تم وصف بروتوكول تصنيع وتشغيل أجهزة إزالة الرطوبة الميدانية (Field-DW) ، بالإضافة إلى الدراسات الأولية لتأثيرات المجالات الكهربائية على محتويات القطرات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الاستفادة من انخفاض التفاعل الرذاذ على سطح لتحسين نقل Bioanalytes في علم الموائع الدقيق الرقمي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الموائع الدقيقة الرقمية (DMF) ، وهي تقنية لمعالجة القطرات ، هي بديل واعد لتطوير منصات "المختبر على الشريحة". في كثير من الأحيان ، تعتمد حركة القطرات على ترطيب السطح ، المرتبط مباشرة بتطبيق المجال الكهربائي. ومع ذلك ، فإن التفاعلات السطحية تجعل الحركة تعتمد على محتويات القطرات ، مما يحد من اتساع تطبيقات التقنية.
تم تقديم بعض البدائل لتقليل هذا الاعتماد. ومع ذلك ، فإنهم يعتمدون على إضافة أنواع كيميائية إضافية إلى القطرة أو محيطها ، والتي يمكن أن تتفاعل مع شقوق القطيرات. لمواجهة هذا التحدي ، طورت مجموعتنا مؤخرا أجهزة Field-DW للسماح بنقل الخلايا والبروتينات في DMF ، دون إضافات إضافية.
هنا، يتم توفير بروتوكول تصنيع الجهاز وتشغيله، بما في ذلك الواجهة الإلكترونية للتحكم في الحركة. نواصل أيضا الدراسات مع الأجهزة ، مما يدل على أنه يمكن أيضا نقل الكائنات الحية النموذجية متعددة الخلايا والكبيرة نسبيا ، ويمكن القول إنها لا تتأثر بالمجالات الكهربائية المطلوبة لتشغيل الجهاز.
المقدمة
التصغير من الأجهزة التي تعمل مع السوائل له أهمية قصوى لتطوير منصات "مختبر على رقاقة". في هذا الاتجاه، وقد شهدت خلال العقدين الماضيين تقدما كبيرا في مجال على microfluidics، مع مجموعة متنوعة من التطبيقات. 1-5 المتناقضة مع نقل السوائل في القنوات المغلقة (قناة على microfluidics)، DMF تعالج قطرات على صفائف من الأقطاب الكهربائية. واحدة من مزايا أكثر جاذبية من هذه التقنية هو عدم وجود أجزاء متحركة لنقل السوائل، وتوقف الحركة على الفور عن طريق إيقاف الإشارات الكهربائية.
ومع ذلك، حركة قطرات تعتمد على محتويات قطرة، وبالتأكيد خاصية غير مرغوب فيها للمنصة العالمية "مختبر على رقاقة". قطرات تحتوي على البروتينات والتحاليل الأخرى تلتصق بالأسطح الجهاز، تصبح غير قابلة للنقل. يمكن القول، وقد كان هذا هو القيد الرئيسي لتوسيع نطاق التطبيقات DMF، 6-8وتشمل بدائل للحد من تلوث سطح غير المرغوب فيها إضافة الأنواع الكيميائية اضافية لالحبرية أو المناطق المحيطة بها، والتي من المحتمل أن تؤثر على محتوى الحبرية.
سابقا، وضعت مجموعتنا جهاز للسماح بنقل الخلايا والبروتينات في DMF، من دون إضافات زائدة (الأجهزة الميدانية DW) (9). وقد تحقق ذلك من خلال الجمع بين سطح استنادا السخام شمعة، 10 مع هندسة الجهاز الذي تفضل قطرة المتداول ويؤدي إلى قوة صاعدة على الحبرية، مما خفض التفاعل قطيرة أرض. في هذا النهج، لا يرتبط قطرة الحركة مع ترطيب السطح. 11
الهدف من أسلوب مفصل موضح أدناه هو إنتاج جهاز DMF قادرة على نقل قطرات تحتوي على البروتينات والخلايا والكائنات كلها، من دون إضافات زائدة. الأجهزة الميدانية DW تمهد الطريق لمنصات تسيطر بشكل كامل العمل بشكل مستقل إلى حد كبير من قطرات الكيميائيراي.
