قد يكون عرض جنين الدجاج والوصول إليه أثناء التطور أمرا صعبا. لقد قمنا بتطوير طريقة ex ovo بسيطة وفعالة من حيث التكلفة ويمكن استخدامها بسهولة في الفصل الدراسي أو بيئة البحث. توفر هذه الطريقة الوصول إلى الجنين في المراحل المتأخرة من التطور الجنيني (HH 40).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الأمثل السابقين البيضة التثقيف من الفرخ الأجنة إلى مراحل متقدمة من التطوير
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
اعتمدت الأبحاث في علم التشريح وعلم الأجنة وعلم الأحياء التنموي إلى حد كبير على استخدام الكائنات الحية النموذجية. من أجل دراسة التطور في الأجنة الحية ، غالبا ما يتم استخدام الكائنات الحية النموذجية ، مثل الدجاج. يعتبر الدجاج كائنا نموذجيا ممتازا نظرا لتكلفته المنخفضة والحد الأدنى من صيانته ، ومع ذلك فهو يمثل تحديات في الملاحظة لأنه محاط بقشر بيضة غير شفاف. من أجل رؤية الجنين بشكل صحيح أثناء تطوره ، يجب إزالة القشرة أو إزالتها. تم تطوير كل من تقنيات النوافذ والبيضا السابق لمساعدة الباحثين في دراسة التطور الجنيني. ومع ذلك ، فإن كل طريقة لها قيود وتحديات. هنا ، نقدم تقنية بسيطة ومحسنة لزراعة التخميض خارج الأجنة للأجنة الدجاج والتي تتيح مراقبة التطور الجنيني من المرحلة HH 19 إلى المراحل المتأخرة من التطور (HH 40) ، عندما تتطور العديد من الأعضاء. من السهل اعتماد هذه التقنية في كل من الفصول الجامعية ومختبرات الأبحاث الأكثر تقدما حيث يتم إجراء التلاعب بالأجنة.
المقدمة
< p class = 'jove_content'> لعبت زراعة البيضا السابقة دورا مهما في دراسة تطور الدجاج1 ، 2. تم استخدام طريقة الاستزراع هذه لدراسة الأمراض العصبية ، وتطور الأطراف ، وتطور القحف الوجهي ، وكنموذج للتحقيق في التشوهات المرتبطة بمرض السكري 3 ، 4 ، 5.
هناك العديد من الاختلافات في تقنية ex ovo. الطريقة الأكثر شيوعا هي استخدام كوب الستايروفوم6،7،8 أو وعاء زجاجي5. في هذه الطرق ، يتم تبطين الكوب أو الوعاء بغلاف بلاستيكي لاحتضان الجنين ، ويتم وضع غطاء على الكوب ، ثم يتم وضع الجنين في حاضنة ذات رطوبة مناسبة6. ومع ذلك ، يمكن أن يكون هذا الإعداد صعبا من الناحية الفنية. التحدي الأول هو الغلاف البلاستيكي المستخدم في احتضان الجنين. يصعب التعامل مع هذا الغلاف وغالبا لا يلتصق بالكوب جيدا. لحل هذه المشكلة ، يتم وضع شريط مطاطي حول الكوب لتثبيت الغلاف في مكانه. على الرغم من ذلك ، لا يزال من الممكن أن ينزلق الغلاف ، وهو أمر قاتل للجنين. الغلاف البلاستيكي لديه القدرة على التمزق أو الثقب بواسطة الملقط أو الإبر التي يمكن استخدامها أثناء التلاعب بالجنين والملاحظات. أخيرا ، هذا الإعداد ليس مستقرا للغاية ويمكن للطلاب بسهولة ضرب الأكواب. كما أن ارتفاع الأكواب يجعل من الصعب جدا وضع الجنين تحت مجهر مجسم ، والذي له هدف محدود لارتفاع المسرح. تجعل هذه التحديات من الصعب على الطلاب الجامعيين العمل مع أجنة الكتاكيت الحية في مختبرات التدريس ، مثل دورات علم الأحياء التنموية المتقدمة.
