مقالة منهجية

ربط ذات كفاءة عالية من الحمض النووي الريبي الجزيئات الصغيرة لالرنا الميكروي الكميات من قبل التسلسل الإنتاجية العالية

DOI:

10.3791/52095

⸱

نوفمبر 18, 2014

 , 
1Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder, 2Linda Crnic Institute for Down Syndrome, University of Colorado, Denver

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) هي فئة محفوظة على نطاق واسع من الجزيئات التنظيمية. نصف هنا طريقة استنساخ miRNA التي تعتمد على خطوتين قويتين للربط متبوعة بتسلسل عالي الإنتاجية. تسمح طريقتنا بالقياس الكمي الدقيق على مستوى الجينوم ل miRNAs.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ميرنا الاستنساخ والإنتاجية العالية التسلسل، وصف مير تسلسل، تقف وحدها كنهج Transcriptome على صعيد لتحديد miRNAs لقرار النوكليوتيدات واحد. هذه التقنية تلتقط miRNAs عن طريق ربط محولات 3 'و 5' قليل النوكليوتيد إلى جزيئات ميرنا وتتيح دي نوفو ميرنا الاكتشاف. اقتران قوية مع الجيل المقبل من منصات التسلسل، وكان مير تسلسل دور فعال في دراسة ميرنا البيولوجيا. ومع ذلك، تحيزات كبيرة أدخلها قليل النوكليوتيد خطوات ربط منعت مير تسلسل من يجري استخدامها كأداة الكميات دقيقة. وتظهر الدراسات السابقة أن التحيز في وسائل مير يليها الحالية غالبا ما تؤدي إلى عدم دقة ميرنا الكمي مع أخطاء تصل إلى 1،000 أضعاف لبعض miRNAs 1،2. لحل هذه التحيزات الكشف عنها من قبل RNA ربط، قمنا بتطوير طريقة RNA الصغير الذي يؤدي إلى ربط الكفاءة ربط أكثر من 95٪ لكل 3 'و 5' خطوات عملية ربط. هذا القياس ايمأثبتت طريقة البناء باستخدام مكتبة miRNAs الاصطناعية متساوي المولية أو المختلطة بشكل مختلف، ينتج باستمرار يقرأ الأرقام مع الانحراف شقين من أقل من القيمة المتوقعة. وعلاوة على ذلك، تسمح هذه الطريقة ذات الكفاءة العالية مير تسلسل دقيق الجينوم على نطاق ميرنا التنميط في الجسم الحي من مجموع عينات الحمض النووي الريبي (2).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطبيق المنهجيات القائمة على الإنتاجية العالية التسلسل على نطاق واسع في العديد من العينات البيولوجية في السنوات الأخيرة توسع إلى حد كبير فهمنا لتعقيدات النظم البيولوجية الجزيئية 3،4. ومع ذلك، وإعداد عينات الحمض النووي الريبي عن الإنتاجية العالية التسلسل غالبا ما يضفي التحيزات الكامنة محددة لالمنهجية المستخدمة، مما يحد من إمكانية الاستفادة من هذه التقنيات القوية. تم هذه التحيزات طريقة محددة موثقة جيدا عن القائم على الربط، صغير RNA الاستعدادات مكتبة 1،2،5،6. هذه التحيزات تؤدي إلى تباين 1000 أضعاف في ما يلي أرقام لmiRNAs الاصطناعية متساوي المولية، مما يجعل الاستدلال من وفرة ميرنا من البيانات التسلسل متغير بعنف والخطأ عرضة.

وقد وثقت الدراسات التي تركز على خصائص T4 ligases RNA المستمدة فج أن الإنزيمات تظهر تفضيلات القائمة على النوكليوتيدات 7، والذي يعبر عن المكتبات متحيزة كما في الإنتاجية العالية التجارب التسلسل 1،2،8. من أجل تقليل التحيزات الكشف عنها من قبل ligases RNA، وقد استخدمت استراتيجيات متعددة؛ الجزيئات الازدحام 9 العشوائي تسلسل النوكليوتيدات على المحول الذي هو الأقرب إلى الموقع ربط 6، واستخدام تركيزات عالية من محول ربط 2. من خلال الجمع بين هذه الأساليب الثلاثة قمنا بتطوير تدفق العمل لإعداد متحيز المكتبات RNA صغيرة تتلاءم مع التسلسل الإنتاجية العالية (الشكل 1). للمقارنات مباشرة بين البروتوكولات الحالية وأسلوبنا الأمثل، يرجى الرجوع إلى تقريرنا الأخير 2. هذه الطريقة الأمثل ينتج كفاءات ربط تزيد عن 95٪ في كل 3 'و 5' الخطوات ويسمح للربط متحيز من جزيئات الحمض النووي الريبي من عينات صغيرة الاصطناعية والبيولوجية 2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: من المهم جدا للحفاظ على ظروف خالية من ريبونوكلياز خلال الإجراء بأكمله.