هنا، ونحن أيضا محاكاة الحالية تظهر أنه على الرغم من ارتفاع الجهد المطلوب لتشغيل الجهاز، وانخفاض الجهد عبر الحبرية هو جزء صغير من الجهد تطبيقها، مشيرا إلى آثار ضئيلة على bioanalytes داخل الحبرية. في الواقع، اختبارات أولية مع انواع معينة ايليجانس (C. ايليجانس)، والدودة الخيطية تستخدم لمجموعة متنوعة من الدراسات في علم الأحياء، وتبين أن الديدان تسبح دون عائق كما يتم تطبيقها الفولتية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: في الإجراءات الموضحة أدناه، يجب دائما أن يتبع إرشادات السلامة في المختبرات. أهمية خاصة هو السلامة عند التعامل مع الجهد العالي (> 500 V) ومناولة المواد الكيميائية.
1. طلاء من الركيزة التوصيلية مع شمعة السخام
- قطع معدن النحاس في مستطيل (75 × 43 مم، 0.5 مم). تنظيف كل الركيزة النحاس عن طريق الغمر في النحاس منمش لمدة 30 ثانية، ويغسل بماء الصنبور لمدة 20 ثانية، وجافة مع ورقة.
ملاحظة: في حالة استخدام أسلوب 1 أدناه، تغيير أبعاد 75 × 25 ملم لتناسب الجهاز. - اكتساح شمعة البارافين مضاءة تحت الركيزة النحاس لمدة 30-45 ثانية، إلى الحصول على السناج طلاء موحد تقريبا (حوالي 40 ميكرون سميكة). تبقى الركيزة في ~ 1 سم داخل اللهب. لا تلمس سطح السخام الهش.
2. حماية طبقة السخام مع طلاء
ملاحظة: طبقة السناج هشة جداويجب أن تكون مغلفة للحماية. واقترح بديلين بسيطة (أساليب 1 و 2 أدناه) هنا، ولكن بروتوكولات أكثر قوة حاليا قيد التطوير.
- طريقة 1
- تحميل العينة إلى المبخر المعدن أو نظام الاخرق. في أعقاب الإجراءات العملية للنظام، بإخلاء القاعة، وبدء ترسيب الذهب تسيطر على طبقة السناج (150-200 نانومتر). ترك الجهاز يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
- تراجع معطف الركيزة المعدنى في حل 1-dodecanethiol (1٪ ت / ت، في 95٪ من الإيثانول، ACS / USP الصف)، لمدة 10 دقيقة داخل غطاء الكيميائية. بعد ذلك، عقد الجهاز في زاوية قريبة من 60 درجة، وغسل بلطف السطح مع عدة قطرات من الايثانول فقط. السماح للأجهزة الجافة، بين عشية وضحاها.
- طريقة 2
- في غطاء الكيميائية، مباشرة بعد طلاء الركيزة مع السخام وبينما لا تزال الركيزة الدافئة من لهب شمعة، إيداع بعض قطرات من السائل المفلورة على جانب واحد منالركيزة، والركيزة يميل إلى زاوية قريبة من 90 درجة. إيداع المزيد من قطرات، والسماح لهم لفة على سطح السخام بأكمله.
ملاحظة: عندما تسقط قطرة على الفور، وسوف تغسل السخام بعيدا عن تلك المنطقة. دعونا قطرات من انتشار السائل المفلورة قدر الإمكان. - خبز الركيزة على طبق ساخن (160 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة) داخل غطاء الكيميائية.
- دعونا الركيزة الجلوس بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. تخزين أجل غير مسمى.
- في غطاء الكيميائية، مباشرة بعد طلاء الركيزة مع السخام وبينما لا تزال الركيزة الدافئة من لهب شمعة، إيداع بعض قطرات من السائل المفلورة على جانب واحد منالركيزة، والركيزة يميل إلى زاوية قريبة من 90 درجة. إيداع المزيد من قطرات، والسماح لهم لفة على سطح السخام بأكمله.