تعني التحديات المذكورة أعلاه في طريقة ex ovo أن الباحثين يلجأون إلى طريقة النوافذ 9,10 لعرض تطور الكتاكيت الجنينية. في هذه التقنية ، يتم عمل ثقب أو "نافذة" في قشر البيض الذي يغطي الجنين. يمكن إعادة إغلاق الثقب بشريط لاصق أو شمع9 للسماح بمزيد من التطور الجنيني. على الرغم من أن طريقة النوافذ لها بعض المزايا ، مثل القدرة على عرض التطور الجنيني وسهولة الصيانة ، إلا أن هذه الطريقة لها أيضا العديد من القيود. الأول هو أن النافذة يجب أن تكون كبيرة إلى حد ما لعرض الجنين بأكمله (خاصة في المراحل المتأخرة). ثانيا ، يصعب إغلاق النوافذ الكبيرة. سيؤدي الختم غير السليم إلى مشاكل في العقم والبقاء على قيد الحياة. يضيف استخدام الشمع المنصهر كمادة مانعة للتسرب خطوة أخرى غير مريحة وفوضوية إلى البروتوكول. لذلك ، على الرغم من أن طريقة النوافذ قد تكون مثالية لأجنة الكتاكيت في المراحل المبكرة (HH 11 - HH 27) ، إلا أن مشاهدة الجنين بأكمله في المراحل المتأخرة ليس من السهل تحقيقه.
هنا ، نصف تقنية زراعة ex ovo المحسنة والبسيطة11 التي تتجنب الحاجة إلى معدات عالية التقنية ، ويسهل التعامل معها تحت المجهر المجسم ، وتوفر الدعم الكافي للجنين لإجراء التلاعب المجهري ، وتمكن الباحثين من رؤية نمو الجنين بالكامل جيدا في المراحل اللاحقة من التطور (حتى HH 40-41). مع هذه التطورات في تقنية ex ovo ، يحصل الأفراد على فهم أكثر اكتمالا للتطور الجنيني. على سبيل المثال ، يسمح النمو في مراحل لاحقة للأفراد بمراقبة العمليات التنموية التي لا تحدث حتى هذه النقطة الزمنية ، مثل التعظم وتطور الريش ونمو الأطراف والعينين المتقدمة. الجنين بأكمله والأغشية خارج الجنين والأوعية الدموية مرئية بوضوح. يمكن أيضا إجراء أبحاث أكثر تقدما ، مثل التلاعب الجنيني (أي زرع الخرز المنقوع في مثبطات أو إدخال حواجز بين طبقات الأنسجة) ، ويمكن للباحثين بعد ذلك مراقبة تأثير التلاعب في أجنة المرحلة اللاحقة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يتم سرد كافة الإمدادات في الجدول 1.
1. تخزين الأجنة الدجاج
- احتضان بيض الدجاج من سلالة جالوس جالوس أفقيا عند 37 درجة مئوية مع ما يقرب من 40٪ الرطوبة وتحويل البيض مرة أو مرتين يوميا. تحول البيض المهم لمنع الجنين من الانضمام إلى قشر البيض.
- لا لتحويل البيض في ساعة 24 قبل إنشاء ثقافة وإلا سوف يكون موجودا الجنين بطني إلى كتلة صفار البيض وسوف يكون معطوبا على فتح البيض في الخطوة 3. وبالإضافة إلى ذلك، والحفاظ على البيض عند 4 درجة مئوية درجة لمدة لا تزيد على أسبوع قبل الحضانة في التنمية "وقف" ولكن هذه ليست مثالية.
2. التدريج الأجنة الدجاج
- استضافة أجنة الدجاج باستخدام همبرغر وهاميلتون 12 الجدول التدريج. مرحلة مثالية لإقامة زراعة-البيضة السابقين هي HH مرحلة 19-20 (حوالي 3- يوما من الحضانة) تيروause هذا بعد فترة وجيزة يتحول الرأس في 53 HPF.
ملاحظة: يتميز صاحب السمو مرحلة 19-20 من الصفات المورفولوجية التالية: يتم تمديد somites في الغالبية العظمى من الذيل، ولكن النهاية من الذيل يبقى unsegmented، وكرة لولبية من المهد ذيل، والسقاء صغير والأوعية الدموية محدودة، المحطة براعم هي أكبر من الجناح البراعم والعيون unpigmented أو لديها هوى رمادي.
3. إزالة الأجنة من شل
- قبل إزالة الجنين من قذيفة، رش قذيفة مع الايثانول 70٪ واتركه حتى يجف. لا تتحول البيضة بسرعة حيث سيؤدي ذلك إلى تلف الجنين.
- والحرص على عدم تغيير اتجاه البيض، والكراك بعناية البيض على الجانب السفلي (أي الجانب الذي كان بطني أثناء الحضانة) والافراج عن الجنين في عقيمة تزن قارب (88 س 88 × 23 ملم). مسح أسفل تزن القوارب مع 70٪ من الإيثانول. تفقد الجنين للتأكد من أن الكيس المحي غير تالف. إذا صفار حكما مكسورة، وتجاهل الجنين، كما انها لن البقاء على قيد الحياة.