1. Adenylation 3 "رابط

  1. تمييع قليل النوكليوتيد الحمض النووي مصمم لردود الفعل 3 "ربط إلى 100 ​​ميكرومتر في nuclease خالية H 2 O.
    ملاحظة: يجب أن يكون للقليل النوكليوتيد على "مجموعة فوسفات، وثنائي النوكليوتيد العشوائية في 5 '5 النهاية، و" dideoxycytosine 3. 5 'مجموعة الفوسفات هو شرط للانزيم MTH لكفاءة 5 "adenylation 10. الفوسفات يمكن أن تضاف لما قبل العلاج للقليل النوكليوتيد مع كيناز عديد النوكليوتيد، أو أمر مع التعديل مباشرة. وثنائي النوكليوتيد العشوائية في النهاية 5 'مهم لتقليل تفضيل تسلسل الحمض النووي الريبي التي ligases معرض لبعض نهاية نهاية الانضمام ردود الفعل على الآخرين 6. 3 'dideoxycytosine يضع عنصر الحجب في نهاية 3' للر قليل النوكليوتيدس تمنع تشكيل concatamers رابط، رابط أثناء الخطوات اللاحقة ربط ويخدم أيضا لمنع 3 "نهاية جزيء ميرنا-رابط شكلت في نهاية 3 'رد فعل ربط 11. تسلسل قليل النوكليوتيد رابط اختياره للأسلوب متحيز مير تسلسل كما يلي: 5'PO 4 NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-dideoxyC3 ".
  2. تجميع التفاعل التالي adenylation: 200 بمول 3 "قليل النوكليوتيد رابط، 4 ميكرولتر 10X 5" عازلة adenylation DNA، 4 ميكرولتر 1 ملم ATP، 4 ميكرولتر MTH RNA يغاز، nuclease خالية H 2 O إلى الحجم النهائي من 40 ميكرولتر.
  3. احتضان رد الفعل عند 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. إنهاء رد فعل عن طريق تسخين إلى 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. يعجل رابط adenylated بإضافة 2.5 حجم الإيثانول بنسبة 100٪ وحجم 10 1/3 خلات الأمونيوم M لإزالة ATP المتبقية ومنع عملية ربط غير متوقعة في ردود الفعل المستقبلية.
    1. باختصار، مزيج آلcohol، والملح، والحل بنسبة ضئيلة إلى التجانس، والغزل بأقصى سرعة في microcentrifuge (~ 15000 x ج) في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. غسل بيليه في الايثانول 70٪، والهواء الجاف، وresuspend في حجم مناسب من nuclease خالية H 2 O لانتاج 50-100 ميكرومتر من adenylated بنسبة ضئيلة.
  5. تأكيد adenylation عن طريق تشغيل هلام بولي أكريلاميد 18٪.
    1. تحضير هلام عن طريق خلط التالية معا: 6.3 ز اليوريا، 6.75 مل من 40٪ مادة الأكريلاميد، و 1.5 مل من 10X TBE. إضافة H 2 O إلى 15 مل.
    2. المزيج حتى يذوب تماما اليوريا وإضافة 150 ميكرولتر 10٪ (ث / ت) فوق كبريتات الأمونيوم (APS) و 15 ميكرولتر tetramethlyethylenediamine (TEMED).
    3. مرة واحدة وقد وضعت جل، قبل تشغيل لمدة 30 دقيقة عند 24 فولت / سم من العرض هلام مع 1X TBE تشغيل عازلة في درجة حرارة الغرفة. مرة واحدة 30 دقيقة هو ما يصل آبار الاحمرار مع تشغيل العازلة.
    4. مزيج 5 بمول من [أليغنوكليوتيد adenylated وعلى قدم المساواة مع حجم 2X تغيير طبيعة عازلة RNA تحميل (95٪ (V / V) الفورماميد،0.02٪ (ث / ت) SDS، 0.02٪ برموفينول الأزرق (ث / ت)، 0.01٪ (ث / ت) سيانول زايلين، 1.0 ملي EDTA)، لفترة وجيزة الحرارة إلى 75 درجة مئوية، والمفاجئة تبريده على الجليد. الاستغناء عينة بأكملها إلى البئر من هلام. وتشمل أيضا مبلغ مماثل من السيطرة غير adenylated، وانخفاض مستويات الجزيئية حجم الوزن.
    5. تشغيل هلام في 24 فولت / سم حتى الأزرق برموفينول هو ¾ من الطريق إلى أسفل هلام. تفكيك الجهاز، جل ما بعد صمة عار مع حل 1X SYBR الذهب في 1X TBE وتصور على مربع UV-نقل transilluminator (الشكل 2).
      ملاحظة: جل تنقية جزئية adenylated بطريقة مماثلة لتلك المذكورة أعلاه إذا "أي إدخال RNA" الضوابط الناجمة عنها في كمية عالية من الناتج PCR بالمقارنة مع عينات الحمض النووي الريبي المدخلات.

