MicroRNAs (miRNAs) هي فئة محفوظة على نطاق واسع من الجزيئات التنظيمية. نصف هنا طريقة استنساخ miRNA التي تعتمد على خطوتين قويتين للربط متبوعة بتسلسل عالي الإنتاجية. تسمح طريقتنا بالقياس الكمي الدقيق على مستوى الجينوم ل miRNAs.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ربط ذات كفاءة عالية من الحمض النووي الريبي الجزيئات الصغيرة لالرنا الميكروي الكميات من قبل التسلسل الإنتاجية العالية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ميرنا الاستنساخ والإنتاجية العالية التسلسل، وصف مير تسلسل، تقف وحدها كنهج Transcriptome على صعيد لتحديد miRNAs لقرار النوكليوتيدات واحد. هذه التقنية تلتقط miRNAs عن طريق ربط محولات 3 'و 5' قليل النوكليوتيد إلى جزيئات ميرنا وتتيح دي نوفو ميرنا الاكتشاف. اقتران قوية مع الجيل المقبل من منصات التسلسل، وكان مير تسلسل دور فعال في دراسة ميرنا البيولوجيا. ومع ذلك، تحيزات كبيرة أدخلها قليل النوكليوتيد خطوات ربط منعت مير تسلسل من يجري استخدامها كأداة الكميات دقيقة. وتظهر الدراسات السابقة أن التحيز في وسائل مير يليها الحالية غالبا ما تؤدي إلى عدم دقة ميرنا الكمي مع أخطاء تصل إلى 1،000 أضعاف لبعض miRNAs 1،2. لحل هذه التحيزات الكشف عنها من قبل RNA ربط، قمنا بتطوير طريقة RNA الصغير الذي يؤدي إلى ربط الكفاءة ربط أكثر من 95٪ لكل 3 'و 5' خطوات عملية ربط. هذا القياس ايمأثبتت طريقة البناء باستخدام مكتبة miRNAs الاصطناعية متساوي المولية أو المختلطة بشكل مختلف، ينتج باستمرار يقرأ الأرقام مع الانحراف شقين من أقل من القيمة المتوقعة. وعلاوة على ذلك، تسمح هذه الطريقة ذات الكفاءة العالية مير تسلسل دقيق الجينوم على نطاق ميرنا التنميط في الجسم الحي من مجموع عينات الحمض النووي الريبي (2).
المقدمة
تم تطبيق المنهجيات القائمة على الإنتاجية العالية التسلسل على نطاق واسع في العديد من العينات البيولوجية في السنوات الأخيرة توسع إلى حد كبير فهمنا لتعقيدات النظم البيولوجية الجزيئية 3،4. ومع ذلك، وإعداد عينات الحمض النووي الريبي عن الإنتاجية العالية التسلسل غالبا ما يضفي التحيزات الكامنة محددة لالمنهجية المستخدمة، مما يحد من إمكانية الاستفادة من هذه التقنيات القوية. تم هذه التحيزات طريقة محددة موثقة جيدا عن القائم على الربط، صغير RNA الاستعدادات مكتبة 1،2،5،6. هذه التحيزات تؤدي إلى تباين 1000 أضعاف في ما يلي أرقام لmiRNAs الاصطناعية متساوي المولية، مما يجعل الاستدلال من وفرة ميرنا من البيانات التسلسل متغير ب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: من المهم جدا للحفاظ على ظروف خالية من ريبونوكلياز خلال الإجراء بأكمله.
1. Adenylation 3 "رابط
- تمييع قليل النوكليوتيد الحمض النووي مصمم لردود الفعل 3 "ربط إلى 100 ميكرومتر في nuclease خالية H 2 O.
ملاحظة: يجب أن يكون للقليل النوكليوتيد على "مجموعة فوسفات، وثنائي النوكليوتيد العشوائية في 5 '5 النهاية، و" dideoxycytosine 3. 5 'مجموعة الفوسفات هو شرط للانزيم MTH لكفاءة 5 "adenylation 10. الفوسفات يمكن أن تضاف لما قبل ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يجب أن النتائج المتوقعة للطريقة السابقة تكون في البداية رصد تحولا النوكليوتيدات واحد (الزيادة) في حجم قليل النوكليوتيد الحمض النووي التي كانت تخضع لadenylation كتبها MTH RNA يغاز (الشكل 2). بعد 3 'الربط، والتصور من هلام الأكريلاميد يشير (انظر الشكل 3) حادة عالية الوزن الجزيئي فرق واضح في المنطقة النوكليوتيدات من هلام 100-300. هذا يشير إلى أن عينة الحمض النووي الريبي مجموع المستخدمة هي ذات جودة عالية (لا تتحلل). ثانيا ينبغي للمرء أن نلاحظ .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
منهجية الموصوفة هنا يجعل من استخدام العديد من المتغيرات الرئيسية لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة ربط، وهي تركيزات عالية من PEG، واستخدام linkers العشوائية، وتركيز عال من linkers 2،6،9. هذا النهج يسمح مكتبات التسلسل الكمية موثوق من مجموع عينات الحمض النووي الريبي (2). قمنا بإجراء المعايرة متعددة من المدخلات RNA والتي خلصت إلى أن المنهجية السابقة هو الانسب لمجموع المبالغ RNA في حدود 1-8 ميكروغرام (لا تظهر البيانات). عندما تستخدم كميات في حدود 10-500 نانوغرام، ويستهل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
يود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر يي وخاصة Zhaojie Zhang على المناقشات المثمرة فيما يتعلق بتصميم الرابط وكفاءات الربط ، وكذلك جمعية السرطان الأمريكية لدعم هذا العمل من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه (# 125209) إلى JEL تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور أيضا من قبل المعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض العضلات والعظام والجلد التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R01AR059697 (إلى R.Y.) ومنحة بحثية من معهد ليندا كرنيك لمتلازمة داون. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 3 'رابط (5 'فسفرة ، 3' محظورة) | تقنيات الحمض النووي المتكاملة | مخصصة | |
| 5 'Linker | Integrated DNA Technologies | مخصصة | 5 'محظورة ، HPLC منقى |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | متخصصة في ربط محولات الحمض النووي المسبقة الأدينيل |
| 10x Bindation Buffer (بدون ATP) | نيو إنجلاند Biolabs | مضمنة مع M0351S | |
| 10x Ligation Buffer (مع ATP) | New England Biolabs | المضمنة مع M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| البولي إيثيلين جلايكول (مول الوزن 8,000) | مختبرات نيو إنجلاند | بيولوجية مضمنة مع M0204L | |
| ماء خال من النوكلياز | Ambion | AM9937 | لقد وجدنا أن المياه التي يتم جمعها من جهاز التقطير ذات جودة متساوية. |
| T4RNL1 | نيو إنجلاند Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| طقم Phusion PCR | نيو إنجلاند Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 التمهيدي | تقنيات الحمض النووي المتكاملة | معلومات التسلسل المخصصة المتاحة من Illumina | |
| Illumina RT التمهيدي | تقنيات الحمض النووي المتكاملة | التسلسل المخصصة | المتاحة من Illumina |
| Illumina index primer (s)تقنيات | الحمض النووي المتكاملة | مخصصة | معلومات التسلسل المتاحة من Illumina |
| 40٪ أكريلاميد | فيشر Scientific | BP14081 | |
| اليوريا | سيجما ألدريتش | U6504 | |
| بيرسولفات الأمونيوم | سيجما ألدريتش | A3678 | |
| تتراميثيثي إيثيلين ديامين (TEMED) | سيجما ألدريتش | T9281 | |
| 2x تغيير طبيعة الحمض النووي الريبي تحميل المخزن المؤقت | نيو إنجلاند بيولوجيس | متضمنة مع شفرات الحلاقة M0351S | |
| VWR | 55411-050 | ||
| أنابيب SpinX Centricon | Costar | CLS8161 | |
| أنابيب الطرد الدقيق | الاحتفاظ فيشر Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| طقم Adenylation | New England Biolabs | E2610L |
المراجع
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