- مراقبة الجنين للتأكد من أنها غير قابلة للتطبيق. كان القلب ينبض، يظهر الأوعية الدموية العادية، ولا تشوهات واضحة موجودة. تأكد من أن حواف تزن قارب جافة.
- باستخدام ماصة، وانخفاض 40 ميكرولتر من البنسلين / الستربتومايسين (5،000 وحدة البنسلين، 5 ملغ الستربتومايسين لكل مل) على أعلى من الألبومين للمساعدة في منع العدوى.
4. إعداد غرفة الرطوبة
- وضع كومة صغيرة من كيم مناديل و / أو وسادة ماصة مصنوعة من القطن في الجزء السفلي من وعاء من البلاستيك معقمة (12 × 12 × 6 سم) تمحى مع 70٪ من الإيثانول.
- إضافة الماء المعقم، المقطر لترطيب كيم مناديل و / أو القطن (حوالي 150 مل من الماء).
5. تجميع البيضة السابقين الثقافة
- ضع وزن القارب الذي يحتوي على الجنين في أعلى الحشو رطبة. ثم، ومكان النصف من مربع معقم بتري طبق (9.5 X 9.5 سم) على رأس ركان وزن القارب لتشكيل غطاء فضفاض.
- تغطية حاوية بلاستيكية مع غطاء لها. اضغط لأسفل ركنين من الغطاء، وضمان وجود ختم الجزئي الذي لا يزال يسمح لتدفق الهواء جيدة داخل الغرفة.
- وضع بعناية الإعداد إلى C حاضنة 37 درجة حتى المرحلة المطلوبة.
- وضع حاويات من المياه في الحاضنة للمساعدة في السيطرة على الرطوبة، وإذا حاضنة الرطوبة تسيطر عليها غير متوفرة. تعقيم جميع المياه في غرف الرطوبة والحاضنة وتجديد حسب الحاجة أثناء فترة الحضانة. 40٪ نسبة الرطوبة مثالية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هذه البيضة السابقين الأسلوب يسمح لمراقبة الأجنة من المراحل الأولى من التنمية (HH 19/20) إلى المراحل المتأخرة للتنمية (HH 40-41) (الشكل 1A و 1B). وضع الثقافة في HH 19-20 يزيد بقاء الأجنة في الثقافة. وقبل رأسه تحول (قبل 53 HPF) البقاء على قيد الحياة ضئيلة جدا في الثقافة وبعد المرحلة 21، والجنين يميل إلى التمسك أكثر إلى قذيفة على إزالة حتى يتم الحصول على عدد أقل من الأجنة سليمة. بشكل عام، البقاء على قيد الحياة للجنين في البيضة السابقين
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
البيضة السابقين زراعة ووضع النوافذ على حد سواء لها مزايا وتحديات. نحن هنا مقارنة المزايا والتحديات من الكأس السابق الستايروفوم البيضة طريقة وأسلوب النوافذ لدينا سابقا الأمثل البيضة الطريقة هو موضح هنا. لدينا وسيلة تمكن التلاعب والمراقبة سهلة للجنين الفرخ في المراحل المتأخرة من التطوير والتحسينات جهدنا لالسابقين التقليدي البيضة طريقة 1، 2، 3 جعلها بالإضافة إلى ذلك من السهل جدا للاستخدام في الفصول مختبر التدري...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة في ما يخص المعلومات الواردة في هذه المخطوطة.
شكر وتقدير
ونود أن نشكر بول بوارييه، ومنتج وسائل الإعلام، في جبل جامعة سانت فنسنت لعمله في تصوير وتحرير جزء الفيديو من هذه المخطوطة. ونحن نعترف العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا للحصول على التمويل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| البنسلين / الستربتومايسين | سيجما | P4458 | قم بعمل كميات صغيرة لتجنب أحداث التجميد / الذوبان |
| بتري | 9.5 سم × 9.5 سم | ||
| وزن قارب | فيشر 8732113 العلمي | 88 × 88 × 23 مم | |
| حاوية زيبلوك | Ziplock N | / A | 12 سم × 12 سم × 6 سم |
المراجع
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
- Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
- Dorrell, M. I., et al. Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development. American Biology Teacher. 74 (9), (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88, 49-92 (1951).
- Drossopoulou, G., et al. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling. Development. , 127-1337 (2000).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522(2013).
- Franz-Odendaal, T. Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus. Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
