X MBS عند 15 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى المرحلة المطلوبة (مرحلة الأجنة وفقا للجدول عادي من القيطم المورق من قبل Nieuwkoop وفابر 24،25).
      1. هنا، ثقافة الأجنة حتى المرحلة 22 (24 ساعة بعد الإخصاب (HPF))، وإزالة الغشاء المحي تحت stereomicroscope باستخدام اثنين من أزواج من ملقط شحذ. نقل الأجنة مع المعيار، يمكن التخلص منها نقل ماصة لطبق بيتري نظيفة (100 ملم في القطر) التي تحتوي على 30-40 مل من 0.1X MBS.
  2. العلاج المانع للأجنة القيطم (موضح في الشكل 2):
    1. ملء الآبار اللازمة من صحن الثقافة 24-جيدا مع 1 مل من 0.1X MBS باستخدام ماصة رجل واحد معايرة. ترسيم خارج جيدا مع علامة نقطة غرامةإيه (الشكل 2D، أقحم). استخدام علامة تسمية أيضا محتويات تضاف إلى كل بئر على 24 طبق جيدا الثقافة الغطاء. نسخ هذه المعلومات على صفحة انشاء 24 بئر في دفتر المختبر.
    2. نقل الأجنة 5-10 في كل بئر باستخدام المعيار، يمكن التخلص منها نقل ماصة (الشكل 2C). وضع نفس العدد من الأجنة في كل بئر.
    3. أعلى الصفحة أعلى أو إزالة MBS 0.1X بحيث يكون مستوى مع 1 مل خط ملحوظ (الشكل 2D). إضافة حجم مناسب من DMSO (بحيث الحجم النهائي من DMSO هو 1٪) ودوامة بلطف. يجب الحرص على عدم إضافة DMSO قريبة جدا من الأجنة، وتجنب الاتصال من الأجنة مع سطح المخزن المؤقت.
    4. إضافة كمية مناسبة من المواد الكيميائية إلى الآبار المعينة ودوامة بلطف مرة أخرى. هنا، إضافة 1 ميكرولتر من 10 ملي BMS-453 (حمض الريتينويك مستقبلات) و 9 ميكرولتر من DMSO إلى 1 مل من 0.1X MBS.
    5. إذا كانت المادة الكيميائية الخفيفة حساسة، والتفاف فضفاضة طريق مسدودطبق البنية في رقائق الألومنيوم. ثقافة الأجنة في الحاضنة 15 درجة مئوية حتى المرحلة المرغوبة. في هذا المثال، لعلاج الأجنة 16-18 ساعة.
  3. غسل الأجنة من العلاج وحتى مراحل تربية الشرغوف:
    1. إزالة نصف إلى ثلاثة أرباع حل مع ماصة نقل القابل للتصرف. يجب الحرص على عدم تعكير صفو الأجنة. باستخدام ماصة نقل جديدة، وإعادة ملء البئر مع 0.1X MBS. كرر هذه 3-6 مرات.
    2. نقل الأجنة إلى طبق بتري كبير (150 ملم في القطر) تحتوي على 100 مل من 0.1X MBS مع الجنتاميسين (1 مل / لتر). احتضان الأجنة عند 15 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة 42-45 (82-100 HPF).
    3. تغيير MBS 0.1X محلول يحتوي على جنتاميسين يوميا، وإزالة الأجنة الميتة على الفور لمنع التلوث أو وفاة الأجنة الأخرى. تسجيل عدد من الأجنة الميتة في دفتر المختبر.
  4. تحديد الأجنة في بارافورمالدهيد (PFA):
    1. إصلاح الأجنة بين المراحل 42 و 45 (82 و 100HPF، على التوالي) من خلال نقلهم في طبق ثقافة 24 بئر جديدة تحتوي على 1-2 مل من MBS 0.1X. تسمية غطاء مع نفس المعلومات كما وصف العلاج انشاء اعلاه (القسم 2.2.1).
    2. إزالة أكبر قدر ممكن من MBS 0.1X من كل جانب ممكن، في حين لا تزال تترك الأجنة مغطاة وضمان الحد الأدنى من الاتصال لمنع الإصابة. إضافة 1-2 مل من 0.05٪ بنزوكاين في حل 0.1X MBS واحتضان حتى الأجنة لم تعد تستجيب للمؤثرات.
