رواية في المختبر نموذج لدراسة التفاعلات بين الدم الكامل الإنسان والبطانة Endothelium

Sofia Nordling; Bo Nilsson; Peetra U. Magnusson

doi:10.3791/52112

مقالة منهجية

رواية في المختبر نموذج لدراسة التفاعلات بين الدم الكامل الإنسان والبطانة Endothelium

DOI:

10.3791/52112

⸱

نوفمبر 21, 2014

Sofia Nordling¹ , Bo Nilsson¹ , Peetra U. Magnusson¹

¹Department of Immunology, Genetics and Pathology, Uppsala University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عدم وجود إمكانية الوصول إلى نماذج موثوقة للتحقيق في تفاعلات الدم الوعائية لدى البشر. نقدم نموذجا في المختبر للخلايا البطانية البشرية الأولية المزروعة جنبا إلى جنب مع الدم البشري الكامل للتحقيق في التفاعلات الخلوية في كل من الدم (ELISA) وحجرة الأوعية الدموية (الفحص المجهري).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرافق غالبية من جميع الأمراض المعروفة من قبل اضطرابات في نظام القلب والأوعية الدموية. دراسات في تعقيد سبل تفعيلها خلال التفاعل أمراض القلب والأوعية الدموية و، ومع ذلك، محدودة بسبب عدم وجود طرق قوية وذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. من أجل نمذجة الأحداث الأوعية الدموية المرضية قمنا بتطوير فحص في المختبر لدراسة التفاعل بين البطانة والدم كله. ويتكون الفحص من الخلايا البطانية الإنسان الأساسية، والتي يتم وضعها في اتصال مع الدم البشري كله. يستخدم أسلوب دم الأم مع أي أو القليل جدا من تخثر، مما يتيح دراسة التفاعلات الحساسة بين المكونات الجزيئية والخلوية الموجودة في الأوعية الدموية.

نحن التحقيق ظيفة الفحص بمقارنة تفعيل تخثر الدم بواسطة أحجام مختلفة المحتضنة مع أو بدون خلايا بطانة الوريد السري الإنسان (HUVEC). في حين ساهم حجم الدم أكبر ل(TAT) المجمعات، أدى إلى زيادة في تكوين الثرومبين مضاد الثرومبين جود HUVEC في خفض تفعيل التخثر. وعلاوة على ذلك، طبقنا تحليل صورة مرفق الكريات البيض إلى HUVEC حفز مع عامل نخر الورم (TNFα) وجدت وجود CD16 ⁺ الخلايا لتكون أعلى بكثير على TNFα حفز الخلايا بالمقارنة مع الخلايا unstimulated بعد ملامسة الدم. في الختام، الفحص يمكن تطبيقها لدراسة أمراض الأوعية الدموية، حيث يتم مضطرب التفاعلات بين البطانة ومقصورة الدم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طرق لتحليل التفاعلات الدم في الأوعية الدموية أمراض القلب والأوعية الدموية تشمل عموما تجارب البحوث الحيوانية. قد النتائج التي تم إنشاؤها في النماذج الحيوانية الأبحاث التجريبية، ومع ذلك، فقد ضمنا ضئيلة أو معدومة للأمراض البشرية. ^1،2 على هذا النحو، هناك حاجة للخير وموثوق بها في النماذج المختبرية للتحقيق في التفاعلات الخلوية بين مقصورة الدم والخلايا البطانية الوعائية في نظام يشبه الإنسان. وبالتالي أنشأنا البطانية الدم نموذج غرفة الخلية. ويستند هذا على نموذج سبق وصفها تستخدم لتحقيق التفاعل بين المواد الحيوية والدم البشري كله. ³ خلافا لغيرها من الاجهزة في المختبر حيث عادة عدد من المكونات النقية، محدودة أي thrombocytes، هي الكريات البيضاء أو الخلايا البطانية المتاحة، والنموذج الحالي يتضمن جميع مكونات موجودة في الاوعية الدموية.