3. تلفيق الأعلى أقطاب (مقتبس من عبد الجواد وآخرون. 12)
- رسم الأقطاب باستخدام برنامج تصميم الرسوم البيانية. كل قطب هو 2 مم طويل، 0.3 مم، والفجوة بين الأقطاب هو 0.3 ملم. الهوة بين الاتصالات (لتستقر في الموصل، انظر أدناه) هو 2.3 مم (الشكل 1).
- تقليم مرنة النحاس صفح (35 ميكرون سميكة) في شكل خادم الحرمين الشريفين (3.87 X 7.5 بوصة). استخدام أحجام أخرى طو متوافقة مع الطابعة. تحميل صفح في علبة التغذية اليدوية للطابعة ملونة.
- تأكد من استخدام "أسود غني"، أو "تسجيل الأسود"، عند الطباعة على ورقة النحاس (انظر عبد الجواد وآخرون. 12 لمزيد من التفاصيل) للسماح للطبقة كثيفة من الحبر الأسود على الركيزة النحاس، وحماية نمط المطبوعة أثناء الحفر . السماح للطبع الركيزة جافة تماما، بين عشية وضحاها.
- داخل غطاء الكيميائية، الاحماء (40 درجة مئوية) كوب مع 50 مل من النحاس منمش. تراجع صفح المطبوعة في الكأس، ويهز برفق في المحلول لمدة 10 دقيقة. الوقت الحفر يعتمد على حل النحاس منمش. كل بضع دقائق، والتحقق من التآكل ومعرفة ما إذا كان هذا النمط غير سليمة.
- تغسل بعناية صفح مع المياه، وإزالة الطلاء مع الأسيتون والإيثانول في غطاء الكيميائية. يغسل مرة أخرى، وتجف بلطف صفح مع منشفة ورقية.
- إرفاق بعناية صفح مع الأقطاب إلى غلاالشريحة ق ق (75 × 25 مم، ~ 1 مم)، وذلك باستخدام الشريط مزدوجة من جانب. تجنب جيوب هوائية.
- إرفاق فيلم perfluoroalkoxy PFA لالأقطاب باستخدام الشريط. هذا يساعد على منع الاتصال العرضي من الأقطاب مع الحبرية، الامر الذي يسيء الى أعلى الأقطاب بسبب ماس كهربائى.
4. واجهة الإلكترونية (الدوائر في الشكل 2)
- جندى التبديلات والمكثفات C إلى لوحة الدوائر العالمي.
- تجميع ما تبقى من 10 السائقين التتابع على اللوح لحام للدوائر الإلكترونية.
- سلك مدخلات كل سائق التتابع لقناة في لوحة التحكم.
- المفاجئة بعناية قصوى الأقطاب في الموصل (الشكل 3). سلك انتاج كل سائق التتابع في القطب العلوي، كما هو مبين في الشكل. نلاحظ أن هناك اتصال موصل على الارض بين زوج من الأسلاك من التبديلات، للحد من الضوضاء الكهربائية.
ملاحظة: الرابط يجلس على منصة قابلة للتعديل للسيطرة رانه المسافة (0،1-0،5 مم) بين أعلى وأسفل (السخام المطلي) الركيزة. - استخدام برنامج للسيطرة على توقيت الجهد العالي (HV) تطبيق (حوالي 0.8 ثانية) إلى 4 أقطاب كهربائية في نفس الوقت، وتحويل 1 القطب في اتجاه الحركة (أي 0.8 ثانية، وتحفيز 1234، ثم 2345، 3456، الخ .، 0.8 ثانية لكل مجموعة، ثم إلى الوراء، والتحركات قطرة حتى في الاتجاه المعاكس أيضا).
5. التصور قطرة والمناولة
- لتسجيل قطرة الحركة، واستخدام نظام التصور، الذي يتكون من 24X - 96X التكبير التجمع جنبا إلى جنب مع كاميرا CCD. قم بتوصيل مسجل الفيديو إلى الكاميرا باستخدام S-فيديو.