2. رابط لربط 3 "نهاية ميرنا

  1. 3 "ربط
    1. تجميع المكونات التالية على الجليد في الترتيب المسرود: 1.0 ميكرولتر 50٪ (ث / ت) PEG 8000، 0.5 و# 956؛ ل 10X عازلة RNA يغاز (500 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 100 ملي MgCl 2 و 10 ملي DTT)، 1.0 ميكرولتر adenylated 3 "رابط (100 ميكرون)، 0.5 ميكرولتر ريبونوكلياز المانع، 0،5-8،0 ميكروغرام الحمض النووي الريبي مجموع، 0.5 ميكرولتر T4 RNA يغاز 2، nuclease خالية H 2 O إلى الحجم النهائي من 5 ميكرولتر.
    2. مزيج رد فعل من قبل pipetting هو الحل هو لزج جدا لدوامة بسبب تركيز عال من PEG 8000. مختلطة مرة واحدة بدقة، ووضع رد الفعل في cycler الحرارية مع غطاء ساخنة. تعيين كتلة إلى 16 درجة مئوية، واحتضان لمدة 4 ساعات.
      ملاحظة: قد يتم تحجيم رد الفعل يصل إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر من دون أي خسارة في الكفاءة ربط. تتفاعل لمدة 4 ساعة عند درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية لانتاج الكفاءات ربط متطابقة في جوهرها.
  2. هلام تنقية
    1. بعد 3 'ربط، مزيج التفاعل مع حجم مساو من RNA 2X العازلة تحميل. الحرارة إلى 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، والمفاجئة باردة على الجليد.
    2. تشغيل العينة على 15٪ هلام بولي أكريلاميد لتنقية PAGE.
      1. إعداد 15٪ هلام بولي أكريلاميد تحتوي على 7 M اليوريا، بطريقة مماثلة لتلك التي سبق وصفها في الخطوة 1.5.
      2. قبل تشغيل هلام في 24 فولت / سم من العرض هلام لمدة 30 دقيقة على الأقل. إيقاف إمدادات الطاقة، وتدفق الآبار، عينة الحمل وهلام المدى في نفس الجهد كما ما قبل التشغيل.
      3. تحميل العينة وتشغيل الصفحة حتى الأزرق برموفينول قد خرجت للتو من هلام. المنتج المطلوب سوف تنتقل قريبا من cyanol زيلين.
  3. تلطيخ، والتصور، والختان
    1. تفكيك جهاز جل وهلام مكان في علبة نظيفة مع 1X تشغيل عازلة (TBE)، 1X SYBR الذهب، والصخور لمدة 15 دقيقة.
    2. إزالة هلام من تلطيخ طبق وتصور على مربع نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية مغطاة غلاف بلاستيكي نظيف. يجب أن يكون المنتج ربط حوالي 45 النيوكليوتيدات في الطول.
    3. استئصال المنطقة التي تحتوي على المنتج ربط مع razo نظيفةشفرة ص ومكان في 0.5 مل أنبوب الطرد المركزي الصغيرة.
  4. عزل المنتج والهطول
    1. بيرس أسفل أنبوب 0.5 مل ميكروسنتريفوج مع 30 G إبرة ووضع أنبوب مثقوب في الثانية نظيفة ومنخفضة الاحتفاظ، 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ~ 15000 ز س.
    2. تأكيد بصريا أن شريحة هلام كلها تحركت من خلال ثقب في الانبوب الداخلي. إذا لزم الأمر، استخدم طرف ماصة نظيفة لدفع بعض شظايا هلام أقرب إلى ثقب.
    3. تجاهل فارغة أنبوب 0.5 مل وإضافة 400 ميكرولتر من العازلة العمود عالية من الملح (كلوريد الصوديوم HSCB 400 ملم، 25 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 0.1٪ SDS) إلى الطين مادة الأكريلاميد. أنبوب الروك (ق) في 4 درجات مئوية خلال الليل.
    4. تحويل الطين إلى 0.22 ميكرون خلات السليلوز عمود الدوران باستخدام ماصة واسعة الجوف. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة في ~ 15000 x ج لجمع كل السائل بعيدا عن هلام الأكريلاميد المصفوفة.
    5. نقل السائل نظيفة ومنخفضة الاحتفاظ، أنبوب 1.5 مل تحتوي علىجي 1 ميكرولتر من 20 ملغ / مل الجليكوجين. إضافة حجم مساو من الأيزوبروبانول و1/10 عشر حجم خلات الصوديوم. مزيج حل عن طريق أنبوب قلب عدة مرات ويعجل في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    6. الطرد المركزي بأقصى سرعة عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتكوير الحمض النووي. إزالة طاف ويغسل في الايثانول 70٪. بيليه الهواء الجاف لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والانتقال مباشرة إلى 5 "خطوة الربط.