الإعداد للالبطانية الدم جتم تصميم نموذج الذراع الغرفة لتمكين استخدام رسمها الدم البشري الطازج مع القليل أو لا تخثر المضافة. الدم المخزنة خلال فترات زمنية أطول يكتسب ما يسمى الآفات التخزين حيث انهيار الكريات الحمراء قد تتداخل مع التفاعلات الحساسة بين الدم والخلايا البطانية. ⁴

لتجنب تشكل جلطة أثناء التعامل مع الدم خارج الجسم كله يتطلب إما جرعات عالية من مضادات التخثر أو أن جميع المواد في اتصال مع الدم يجب أن تكون غير تفعيل. كما الأسطح غير تفعيل نادرة في بيئة معملية، قد تكون مجهزة بدلا من المواد مع طبقة واقية من الهيبارين يجمد. طبقة واقية من الهيبارين يجمد (المشار إليه فيما Corline الهيبارين السطحية (كلية العلوم الصحية)) والتي يمكن تطبيقها على معظم المواد خلق السطح حيث يمكن أن يحدث تلامس الدم دون التسبب في تفعيل شلال التخثر. ⁵ وهكذا، من خلال تأثيث غرف مع كلية العلوم الصحية، وم البطانية الدمليرة لبنانية نموذج غرفة يتيح استخدام تركيزات منخفضة جدا من تخثر في الدم. تجنب إضافة تركيزات عالية من تخثر في الدم طراز الغرفة البطانية يجعل من الممكن لدراسة التفاعلات الحساسة داخل الأوعية الدموية التي قد تكون على خلاف ذلك ملثمين ⁶

يتكون الدم البطانية نموذج غرفة خلية من مجلسين شكلتها إرفاق اسطوانات البلاستيك (الطول: 8 مم؛ نصف قطرها: 9 مم) إلى المجهر الشريحة البلاستيكية. مجهزة الحواف التي تواجه صعودا على اسطوانات مع الأخاديد التي يتم تركيبها مع المطاط O-خواتم تستخدم لاغلاق الدوائر ضد الشريحة ثقافة الخلية. تمتلئ غرف جزئيا فقط مع الدم والهواء ترك في الغرفة وتبقي الدم في الحركة عندما يتم استدارة غرف لاحقا في وضع عمودي (الشكل 1).

من أجل تقييم الأداء الوظيفي للنموذج، أجرينا تجارب إما مع كلية العلوم الصحية المغلفة تماماغرفة أو الوريد السري الإنسان خلايا غشائي (HUVEC). وقد يعاير مجلدين منفصلين الدم وقياس تشكيل الثرومبين مضاد الثرومبين (TAT) مجمعات (علامة غير مباشرة للتخثر) مع انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA). نحن بعد ذلك بتقييم تأثير حجم الدم وعامل نخر الورم (TNFα) حفز الخلايا البطانية على تجنيد الكريات البيض بواسطة تحليل الصور.

figure-introduction-1
الشكل 1. الإعداد للالبطانية الدم نموذج غرفة الخلية. (A) أعلى عرض الرسم التخطيطي للغرفة الدم المحرز في PMMA. (ب) الخلايا البطانية الإنسان الأولية هي تربيتها على 1-جيدا الشرائح غرفة. وأضاف العذبة الدم البشري كله إلى مجلسين على شريحة المجهر. يتم التعامل مع الدوائر وجميع المواد المستخدمة للتعامل مع الدم مع طلاء واقية HS. بعد إزالة جدران مليرة لبنانية ثقافة شريحة، يتم وضع الخلايا التي تواجه الدم وفرضت نظام الإغلاق. ثم يتم تحضين غرف الخلية (C) في الدم تحت البطانية في دوران 37 درجة مئوية. بعد ذلك، يمكن تحليل ردود الفعل في مقصورة الدم عن طريق ELISA ويمكن تحليل الخلايا البطانية بواسطة المجهر.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولفت الدم من الأفراد الأصحاء من قبل بزل الوريد في نظام مفتوح مع موافقة مجلس المراجعة الأخلاقية في أوبسالا (رخصة رقم 2008/264): ملاحظة.