- ماصة قطرات 4 ميكرولتر تحتوي على C. ايليجانس في وسائل الإعلام على الجزء السفلي من الركيزة المغلفة السخام.
- جلب الأقطاب أعلى إلى ~ 0.3 مم فوق الحبرية. يجب أن يكون قطرة مقربة من الوسط أسفل القطب الخامس، لتسهيل عملية.
- بدوره على واجهة الكترونية والجهد العالي (500 V RMS)، وضبط المسافة القطب العلوي إلى قطرة حتى يبدأ التحرك. لا تدع كبار أقطاب تلمس قطرة.
- جمع البيانات من خلال تسجيل عدد التحويلات قطرة ناجحة على الجهاز في الاستجابة لنبضات كهربائية. وتتميز تجربة ناجحة من قبل ما لا يقل عن 700 تحويلات قطرة، أي نقل واحدة بعد كل نبضة كهربائية.
- جمع البيانات بشكل مستمر، حتى قطرات لا يتحرك بعد الآن ردا من 5 إلى 10 البقول.
ملاحظة: عندما يبدأ السطح لتتحلل، يمكن استعادة الحركة من خلال جلب كبار أقطاب أقرب إلى قطرات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
سابقا، وقد استخدمنا الأجهزة الميدانية DW للسماح للحركة من البروتينات في DMF. على وجه الخصوص، قطرات مع ألبومين المصل البقري (BSA) يمكن نقل بتركيز أعلى 2000 مرة من المبلغ عنها سابقا من قبل مؤلفين آخرين (بدون إضافات). ويعزى ذلك إلى انخفاض التفاعل بين قطرة والسطحية، ويبين الشكل 4 قطرات تحتوي الموسومة fluorescently-BSA (انظر فريري وآخرون (9) لمزيد من المعلومات حول التجارب). الصورة الأولى على اليسار تظهر قطرات يجلس على سطح المغلفة السخام. وا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخطوة الأكثر أهمية من البروتوكول هو حماية طبقة السناج، ويرتبط مباشرة مع نجاح في تحريك قطرات. تعدين طبقة السناج (أسلوب 1 أعلاه) يتيح ما يقرب من 100٪ من نجاح تلفيق. ومع ذلك، الحد الأقصى للوقت العملية حوالي 10 دقيقة. ربما، والكسور قطرات ترطيب والسخام من خلال ثقوب في طبقة معدنية. طلاء طبقة السناج مع السائل المفلورة هو أسهل وأسرع بديل، وتتطلب الحد الأدنى من الموارد، ولكن 40-50٪ فقط من ركائز العمل ملفقة (20 دقيقة كحد أقصى) - والطلاء ليست موحدة. في الواقع، فإن طبقة السناج هشة للغاية، ول...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
نشكر مؤسسة ليندباك للدعم المالي، والدكتور الكسندر سيدورنكو وإلزا تشو لإجراء مناقشات مثمرة والمساعدة التقنية، والبروفيسور روبرت سميث للحصول على المساعدة مع C. المقايسات ايليجانس.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| شمعة | أي شمعة البارافين | ||
| نظام الاخرق | Denton Vacuum, Moorestown, NJ | Sputter coater Desk V HP مجهزة بهدف الاتحاد الافريقي. | |
| 1-dodecanethiol | Sigma-Aldrich | 471364 | |
| تفلون | دوبونت | AF-1600 | |
| Fluorinert FC-40 | Sigma-Aldrich | F9755 | سائل مفلور: قم بإعداد راتنج Teflon-AF في Fluorinert FC-40 ، 1: 100 (w / w) ، لإنشاء طلاء كاره للماء. |
| برامج التصميم الجرافيكي -Adobe Illustrator | Adobe Systems | يمكن استخدام برامج أخرى أيضا. | |
| صفح نحاسي | Dupont | LF9110 | |
| طابعة ليزر | زيروكس | فيزر 6360 أو ما شابه | تحقق من التوافق مع "الأسود الغني" أو "التسجيل الأسود" (انظر النص). |
| Copper Etchant | Transene | CE-100 | |
| Perfluoroalkoxy (PFA) | McMaster-Carr | 84955K22 | |
| Breadboard | Allied Electronics | 70012450 أو ما شابه | كبير بما يكفي للسماح بتجميع 10 سائقين. |