    3. إضافة 1-2 مل من 4٪ PFA. بدلا من ذلك، وضع الأجنة في أنابيب microcentrifuge المسمى لتثبيت، إذا كان يفضل.
    4. احتضان الأجنة في منهاج العمل لمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية على شاكر الدورية. إزالة PFA عن طريق أداء 3-4 يغسل مع PBT على مدى فترة 3-5 ساعة.

3. تصوير المنطقة الوجهية من الشراغف القيطم

  1. إعداد قبل التصوير (هذا هو موضح في الشكل 3):
    1. وضع الأجنة ثابتة في طبق بتري كبير (150مم في القطر) التي تحتوي على ما يقرب من 100 مل من PBT.
    2. جعل اثنين من الشقوق بقطع الرأس عن الجسم (الشكل 3A، خطوط سوداء صلبة). أولا، مع الاستمرار على الجنين مع زوج من ملقط وجعل شق على الجانب الخلفي من القناة الهضمية مع مشرط معقم (الشكل 3B). جعل الشق الثاني على الجانب الأمامي من القناة الهضمية، بالقرب من القلب، لإزالة الرأس (الشكل 3C).
    3. قطع ماصة رؤساء الجنين في طبق مبطنة الطين (الجزء 1.2.2) باستخدام المعيار، يمكن التخلص منها نقل ماصة.
      1. لمشاهدة الأمامية، استخدام اثنين من أزواج من الملقط لوضع رؤساء الجنين الجانب الخلفي أسفل داخل منخفضات دائرية. باستخدام ملقط للتلاعب كل من رأس الجنين والطين المحيطة بها، والأجنة الموقف بحيث أنهم يواجهون الكاميرا، ولا يميل إلى الخلف أو إلى أي من الجانبين (الشكل 3D). دفع بلطف الطين المحيطة حول الرأس باستخدام ملقط و / أو الزجاجأداة ماصة لتأمين الرأس في المكان.
      2. لمشاهدة الجانبية، واستخدام الملقط لوضع رؤساء الجنين داخل المنخفضات الدائرية بحيث تكون على جانبها، تواجه نفس الاتجاه، وتكون مسطحة على الملاعب الرملية. التلاعب الرأس الجنين والطين المحيطة بحيث يتم وضع الغدد الاسمنت من جميع الأجنة الهبوط في نفس الزاوية (الشكل 3E). استخدام الصفوف تعادل مع الإبرة إغاظة كدليل لضمان الدقة عند أخذ القياسات الجانبية.
  2. التقاط الصور من الرأس الشرغوف:
    1. تصوير رئيس الشرغوف باستخدام أي تشريح المجهر مع الكاميرا الرقمية المرفقة وبرنامج الكاميرا المقابلة. استخدام أعلى التكبير التي يمكن أن تبقى ثابتة لجميع الأجنة.
    2. تركز الأجنة ومواجهتها جميعا في نفس الاتجاه. التقاط الصور باستخدام أفضل ظروف الإضاءة التي تسمح للصورة أدق من المنطقة الوجهية. موقفأضواء لتجنب الظلال الزائدة. حفظ الصور كما .tiff الملفات مع أعلى دقة ممكنة.

4. قياس وتحليل الوجه الأبعاد الحجم في الشراغف القيطم

  1. قياس أبعاد الوجهية (ملخصة في الشكل 4):
    1. تحديد عرض الوجه. تحديد النقاط التي الجزء البطني من كل عين يجتمع أطرافها من الوجه (الشكل 4A، السهام)، وقياس المسافة بين هذه النقاط (الشكل 4A، خط أحمر).
    2. تحديد ارتفاع الوجه. أولا، تحدد خط الوسط عن طريق قياس المسافة بين كل عين واحتساب علامة منتصف الطريق. المقبل، ورسم الخطوط الأفقية التي تميز معظم الظهرية حواف العينين وظهري معظم نقطة للغدة الاسمنت (الشكل 4B، وخطوط بيضاء). في خط الوسط، وقياس المسافة بين الخطوط الأفقية (الشكل 4B، خط أحمر).
    3. تحديد رانه منطقة الوجهية. استخدام نفس خطوط أفقية بمناسبة حواف الظهرية من العين والغدة الاسمنت لتوجيه قياس المساحة (الشكل 4C، وخطوط بيضاء). تبدأ عند النقطة التي الخط الأفقي بمناسبة رأس الغدة الأسمنت يلبي هامش الجانب الأيسر من الوجه (الشكل 4Ca).
      1. تتبع على طول حافة مواجهة شاملة العين حتى نقطة حيث الخط الأفقي بمناسبة رأس العين يلتقي محيط الوجه (الشكل 4Cb). مواصلة تعقب على طول هذا الخط الأفقي ظهري معظم حتى النقطة التي يلتقي هامش الجانب الأيمن من الوجه (الشكل 4CC).
      2. تتبع نزولا على طول حافة مواجهة شاملة العين حتى نقطة حيث بطني خط أفقي الأكثر بمناسبة رأس الغدة الأسمنت يلبي هامش الجانب الأيمن من الوجه (الشكل 4CD). مواصلة تعقب على طول هذا الخط السفلي الاتحاد الوطني للعمال الأفقيايل تجتمع النقطة التي بدأ البحث عن المفقودين. استخدام برامج تحرير الصور لحساب مساحة داخل تتبع.
    4. تحديد طول الخطم. على الصور الجانبية، وجعل الخط العمودي الذي يمثل الجزء الأمامي من العين. المقبل، وقياس المسافة الأفقية من معظم نقطة الأمامية حيث يلتقي وجها حافة الظهري للغدة الاسمنت إلى الخط العمودي بمناسبة الأمامي من العين (الشكل 4D).
    5. تحديد عرض الفم. قياس المسافة الأفقية بين النقاط الأيمن والأيسر حيث العلوية والسفلية "الشفاه" لفتح الفم لقاء (الشكل 4E). ويمكن اعتبار هذه يعادل ضفدع من الملتقيات الشفوية.
    6. تحديد استدارة الفم. حساب الفم الاستدارة باعتبارها نسبة الارتفاع عكسية حيث (4   ×   [مساحة]) / (π   ×   [المحور الرئيسي] (2) >).
      1. استخدام أداة لاسو في صورة محرر لتتبع حواف فتحة الفم كما هو مبين في الشكل 4F. حدد تحليل في شريط الأدوات الرئيسي، واختيار قياس. بدلا من ذلك، وحساب استدارة من قياس المنطقة وقطر فتحة الفم.
  2. تحليل البيانات من أبعاد الوجه:
    1. إدخال قياسات أبعاد الوجه في برنامج تحليل البيانات للمقارنة بين مجموعة العلاج مع السيطرة. تحديد متوسط ​​كل قياس لكلا المجموعتين التجريبية والضابطة لخلق الرسوم البيانية. تحديد الانحراف المعياري من أجل إنشاء أشرطة الخطأ. أداء تي اختبارات الطالب لمقارنة إحصائية المجموعات.
      ملاحظة: هذه البيانات يمكن أن يكون متغير تماما نظرا لمعدلات مختلفة قليلا التنمية بين الأجنة.

5. التحليل الكمي من الوجهية الشكل وMorphometrics

  1. معالم المكان وبجمعية العقاراتالشركة المصرية للاتصالات معلما تنسيق ملف (موضح في الشكل 5A).
    1. اختيار معالم تلك التي كانت التقاط شكل صورة الهدف، ويمكن وضعها مرارا وتكرارا في نفس الموقع النسبي في جميع العينات التي تم تحليلها. حالة عدم وجود هيكل في جميع العينات، لا تضع علامة بارزة على هذا الهيكل.
      1. هنا، ضع 24 المعالم لتمثيل midface مع علامات مميزة مثل العيون والأنف والفم. من أجل التناسق، معالم المكان في منتصف الطريق بين المعالم وضعت سابقا (على سبيل المثال، معالم الفم، الشكل 5Ai).
    2. التقاط الإحداثيات معلما وخلق "معلما تنسيق الملف". فتح الصورة الأولى لمواجهة الشرغوف (على سبيل المثال، أول السيطرة الجنين).
      1. حدد علامة التبويب الإضافات على شريط الأدوات الرئيسي واختيار Pointpicker من القائمة المنسدلة. حدد معالم التبويب إضافة نقاط وضعها في الأماكن المطلوبة كما المعالم ستظهر كما الصلبان متعددة الألوان ( الشكل 5Ai).
      2. الانتقال مواقع تاريخية بعد التنسيب من خلال اختيار الأداة الصلبان نقل. عندما وضعت كل المعالم في الصورة، حدد علامة التبويب عرض النتائج على شريط الأدوات الرئيسي واختر إظهار (الشكل 5Aii) لعرض الإحداثيات معلما ونسخها في برنامج جداول البيانات (الشكل 5Aiii).
      3. عند لصق هذه الإحداثيات من هذا الجنين الأول في برنامج جداول البيانات، وترك صف فارغ فوق البيانات. في العمود B من هذا الصف الفارغ (الصف 1)، نوع "LM =" مع عدد من المعالم في العينة. هنا، أدخل "LM = 24" منذ تم إنشاؤها 24 معالم (الشكل 5Aiii، مربع أحمر).
      4. في الصف أقل من نقاط البيانات، اكتب "ID =" مع تحديد اسم العينة. هنا في الشكل 5Aiii، أدخل "ID = CON1" لأن هذا هو المعلم تنسيق البيانات للسيطرة أول جنين (الشكل 5Aiii، السهم الأحمر).
        5. كرر هذه العملية مع وجوه من كل جنين في التجربة (التجارب والضوابط) حتى يتم إدخال جميع إحداثيات معلما في جدول البيانات.
        ملاحظة: من المهم أن كل جنين يعطى اسما فريدا في "ID =" صف واحد. هنا على سبيل المثال، يتم إعطاء المجموعة التالية من الإحداثيات معلما معرف "CON2" لأنه كان الجنين الثاني في المجموعة الضابطة.
      5. نسخ الأعمدة الثانية والثالثة كلها في نص الوثيقة وحفظها كملف .txt.
  2. إعداد برنامج حاسوبي لتحليل البيانات المظهرية (موضح في الشكل 5B).
    1. هنا، حدد إنشاء مجموعة بيانات جديدة في القائمة الرئيسية في البرنامج المظهرية. اسم الملف والبيانات المنصوص عليها في المربعات المناسبة (على سبيل المثال، "حمض الريتينويك المنع" و "معالم الوجه"، على التوالي) في المنبثقة الشاشة (الشكل 5Bi). استيراد الملف كملف TPS، وSELإلخ ملف نص الإحداثيات لإنشاء مجموعة البيانات (الشكل 5Bi، السهم الأحمر).
    2. محاذاة البيانات وبروكرست صالح:
      1. أداء نوبة بروكرست والمحاذاة. تسليط الضوء على البيانات المنصوص عليها في التبويب شجرة مشروع، واختيار التمهيدات على شريط الأدوات الرئيسي، ونيو بروكرست صالح في القائمة المنسدلة.
      2. اختر محاذاة من قبل المحور الرئيسي وحدد تنفيذ بروكرست صالح في الجزء السفلي من مربع (الشكل 5Bii، السهم الأحمر). العودة إلى التمهيدات القائمة المنسدلة، حدد توليد مصفوفة التغاير (الشكل 5Biii)، واختر تنفيذ.
      3. عرض الارتباطات مصفوفة التغاير في علامة التبويب نتائج.
    3. إنشاء "ملف المصنف" عن طريق تعيين كل عينة في مجموعة البيانات لمتغير المصنف المناسب للتمييز سواء كان ينتمي في المجموعة التجريبية أو المجموعة الضابطة.
      1. تسمية عمودين في جدول بيانات. تسمية رأس كولوم الأولن مع "ID" والمدخلات في نفس معرف تعطى لكل عينة (على سبيل المثال، CON1، RARINHIB1، وهلم جرا. 5Biv الشكل). تسمية رأس العمود الثاني مع "المعاملة" ومساهمة في كل خلية مجموعة العلاج الذي يتوافق مع عينة المدرجة في الخلية معرف المجاورة.
      2. هنا، استخدام تسميات "السيطرة وRAR مثبط" على المصنفات (الشكل 5Biv). نسخ في ملف نصي وحفظه كملف .txt. المتغيرات استيراد مصنف في برنامج حاسوبي المظهرية. اختيار المباراة من قبل معرف، وفتح ملف نصي (الشكل 5Bv).
  3. إنشاء تحليل المكون الرئيسي (PCA) مؤامرة مبعثر عن طريق اختيار القائمة المنسدلة التغيير واختيار مدير تحليل المكون (الشكل 6Ai). بعد ذلك، حدد علامة التبويب الرسومات لرؤية ثلاث علامات تبويب إضافية: تغيير شكل الكمبيوتر، والقيم الذاتية، وعشرات PC (الشكل 6Aii). تعرض علامة التبويب عشرات PC وبivariate الرئيسية مخطط التشتت المكون من بروكرست بيانات تاريخية تناسب (الشكل 6Aii).
    1. لتغيير التي يتم رسم المكونات الرئيسية، وإظهار القائمة المنبثقة في الفضاء مؤامرة وحدد محور المطلوب لتغيير (الشكل 6Aiii، السهم الأحمر).
    2. حدد نقاط بيانات أداة اللون (الشكل 6Aiii). اختر المصنفات المستوردة سابقا (القسم 5.2.2) في القائمة المنبثقة التي تظهر الثانية لتحديد لون لكل فئة (الشكل 6Aiv).
    3. عرض مقدار التباين استولت عليها كل مكون رئيسي في علامة التبويب نتائج (الشكل 6Av). الرسم البياني تصدير كملف. BMP.
  4. إنشاء وظيفة تحليل التمايز (DFA) شبكة التحول في البرنامج المظهرية باختيار تحليل التمايز وظيفة تحت علامة التبويب القارن (الشكل 6Bi). في القائمة المنبثقة، تأكد من أن مجموعة البيانات المناسب هو SELECTED ونوع البيانات هو الإحداثيات بروكرست-مناسبة.
    1. تسليط الضوء على أزواج من المجموعات أن تقارن، وتشغيل 1000 اختبارات التقليب (الشكل 6Bii).
    2. تحت الرسومات، عرض خريطة متجه للإحداثيات في علامة التبويب الفرق الشكل (الشكل 6Biii). إذا كانت الصورة معكوسة، إظهار القائمة المنبثقة في الفضاء مؤامرة لقلب الرسم في الاتجاه الصحيح (الشكل 6Biii).
    3. اتجاه ناقلات يعكس اختلاف شكل من المجموعة الأولى بالمقارنة مع الثانية، والتي يتم عرضها في القائمة وظيفة التمايز قبل إلى تشغيل تحليل (الشكل 6Bii). لعكس اتجاه ناقلات، إظهار القائمة المنبثقة في الفضاء المؤامرة وتغيير علامة على عامل الحجم بحيث يكون سلبيا (الشكل 6Biii، والرابع). يتم تعيين القيمة قيمة النطاق إلى عامل من أفضل عشرة التي تمثل فروق ذات دلالة إحصائية في موقف تاريخي بين:ن المجموعتين دون تحريف، وعادة ما يتم ترك في الافتراضي (الشكل 6Biv).
    4. أيضا في القائمة المنبثقة، تغيير الرسم البياني لشبكة التحول إلى ركب ناقلات على شبكة (الشكل 6Biii، والخامس).
    5. تحديد عدد الخطوط الأفقية والرأسية للشبكة في القائمة المنبثقة (الشكل 6Biii، والخامس).
    6. تصدير الرسم كملف. BMP.
    7. عرض بروكرست وMahalinobis المسافات والقيم ص تحت علامة التبويب نتائج (الشكل 6Bvi).
  5. التحليلات المورفولوجية الإضافية التي هي مفيدة لتقييم مجموعة العلاج أكثر من واحد
    1. إنشاء عنصر التحول الرئيسية تحليل الشبكة. وشكل الكمبيوتر تغييرات التبويب يعرض خريطة متجه يتغير شكل يمثل التباين داخل كل مجموعة عينة. استخدام القائمة المنبثقة في منطقة مؤامرة لتوجيه الصورة بشكل صحيح ويطغى على شبكة ناقلات التحول. ضبط عامل مقياسإلى القيمة على المحور السيني من الرسم البياني عشرات PC المتوافق مع مركز التقديرية للمجموعة المراقبة. تصدير الصورة كملف. BMP.
    2. إنشاء مخطط التشتت CVA. تحت علامة التبويب مقارنة على شريط الأدوات الرئيسي، حدد الكنسي تحليل VARIATE، وتسليط الضوء على مجموعة متغيرة المصنف التي تم استيرادها سابقا (انظر القسم 5.2.3). حدد 1000 التكرارات للاختبارات التقليب، ثم اختر تنفيذ. حدد علامة التبويب عشرات CV لعرض CVA مخطط التشتت ثنائي المتغيرات. ومن ونا مميزا هذا بناء على المصنفات التي تم تحميلها. تغيير نظام الألوان من خلال تنشئة القائمة المنبثقة في الفضاء مؤامرة (انظر القسم 5.3.3). تصدير كملف. BMP.
    3. إنشاء شبكة التحول CVA. يمكن إنشاء شبكة تحويل نتائج CVA عند المقارنة بين أكثر من فريقين. ضمن علامة التبويب الرسومات، واختيار يتغير شكل السيرة الذاتية لتصور شبكة تحويل الإحداثيات معلما. إظهار قائمة منبثقة في الفضاء مؤامرة لتغييراتجاه متجه، ركب النتائج على شبكة التحول، وتحديد عدد خطوط الشبكة. تصدير الرسم كملف. BMP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هنا، وقد أظهر تحليل كمي لحجم وشكل فموي وجهي لمقارنة الأجنة تعامل مع مستقبلات حمض الريتينويك المانع (RAR المانع) لضوابط غير المعالجة. وعولج الأجنة مع تركيز 1 ميكرومتر من هذا المانع الكيميائية من المرحلة 24 إلي 30 (26-35 HPF)، جرفت، وثابتة في المرحلة 42 (82 HPF). ثم تم معالجتها وتحليلها كما هو موضح في البروتوكول. النتائج هي البيانات الأصلية، ولكن بما يتفق مع الملاحظات في المنشورات السابقة 2،3. وعولج الأجنة السيطرة مع السيارة، DMSO، وتطورت بشكل طبيعي (الشكل 7Ai وال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أصبح القيطم المورق أداة مفيدة لتشريح آليات تطوير الوجهية التنموية الأساسية. ومع ذلك، هناك حاليا أي بروتوكولات واصفا حجم وشكل التغييرات في هذه المنطقة في الضفادع. فإن الطريقة الموصوفة هنا تسهم إسهاما كبيرا في مجال التنمية الوجهية عن طريق السماح للالكمي أكثر صرامة من الظواهر الوجهية في القيطم والفقاريات الأخرى.

أول جانبا، أهم من تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح هو القدرة على قياس أبعاد الوجه وتحديد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

دعمت بدء الأموال إلى A. ديكنسون من جامعة فرجينيا كومنولث في هذا العمل.

الكتاب نود أن نعترف دان Nacu لموهبته الفنية في خلق الشكل التخطيطي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
تشريح المجهرZeissمزود بكاميرا AxioCamICC1
Dumont # 5 ملقط Inoxأدوات العلومالدقيقة 11251-10
مشرط معقم يمكن التخلصمنه Sklar06-2015
صفيحة 24 بئراماصات087721
يمكن التخلصفيشر Scientific13-711-7M
150 مم × 15 مم أطباق بتريFalcon351058
حاضناتEctothermمضبوطة على 15 درجة ؛ C أو 20 درجة ؛ C
نمذجة الطينPremo ، أو غيرها من طين النمذجة غير السامباللون الأسود أو الأبيض
مجتذب الإبرة: P-97 شعيرة مجتذب الماصات الدقيقة المشتعلة: FB300Bبالنسبة للخيوط ، استخدم خيوط صندوق مربعة مقاس 3.00 مم ، بعرض 3.0 مم.
PipettemenGilsonF144802 ، F123600 ، F123602
BMS-453Tocris3409
DMSOAmerican BioanalysisAB00435-01000
CysteineSigma-Aldrich52-90-4
مسحوق بارافورمالدهيدSigma-Aldrich158127
أطباق PetriFalcom353003 ، 351058قطر 100 مم وقطر 150 مم
100٪ إيثانولVWR89125-170
نقل قياسية منها إبرة إغاظة مستقيمة Thermo Scientific 19010 أنابيب شعرية (للإبر) FHC 30-30-1 Borosil 1.0 مم OD × 0.5 مم ID / الألياف ، 100 مم لكل مجتذب إبرة ، موديل P-97 Sutter Instrument Co.

المراجع

  1. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
  2. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev Biol. 365, 229-240 (2012).
  3. Kennedy, A. E., Dickinson, A. J. Quantitative Analysis of Orofacial Development and Median Clefts in Xenopus Laevis. Anat Rec (Hoboken). , (2014).
  4. Dickinson, A., Sive, H. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Semin Cell Dev Biol. 18, 525-533 (2007).
  5. Dickinson, A. J., Sive, H. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev Biol. 295, 700-713 (2006).
  6. Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Development. 136, 1071-1081 (2009).
  7. Barnett, C., et al. Syndrome Transcription Factor is critical for neural crest cell function in Xenopus laevis. Mech Dev. 129, 324-338 (2012).
  8. Gonzales, B., Yang, H., Henning, D., Valdez, B. C. Cloning and functional characterization of the Xenopus orthologue of the Treacher Collins syndrome (TCOF1) gene product. Gene. 359, 73-80 (2005).
  9. Reisoli, E., De Lucchini, S., Nardi, I., Ori, M. Serotonin 2B receptor signaling is required for craniofacial morphogenesis and jaw joint formation in Xenopus. Development. 137, 2927-2937 (2010).
  10. Schuff, M., et al. FoxN3 is required for craniofacial and eye development of Xenopus laevis. Dev Dyn. 236, 226-239 (2007).
  11. Slater, B. J., Liu, K. J., Kwan, M. D., Quarto, N., Longaker, M. T. Cranial osteogenesis and suture morphology in Xenopus laevis: a unique model system for studying craniofacial development. PLoS One. 4, (2009).
  12. Vandenberg, L. N., Adams, D. S., Levin, M. Normalized shape and location of perturbed craniofacial structures in the Xenopus tadpole reveal an innate ability to achieve correct morphology. Dev Dyn. 241, 863-878 (2012).
  13. Bugaighis, I., Mattick, C. R., Tiddeman, B., Hobson, R. 3D Facial Morphometry in Children with Oral Clefts. Cleft Palate Craniofac J. , (2013).
  14. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 12, 519-524 (2001).
  15. Scheuer, H. A., Holtje, W. J., Hasund, A., Pfeifer, G. Prognosis of facial growth in patients with unilateral complete clefts of the lip, alveolus and palate. J Craniomaxillofac Surg. 29, 198-204 (2001).
  16. Parsons, K. J., Andreeva, V., James Cooper, W., Yelick, P. C., Craig Albertson, R. Morphogenesis of the zebrafish jaw: development beyond the embryo. Methods Cell Biol. 101, 225-248 (2011).
  17. Farkas, L. G., Katic, M. J., Forrest, C. R. Surface anatomy of the face in Down's syndrome: age-related changes of anthropometric proportion indices in the craniofacial regions. J Craniofac Surg. 13, 368-374 (2002).
  18. Cooper, W. J., et al. Bentho-pelagic divergence of cichlid feeding architecture was prodigious and consistent during multiple adaptive radiations within African rift-lakes. PLoS One. 5, (2010).
  19. Klingenberg, C. P., et al. Prenatal alcohol exposure alters the patterns of facial asymmetry. Alcohol. 44, 649-657 (2010).
  20. Zhao, Y., et al. Isolated cleft palate in mice with a targeted mutation of the LIM homeobox gene lhx8. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 15002-15006 (1999).
  21. Allam, K. A., et al. The spectrum of median craniofacial dysplasia. Plast Reconstr Surg. , 812-821 (2011).
  22. Sive, H. L., Grainger, R., Harlard, R. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  23. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. (1967).
  25. Nieuwkoop, P. D. aF. J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metamorphosis. , Garland Publishing Inc. (1994).
  26. Abdi, H., Williams, L. J. Principal Component Analysis. WIREs Computational Statistics. 2, (2010).
  27. Hill, T. L. P. STATISTICS: Methods and Applications. , StatSoft, Inc. Tulsa, OK. (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Xenopus
الكمي من الظواهر في الوجهية القيطم
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.