1. خلايا البذر

ثقافة الخلايا الأولية البشرية البطانية الوريد السري (HUVEC) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ في قوارير T75 المغلفة مع الجيلاتين 1٪ في برنامج تلفزيوني الرقم الهيدروجيني 7.4.
إزالة مستنبت من قارورة T75 يحتوي HUVEC (أو أي نوع آخر من الخلايا البطانية الإنسان الأساسية) وغسل الخلايا مع 2.1 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني الرقم الهيدروجيني 7.4. فصل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل 0.25٪ التربسين-EDTA واحتضان لمن 2 - 3 دقيقة في 37 درجة مئوية.
جمع الخلايا وذلك بدهن قارورة مع 9 مل 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل. تدور أسفل الخلايا في 735 x ج لمدة 5 دقائق.
إزالة طاف و resuspend بيليه خلية بعناية في نمو الخلايا البطانية المتوسطة الاوعية الدموية الدقيقة (EC GMMV) وعدد الخلايا في غرفة Bürker. البذور 21000 جells / سم ² في 1 جيدا الشرائح زراعة الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية. سيتم متموجة في HUVEC بعد 1 - 2 أيام الثقافة. مراقبة مورفولوجيا الخلايا وconfluency يوميا تحت المجهر الضوئي.

2. إعداد الدم الكامل

تحضير جميع الأسطح الاصطناعية التي من شأنها أن تكون على اتصال مع الدم مع طبقة مزدوجة من الهيبارين يجمد (كلية العلوم الصحية) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. CHS المواد المغلفة محمية من الغبار ويمكن تخزين في درجة حرارة الغرفة ما يصل إلى 6 أشهر دون فقدان وظيفة.
استخدام نظام مفتوح بزل الوريد لسحب الدم من المتبرع بصحة جيدة قريبا (<30 دقيقة) قبل البدء في تجربة غرفة البطانية الدم. زوجان إبرة تحت الجلد (G 18 × 50 ملم) لكلية العلوم الصحية الأنابيب المغلفة السيليكون (القطر الداخلي: 2 مم) قبل جمع بعناية الدم في أنبوب مل CHS المغلفة 50. ملحق الدم مع الهيبارين غير المجزأ للوصول إلى تركيز النهائي من 0.75 وحدة دولية / مل. خلط الدم بلطف بواسطة INVErting أنبوب من 2 - 3 مرات.

3. الدم غرفة غشائي نموذج

افتعال غرف الدم (الشكل 1A؛ عرض أعلى) في الاكريليك ميتاكريلات (PMMA)، ويتألف من اثنين من اسطوانات (الطول 8 ملم وقطرها 9 مم) التي يتم لصقها على شريحة PMMA (25 × 75 مم). تناسب حواف اسطوانات تواجه صعودا مع المطاط O-خواتم لاغلاق الغرفة الدم على الشرائح الزجاجية مع الخلايا البطانية مثقف (الشكل 1B). تدوير الدم غرف متصلة الشريحة الثقافة مع الخلايا البطانية بعد ذلك في وضع عمودي (الشكل 1C).
استخدام غيض ماصة كلية العلوم الصحية المغلفة لنقل 1.5 مل دم في كل كلية العلوم الصحية المغلفة الغرفة مع الحرص على عدم لتنشيط الدم.
نقل 1 مل من الدم في أنابيب microcentrifuge تحتوي على 30 ميكرولتر 0.34 MK ₃ EDTA للوصول إلى تركيز النهائي من 10 ملي K ₃ EDTA لتحديد تركيزات بروتين البلازما الأولي باستخدامانزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA). مزيج بعناية الدم والحفاظ على أنابيب على الجليد.
إزالة الجدران البلاستيكية من الشرائح الزجاجية زراعة الخلايا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة بعناية وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني الرقم الهيدروجيني 7.4. تأكد من إزالة لاحقا الكثير من السوائل ممكن من الشرائح. لا تدع خلايا تجف.
وضع الشريحة على رأس الدوائر الدم، مع الخلايا التي تواجه الدم. تأمين الشريحة من خلال وضع المشبك في جميع أنحاء الغرفة الخلايا البطانية في الدم. استخدام شريحة بلاستيكية للحصول على دعم إضافي لتفادي الكسر من الزجاج زراعة الخلايا الشريحة عند وضع المشبك.
إصلاح الخلايا البطانية غرفة الدم على عجلة دوارة (40 سم في القطر) مكان في حمام مائي 37 ° C. وتناوب كل من المجلسين على عجلة القيادة عند 0.5 x ج لمدة 30 دقيقة.
بعد الحضانة، وتفكيك الخلايا البطانية غرفة الدم. تغسل شرائح زراعة الخلايا في برنامج تلفزيوني الرقم الهيدروجيني 7.4 وإصلاح الخلايا في الجليد الباردة 1٪ بارافورمالدهيد (PFA) وأو 10 دقيقة. نقل 1 مل من الدم كل غرفة لأنابيب microcentrifuge تحتوي على 30 ميكرولتر 0.34 MK ₃ EDTA للوصول إلى تركيز النهائي من 10 ملي K ₃ EDTA وخلط أنابيب بلطف. إبقاء الأنابيب على الجليد.
أنابيب الطرد المركزي في 4560 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل بلازما الدم لأنابيب microcentrifuge جديدة وتخزينها في -70 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل.