| لوحة الدوائر العالمية | Allied | Electronics 70219535 أو ما شابه | |
| ذلك | Allied Electronics | 5145154-8 أو ما شابه | |
| ذلك لوحة التحكم وبرنامج التحكم (برنامج LabView) National | Instruments | NI-6229 أو ما شابه | |
| ذلك من مضخم الجهد العالي | Trek | PZD700 | |
| المكثفات C و C1 ، 100 nF ، 60 V | Allied ؛ | 8817183 | |
| الترانزستور T ، NPN | Allied ؛ | 9350289 | |
| الصمام الثنائي D, 1N4007 | Allied | 2660007 | |
| Relay | حلف | 8862527 | |
| نظام التصور | Edmund Optics | VZM 200i أو تكبير النظام المماثل | 24X &# 8211 ؛ 96X. يتم دمجه مع Hitachi KP-D20B 1/2 في كاميرا CCD الملونة. |
| مسجل | Sony | GV-D1000 NTSC أو ما شابه | ذلك يتم توصيله بالكاميرا بواسطة كابل S-video. |
| المحاكاة | COMSOL Multiphysics | V. 4.4 |
المراجع
- Fair, R. B. Digital microfluidics: is a true lab-on-a-chip possible. Microfluid Nanofluid. 3 (3), 245-281 (2007).
- Gupta, S., Alargova, R. G., Kilpatrick, P. K., Velev, O. D. On-Chip Dielectrophoretic Coassembly of Live Cells and Particles into Responsive Biomaterials. Langmuir. 26 (5), 3441-3452 (2009).
- Shih, S. C., et al. Dried blood spot analysis by digital microfluidics coupled to nanoelectrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 84 (8), 3731-3738 (2012).
- Gorbatsova, J., Borissova, M., Kaljurand, M. Electrowetting-on-dielectric actuation of droplets with capillary electrophoretic zones for off-line mass spectrometric analysis. J Chromatogr. 1234 (0), 9-15 (2012).
- Qin, J., Wheeler, A. R. Maze exploration and learning in C. elegans. Lab Chip. 7 (2), 186-192 (2007).
- Koc, Y., de Mello, A. J., McHale, G., Newton, M. I., Roach, P., Shirtcliffe, N. J. Nano-scale superhydrophobicity: suppression of protein adsorption and promotion of flow-induced detachment. Lab Chip. 8 (4), 582-586 (2008).
- Perry, G., Thomy, V., Das, M. R., Coffinier, Y., Boukherroub, R. Inhibiting protein biofouling using graphene oxide in droplet-based microfluidic microsystems. Lab Chip. 12 (9), 1601-1604 (2012).
- Kumari, N., Garimella, S. V. Electrowetting-Induced Dewetting Transitions on Superhydrophobic Surfaces. Langmuir. 27 (17), 10342-10346 (2011).
- Freire, S. L. S., Tanner, B. Additive-Free Digital Microfluidics. Langmuir. 29 (28), 9024-9030 (2013).
- Deng, X., Mammen, L., Butt, H. -J., Vollmer, D. Candle Soot as a Template for a Transparent Robust Superamphiphobic Coating. Science. 335, 67-70 (2011).
- Kang, K. H. How Electrostatic Fields Change Contact Angle in Electrowetting. Langmuir. 18 (26), 10318-10322 (2002).
- Abdelgawad, M., Watson, M. W. L., Young, E. W. K., Mudrik, J. M., Ungrin, M. D., Wheeler, A. R. Soft lithography: masters on demand. Lab Chip. 8 (8), 1379-1385 (2008).
- Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8 (4), 519-526 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