3. ربط رابط ل5 "نهاية ميرنا-3" رابط الهجين

  1. لالحمض النووي مكعبات، إضافة العناصر التالية: 2 ميكرولتر PEG 8000 (50٪ ث / ت)، و 0.5 ميكرولتر 10X RNA يغاز العازلة، 0.5 ميكرولتر ATP (10 ملم)، و 0.5 ميكرو لتر NN-RNA بنسبة ضئيلة (100 ميكرون)، وH 2 O إلى الحجم النهائي من 4 ميكرولتر.
    ملاحظة: تكوين "بنسبة ضئيلة NN-RNA" كما يلي مقلوب 5'dideoxy-TCUACAGUCCGACGAUCNN3 "وتنقيته عبر HPLC من قبل الشركة المصنعة.
  2. مزيجهذه العينة من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. القيام بذلك لبعض الوقت (تصل إلى 5 دقائق) للتأكد من أن بيليه قد تم الانتهاء من إعادة يذوب. إذا إعادة الإذابة هو إشكالي، تسخين لفترة وجيزة العينة (3-5 دقيقة) إلى 37 درجة مئوية واستئناف pipetting لخلط.
  3. مرة واحدة بيليه يعود في حل، ونقل المحتويات إلى أنبوب PCR نظيفة تحتوي على 1 ميكرولتر من 1: 1 خليط من ريبونوكلياز المانع و T4 RNA يغاز 1 (5 وحدات). مرة أخرى عن طريق خلط pipetting صعودا وهبوطا.
  4. احتضان رد الفعل في cycler الحرارية عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. الشروع فورا في التوليف [كدنا].

4. عكس النسخ / [كدنا] التجميعي

  1. إضافة المكونات التالية ل5 'رد فعل الربط: 2 ميكرولتر عازلة 5X RT، 0.75 ميكرولتر 100 ملي DTT، 1 ميكرولتر RT التمهيدي البورشيد 5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3 "(1 ميكرون)، و 0.5 ميكرولتر dNTPs (10 ملم).
  2. مزيج من قبل pipetting والحرارة إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم تبرد ببطء على مقاعد البدلاء رالمرجع.
  3. بمجرد أن يبرد إلى درجة حرارة الغرفة رد فعل، أنبوب مكان على الجليد وإضافة 0.5 ميكرولتر كل من إنزيم الناسخ العكسي وريبونوكلياز المانع. مزيج من قبل pipetting ومكان في cycler الحرارية للخطوة التمديد المشار إليها في تعليمات الشركة الصانعة.
  4. مرة واحدة كاملة إضافة 5 ميكرولتر من nuclease خالية H 2 O لجلب الحجم النهائي للمكتبة [كدنا تصل إلى 15 ميكرولتر.