4. تحليل الدم غشائي التفاعلات

أداء مناعي تلطيخ مع الماوس مكافحة CD16 الإنسان تليها الماعز الثانوية المضادة للماوس اليكسا 488 و phalloidin-TexasRed. تنفيذ كل خطوة تلطيخ لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة وغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني ودرجة الحموضة 7.4 بين كل خطوة. مباين نوى مع دابي لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تحليل مكونات الدم منضمة إلى الخلايا البطانية التي كتبها مضان المجهري في تركيبة مع تحليل الصور باستخدام برمجيات تحليل الصور مناسبة مثل CellProfiler.
Quantiردود الفعل المالي في المقصورة الدم مع الثرومبين، مضاد الثرومبين (TAT) ELISA وفقا لتعليمات الشركة الصانعة للعينات البلازما.
استخدام الأدوات الإحصائية المناسبة، على سبيل المثال، لاختبار ر أونبايريد، لتحليل البيانات.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ضرورة CHS طلاء

من أجل قياس ردود الفعل في الدم الكامل محددة لتلك التي تسببها الخلايا البطانية، وجميع المواد المستخدمة في غرفة خلية البطانية الدم يجب مفروشة مع طلاء كلية العلوم الصحية قبل استخدامها. الشكل 2A (يسار) يدل على غرفة غير المصقول بعد 30 دقيقة من الاتصال مع تجلط الدم اضحة للعيان الحاضر. علاج الغرفة مع كلية العلوم الصحية (الشكل 2A، يمين) من جهة أخرى يحمي الدم من التنشيط غير المنضبط، وضمان أن النتائج هي نتيجة لتفاعلات الخلايا البطانية الدم.

تأثير حجم الدم في الغرفة

تنشيط تجلط الدم هو أكثر احتمالا في الدم الراكد حيث احتمال التفاعل بين عوامل التخثر تنشيط وزيادة. في البطانية الدم نموذج غرفة الخلية، ويتم الاحتفاظ بالدم في الحركة بسبب تداول فقاعة الهواء داخل الغرفة. في سrder لتحديد تأثير التغيرات في حجم الدم، وبالتالي أيضا حجم فقاعة الهواء، وتواصل الغرفة المغلفة كلية العلوم الصحية إلى كلية العلوم الصحية المغلفة شريحة زجاجية الذي تم اختباره مع 1.5 مل أو 1.75 مل الدم الكامل لمدة 30 دقيقة. حجم الدم دون أي حركة من قبل فقاعة الهواء هو 2.5 مرات أكبر عند 1.75 مل من الدم ويضاف إلى غرفة مقارنة عند استخدام 1.5 مل من الدم (الشكل 2B). واقترح القيم تات تات-تقاس زيادة تكوين مع زيادة حجم الدم (الشكل 2D). عندما حضنت HUVEC (الشكل 2C) مع إما 1.5 أو 1.75 مل من الدم الكامل، لوحظ أي فرق بين المجموعتين، مما يشير إلى أن الخلايا البطانية قد تعدل تفعيل التخثر (الشكل 2D).

تأثير TNFα على التوظيف خلايا الدم وتنشيط التخثر

من أجل دراسة تأثير TNFα على تجنيد الكريات البيض، وكانت معاملتهم HUVECإد مع 20 نانوغرام / مل TNFα 4 ساعة قبل الاتصال الدم. واستمر لمدة 30 دقيقة وبعد ذلك تم صبغ الشرائح الثقافة لCD16 (الشكل 2F)، تصوير وكميا في عدد من خلايا CD16 ⁺ - الاتصال الدم - سواء مع 1.5 مل أو 1.75 مل دم. تجنيد CD16 ⁺ الخلايا بشكل ملحوظ مع العلاج TNFα (الشكل 2E) 100-256 CD16 ⁺ خلية / ملم ² (P <0.0001) مع 1.5 مل دم و172-378 (P <0.0001) مع 1.75 مل من الدم. وقد تم قياس تشكيل المجمعات TAT في عينات البلازما المماثلة من الدم المحتضنة مع الخلايا إما غير المعالجة أو المعالجة TNFα (الشكل 2G). حفز خلايا TNFα يسببها لمضاعفة التقريبية المجمعات TAT بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة.

figure-results-1
تينلدى عودتهم 2: وظيفة من البطانية الدم نموذج غرفة الخلية. وحضنت (A) غرف مع أو بدون CHS مع الدم الكامل. دون كلية العلوم الصحية، تم تشكيل لتجلط بعد 30 دقيقة. كان قياس الثرومبين، مضاد الثرومبين (TAT) المجمعات، وهي علامة غير مباشرة للتخثر في الدم المحتضنة دون CHS> 6000 ميكروغرام / مل. (ب) حجم الدم لا اصلت التحرك من قبل فقاعة الهواء الدورية سوف تختلف مع حجم الدم المختلفة. مع إضافة 1.5 مل من الدم، وهذا سوف يكون حجم 0.3 مل، في حين أنه سيرتفع إلى 0.74 مل مع إضافة 1.75 مل. (C) HUVEC تصوير مع مجهر تباين الطور عرض نموذجي مورفولوجيا الخلايا البطانية أحادي الطبقة متموجة من قبل الاتصال الدم. (D) القيم TAT للغرف تماما CHS المغلفة تظهر اختلاف طفيف عند إضافة كميات الدم المختلفة. أدت إضافة 1.5 مل من الدم في 35 ± 11 ميكروغرام / مل (ن = 7) بالمقارنة مع 1.75 مل، والتي أسفرت عن 8577. 70 ميكروغرام / مل TAT (ن = 8). هذا الاختلاف لم يعد موجودا عندما يتم تحضين HUVEC مع حجم الدم نفسه. 66 ± 55 ميكروغرام / مل 1.5 مل (ن = 5) و 66 ± 29 ميكروغرام / مل مقابل 1.75 مل (ن = 7). (E) الكمي لعدد من CD16 ⁺ الخلايا موجودة على أي unstimulated أو TNFα حفز HUVECs بعد الاتصال الدم. وارتفع عدد CD16 ⁺ الخلايا بشكل ملحوظ مع TNFα حفز الخلايا المحتضنة إما مع 1.5 مل (القاعدية: 100 ± 40 خلية / مم؛ TNFα: 256 ± 121 خلية / ملم) أو 1.75 مل (القاعدية: 172 ± 67 خلية / ملم. TNFα: 378 ± 185 خلية / ملم) من الدم الكامل (F) صور الممثل unstimulated وTNFα حفز HUVEC الملون لphalloidin (الحمراء)، CD16 (الخضراء) ودابي (الأزرق). شريط النطاق = 250 ميكرومتر (G) تتم مضاعفة تشكيل المجمعات TAT تقريبا بواسطة TNFα حفز الخلايا بالمقارنة مع الخلايا غير المعالجة المحتضنة مع الدم (1.5 مل: 2.1 ± 0.1 مرات أكثر TAT، ن = 3؛ 1.75 مل: 1.7 ± 1.0 مرات أكثر TAT، ن = 4). يتم عرض كافة القيم كما يعني ± الانحراف المعياري. تم حساب قيم ص التي كتبها t الاختبارات المفردة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم الاحتفاظ التفاعلات المتعددة بين الدم وجدار الوعاء الدموي عادة في حالة هادئة نظرا لطبيعتها غير لاصقة ومكافحة الجلطات من البطانة. ⁷ خلال الحالات المرضية التي تشمل التهاب، يتم تنشيط البطانة مع الزيادة الناتجة في التصاق مستقبلات التعبير ⁸ و القدرة على خفض تمنع الارقاء. ⁹ تفعيل أنظمة شلال في الدم بدوره تضخيم thrombogenicity من البطانة التسبب في مزيد من تجلط الدم والكريات البيض التوظيف. ¹⁰ للحصول على فهم أفضل لهذه التفاعلات الحساسة بين الخلايا البطانية والدم كله، لدينا وضعت الرواية في طريقة المختبر حيث يتم وضع الخلايا البطانية مثقف في اتصال مع دم بأكمله. على حد علمنا، والإعداد لدينا هو الأول لإظهار الخلايا البطانية المحتضنة مع الدم البشري كله مع عدم وجود تخثر أو القليل جدا لفترات زمنية أطول.