5. إعداد المكتبة

  1. لفهرسة PCR، تجميع التفاعل التالي على الجليد: 6 ميكرولتر 5X Phusion العازلة، 1 ميكرولتر dNTPs (10 ملم)، 0.9 ميكرولتر DMSO، 0.75 ميكرولتر 5 'التمهيدي (25 ميكرومتر)، 0.75 ميكرولتر 3 "التمهيدي (25 ميكرومتر)، مكتبة 3 ميكرولتر [كدنا] (تركيز متغير اعتمادا على كمية من المدخلات)، 0.5 ميكرولتر Phusion البلمرة (1 وحدة)، nuclease خالية H 2 O إلى الحجم النهائي من 30 ميكرولتر. اختيار متواليات التمهيدي لضمان التوافق مع القالب ومنصة تسلسلالاختيار.
    1. تشغيل تفاعل PCR مع الإعدادات التالية: تمسخ الأولي في 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، لأول 4 دورات، تفسد 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، ويصلب عند 50 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، تمتد على 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية .
      ملاحظة: اعتمادا على كمية من المواد المدخلات، وتختلف الأرقام الإجمالية دورة PCR. عادة، للحصول على مدخلات من 1-2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع، مجموع 13 دورات PCR تكفي لتوليد مكتبة مير تسلسل.
    2. تنفيذ دورات لاحقة، على سبيل المثال، دورات 5-12، بطريقة من خطوتين حيث يتم الجمع بين دورات الصلب والإرشاد ونفذت في 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية وتمسخ مرة أخرى 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية.
      ملاحظة: حجم رد الفعل هو 30 ميكرولتر للسماح التوقف برنامج PCR وإزالة قسامة 10 ميكرولتر في دورة أرقام محددة مسبقا لمراقبة ظهور المنتج المطلوب. عادة، دورات 10 و 13 و 16 يتم اختيارهم للاختبار من عينة الحمض النووي الريبي مجموع.
  2. إعداد8٪ غير تغيير طبيعة هلام الأكريلاميد عن طريق خلط 2 مل من 40٪ مادة الأكريلاميد، 1 مل من 10X TBE، وH 2 O إلى 10 مل. ثم إضافة 100 ميكرولتر من 10٪ APS و 10 ميكرولتر من TEMED. صب جل وترك مجموعة.
    1. قبل تشغيل هلام في 12 فولت / سم من العرض هلام لمدة 30 دقيقة. آبار الاحمرار. إضافة 1 ميكرولتر من 10X العازلة تحميل (15٪ Ficoll-400، 66 ملي EDTA، 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 0.1٪ (ث / ت) SDS، 0.01٪ (ث / ت) برموفينول الأزرق)، وإضافة 10 ميكرولتر من عينة إلى كل بئر من أبعاد 5 مم × 1 مم × 15 مم. عادة، يمكن تحميل كل بئر يصل إلى 30 ميكرولتر من العينات. تشغيل هلام عينة في 10 V / سم من العرض هلام العازلة في 1X TBE حتى صبغة زرقاء برموفينول يعمل فقط من الجزء السفلي من هلام.
    2. وصمة عار وتصور الجل كما هو موضح في الخطوة 2.3.
    3. استئصال قاعدة الفرقة 146 زوج وأزل بين عشية وضحاها في 0.25 مل من HSCB بطريقة مماثلة لما هو موضح في القسم 2.4. ترسيب الحمض النووي في حجم مساو من الأيزوبروبانول و1/10 عشر حجم خلات الصوديوم. غسل بيليه في 70٪ هthanol وresuspend في TE العازلة.
    4. قياس المكتبة باستخدام picogreen وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب أن النتائج المتوقعة للطريقة السابقة تكون في البداية رصد تحولا النوكليوتيدات واحد (الزيادة) في حجم قليل النوكليوتيد الحمض النووي التي كانت تخضع لadenylation كتبها MTH RNA يغاز (الشكل 2). بعد 3 'الربط، والتصور من هلام الأكريلاميد يشير (انظر الشكل 3) حادة عالية الوزن الجزيئي فرق واضح في المنطقة النوكليوتيدات من هلام 100-300. هذا يشير إلى أن عينة الحمض النووي الريبي مجموع المستخدمة هي ذات جودة عالية (لا تتحلل). ثانيا ينبغي للمرء أن نلاحظ ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منهجية الموصوفة هنا يجعل من استخدام العديد من المتغيرات الرئيسية لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة ربط، وهي تركيزات عالية من PEG، واستخدام linkers العشوائية، وتركيز عال من linkers 2،6،9. هذا النهج يسمح مكتبات التسلسل الكمية موثوق من مجموع عينات الحمض النووي الريبي (2). قمنا بإجراء المعايرة متعددة من المدخلات RNA والتي خلصت إلى أن المنهجية السابقة هو الانسب لمجموع المبالغ RNA في حدود 1-8 ميكروغرام (لا تظهر البيانات). عندما تستخدم كميات في حدود 10-500 نانوغرام، ويستهل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر يي وخاصة Zhaojie Zhang على المناقشات المثمرة فيما يتعلق بتصميم الرابط وكفاءات الربط ، وكذلك جمعية السرطان الأمريكية لدعم هذا العمل من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه (# 125209) إلى JEL تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور أيضا من قبل المعهد الوطني لالتهاب المفاصل وأمراض العضلات والعظام والجلد التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R01AR059697 (إلى R.Y.) ومنحة بحثية من معهد ليندا كرنيك لمتلازمة داون. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3 'رابط (5 'فسفرة ، 3' محظورة)تقنيات الحمض النووي المتكاملةمخصصة
5 'LinkerIntegrated DNA Technologiesمخصصة5 'محظورة ، HPLC منقى
T4RNL2 (1-249 K227Q)New England BiolabsM0351Sمتخصصة في ربط محولات الحمض النووي المسبقة الأدينيل
10x Bindation Buffer (بدون ATP)نيو إنجلاند Biolabsمضمنة مع M0351S
10x Ligation Buffer (مع ATP)New England Biolabsالمضمنة مع M0204L
RNaseOUTInvitrogen10777-019
البولي إيثيلين جلايكول (مول الوزن 8,000)مختبرات نيو إنجلاندبيولوجية مضمنة مع M0204L
ماء خال من النوكليازAmbionAM9937لقد وجدنا أن المياه التي يتم جمعها من جهاز التقطير ذات جودة متساوية.
T4RNL1نيو إنجلاند BiolabsM0204L
Superscript III RT kitInvitrogen18080-051 
طقم Phusion PCRنيو إنجلاند BiolabsM0530S
Illumina RP1 التمهيديتقنيات الحمض النووي المتكاملةمعلومات التسلسل المخصصة المتاحة من Illumina
Illumina RT التمهيديتقنيات الحمض النووي المتكاملةالتسلسل المخصصةالمتاحة من Illumina
Illumina index primer (s)تقنياتالحمض النووي المتكاملةمخصصةمعلومات التسلسل المتاحة من Illumina
40٪ أكريلاميدفيشر ScientificBP14081
اليورياسيجما ألدريتشU6504
بيرسولفات الأمونيومسيجما ألدريتشA3678
تتراميثيثي إيثيلين ديامين (TEMED)سيجما ألدريتشT9281
2x تغيير طبيعة الحمض النووي الريبي تحميل المخزن المؤقتنيو إنجلاند بيولوجيسمتضمنة مع شفرات الحلاقة M0351S
VWR55411-050
أنابيب SpinX CentriconCostarCLS8161
أنابيب الطرد الدقيقالاحتفاظ فيشر Scientific02-681-320
Sybr GoldInvitrogenS-11494
طقم AdenylationNew England BiolabsE2610L
معلومات منخفضة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
  2. Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109(2013).
  3. Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
  4. Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  5. Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
  6. Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141(2011).
  7. McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
  8. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54(2012).
  9. Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
  10. Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
  11. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
  12. Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
  13. Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

miR Seq miRNA

مقالات ذات صلة