يتم تمكين NT "> إن حساسية هذا النظام عن طريق بزل الوريد نظام مفتوح في تركيبة مع طبقة واقية من الهيبارين ثبتوا على جميع الأسطح وضعت في اتصال مع الدم. إن استخدام نظام مفتوح خلال شراء الدم يقلل من تفعيل أنظمة شلال خلال بزل الوريد في حين السماح باستخدام كمية تحددها الذات من تخثر. ومع ذلك، قد تكون استخدمت المتاحة تجاريا أنابيب الدم اجلاء اعتمادا على نقطة نهاية المقصود من هذه الدراسة، وتركيز النهائي من تخثر تضاف إلى أنابيب مغلقة نظام أكثر المتاحة تجاريا قد تمنع الحساسية وخلاف ذلك من الصعب للدراسة، التفاعلات في الإعداد. ⁶ يقضي على سطح الهيبارين واقية مزيد تفعيل الدم عن طريق الاتصال من قبل أي سطح السطوح الأخرى من الخلايا البطانية. ⁵ وفي الواقع، حضانة الدم الكامل تستكمل مع كمية صغيرة من الهيبارين غير المجزأ في أسفرت الغرفة دون حماية من كلية العلوم الصحية في تكوين الجلطة.

فقاعة الهواء داخل الغرفة يمكن خلط الدم أثناء الحضانة مع الخلايا البطانية. من أجل تقييم تأثير حجم فقاعة الهواء، وكنا مجلدين الدم المختلفة. في هذا النموذج، قمنا بقياس مستويات TAT مماثلة بغض النظر عن حجم فقاعة الهواء في غرف المحتضنة مع HUVEC. كان TAT، ولكن، مع زيادة حجم أصغر فقاعة الهواء في كلية العلوم الصحية بالكامل تعامل الدوائر. هذا، وفقا لسبق وصفها خصائص الخلايا البطانية ^11، يشير إلى وجود تأثير تنظيمي على تفعيل زيادة التخثر التي تقدمها الخلايا البطانية التي تفتقر في قاعة كلية العلوم الصحية الخاملة. فقاعة الهواء في نظام يخلق تدفق على دوران الغرفة. فإن حجم فقاعة تؤثر على القوى داخل هذا النظام بالتناوب. ويظهر ذلك من خلال نتائجنا في الشكل 2D كانت فقاعة صغيرة تخلق TAT القيم الأعلى تمثل قوة انخفضت على سبيل المثال الدم، وحركة الدمداخل غرفة أقل وبالتالي تفعيل نظام شلال يحدث إلى حد أعلى. وتجدر الإشارة إلى أنه في هذا النظام ونحن على خلق تدفق الدورية التي سوف تكون مختلفة في سرعة عبر الغرفة مع أعلى سرعة على طول الجدران وأدناها في المركز. ومن الواضح أن هذا لا يشكل بيئة مثلى فيما يتعلق بالتدفق وإجهاد القص للحصول على الخلايا البطانية، ولكن لا يزال لدينا نظام تحقيق نتائج مستقرة وقابلة للتكرار. ستشمل ظروف أكثر المثلى تعميم تدفق الصفحي في غياب الاضطرابات. هذا هو، ومع ذلك، لا يمكن في النموذج الممثلة هنا وعلى حد علمنا هذا النظام غير متوفر حتى الآن. على الرغم من ذلك، هناك العديد من النظم المتاحة تجاريا ميكروفلويديك التي لا يمكن أن تتحد مع الدم كله مع عدم وجود أو انخفاض مستويات تخثر إضافتها إلى النظام وبالتالي تفشل في تمكين تقييم حساسية السليم للتفاعلات بين جميع المكونات موجودة في الدم والخلايا البطانية.

وعلاوة على ذلك، كانت هناك زيادة بنسبة 2 أضعاف في تجنيد خلايا الدم نحو TNFα تنشيط HUVEC في توليفة مع تشكيل تضاعف من TAT بشكل مستقل من حجم الدم. هذا يتحقق استقرار النظام النموذج ويظهر أيضا إمكانية استخدام البطانة تفعيلها بالاشتراك مع الدم الكامل. على المستقبل، غرفة الخلية البطانية الدم يمكن استخدامها لتحقيق تجنيد خلايا الدم نحو الخلايا البطانية تفعيلها من خلال مجموعة متنوعة من العلامات أعرب عن الخلايا تحت مختلف الظروف والمراحل التنشيط. وعلاوة على ذلك، فإن النموذج يمكن أن تستخدم في تركيبة مع وكلاء الدوائية من أجل تقييم الآثار المترتبة على حالات الالتهابات.

باختصار، نقدم لك مجموعة من فائدة عظيمة للجمع بين نموذج الغرفة مع خلايا الدم والأوعية الدموية البشرية لخلق إنسان كامل في نظام المختبر لإجراء تحقيقات ذات الصلة من أمراض الأوعية الدموية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من المجلس السويدي للبحوث (90293501، A0290401، A0290402)، البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية بموجب اتفاقية المنحة رقم 602699 (DIREKT)، ومؤسسة NovoNordisk، ومؤسسة Gurli وإدوارد Brunnberg، الجذعية العلاج، Vleugel مؤسسة ومؤسسة آك WIBERG.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الخلايا البطانية الوريدية البشرية (HUVEC)	PromoCell	C-12200	يمكن استخدام أي نوع آخر من الخلايا البطانية البشرية الأولية.
وسط نمو الخلايا البطانية MV (ECGM MV)	PromoCell	C-22120
الجيلاتين	سيجما-ألدريتش	G-2500	قم بإعداد 1٪ جيلاتين في PBS ، واحتضان 5 مل في T75 لمدة 15 دقيقة ثم قم بإزالته قبل زراعة الخلايا.
مختبر أبحاث الإنزيم	TAT ELISA	TAT-EIA-C
فأر مضاد للإنسان CD16	DAKO	F7011	التخفيف 1:100
الماعز المضاد للفأر Alexa 488	المجسات الجزيئية	A11001	التخفيف 1: 500
الفالودين-تكساس	مجسات الجزيئية	الحمراء A22287	التخفيف 1: 200
مجسات جزيئية	DAPI	D1306	التخفيف 10 & mu ؛ جم / مل
EDTA	Sigma	E-6758
0.25٪ Trypsin-EDTA	Gibco Life Tecnologies	25200-056
مصل الأبقار الجنيني (FBS)	Gibco Life Technologies	10437
1 شرائح زراعة خلايا البئر	BD Falcon	354101
Blood Chambers	NA		NA يمكن تصنيعها في PMMA أو أي بلاستيك آخر قادر على ربط CHS
المشابك	مكتب	مستودع 2052204
كورلين الهيبارين السطحي (CHS)	أنظمة الكورلين AB	945-00
إبرة تحت الجلد	Terumo	NN-1850R	الحجم: 18 جم × 5 مم
الهيبارين غير المجزأ (UFH) Leo	Pharma	585679
K_{3< / sub>EDTA}	Alfa Aesar	1709958	قم بإعداد محلول مخزون 0.34 متر في milliQ H_{2< / sub>O}
PFA	Sigma-Aldrich	P-6148
مجهر مضان	نيكون	80i
مجهر ضوئي	نيكون	TS100
برنامج تحليل الصور	Broad Institute	CellProfiler	متاح مجانا في www.cellprofiler.org

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology. J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).
Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin. Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).
Doctor, A., Spinella, P. Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In. Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).
Andersson, J., et al. Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro. J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).
Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).
Aird, W. C. Spatial and temporal dynamics of the endothelium. J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).
Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).
Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors. J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).
Esmon, C. T. Molecular circuits in thrombosis and inflammation. Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).
Rosenberg, R. D., Aird, W. C. Vascular-Bed–Specific Hemostasis and Hypercoagulable States. N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD16

رواية في المختبر نموذج لدراسة التفاعلات بين الدم الكامل الإنسان والبطانة Endothelium

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة