استئصال الغدة الزعترية هو تقنية قيمة في البحوث المناعية. هنا ، يتم وصف بروتوكول لاستئصال الغدة الزعية الكامل في الفئران البالغة باستخدام بضع القص المصغر جنبا إلى جنب مع التنبيب غير الجراحي والتهوية بالضغط الإيجابي لتقليل المراضة والوفيات في الفترة المحيطة بالجراحة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التيموس كاملة في الجرذان الكبار مع غير الغازية التنبيب الرغامي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التيموس في القوارض حديثي الولادة هي إجراءات المتبعة وموثوق بها للدراسات المناعية. ومع ذلك، في الفئران البالغات، ومضاعفات النزف واسترواح الصدر من اضطراب الجنبي يمكن أن يؤدي إلى معدل وفيات كبيرة. هذا البروتوكول هو طريقة بسيطة لاستئصال التوتة الفئران التي تستخدم مصغرة القص والتنبيب الرغامي. ويتم إنجاز التنبيب مع طريقة غير الغازية واستنساخه بسهولة، ويسمح للتهوية بالضغط الإيجابي لمنع استرواح الصدر والشعب الهوائية للرقابة التي تتيح الوقت الكافي للدقيق الغدة الصعترية تشريح للحد من انقطاع الجنبي. وهناك 1.5 سم شق القصية يقلل اتصال مع السفن المنصفية وغشاء الجنب، في حين لا يزال توفير التصور الكامل للالغدة الصعترية. بعد التعرض للالمنصف، يتم إزالة الغدة الصعترية التي كتبها تشريح حادة تحت التكبير. ثم يتم مختومة الفضاء الجنبي من قبل الإغلاق خياطة العضلات قبل القصبة الهوائية تليها تطبيق الغراء الجراحي. الثم يتم إغلاق الصدر بإغلاق خياطة من القص، تليها إغلاق خياطة الجلد. كانوا جميعا thymectomies كاملة كما يتضح من المناعى (IHC) تلطيخ من الأنسجة المنصفية، وغياب T-خلايا ساذجة التدفق الخلوي، وكان الإجراء معدل البقاء على قيد الحياة 96٪. هذا الأسلوب هو مناسبة عندما هو المطلوب التيموس الكامل مع الحد الأدنى من المضاعفات لمزيد من الدراسات المناعية في الفئران الكبار athymic.
المقدمة
منذ أوائل 1960s، وقد تم الاعتراف الغدة الصعترية لدوره الحيوي في تنمية التحمل المناعي المركزي. وقد ثبت القوارض التيموس أن يكون الإجراء أساسي في تحديد دور الغدة الصعترية في تمايز الخلايا اللمفاوية والتسامح الذات، وتحمل مناعي في تحديد زرع المزروع وورم خبيث. إزالة الغدة الصعترية الفئران تسمح للدراسات التي تنطوي على استنزاف T-الخلية أو نقل بالتبني من سكان الخلية T محددة دون عودة ظهور خلايا T ساذجة الأم.
Thymectomies في القوارض حديثي الولادة ويمكن تحقيق ذلك باستخدام تقنية الشفط مع نتائج يمكن الاعتماد عليها 1. في الفئران البالغات، ويرتبط هذا الأسلوب مع معدل وفيات تقريبي 20٪ والنتائج في كثير من الأحيان في التيموس غير مكتمل 2. لتحقيق باستمرار التيموس الكامل في الفئران الكبار، مطلوب التعرض المفتوحة للالمنصف من خلال القص المتوسط. ومع ذلك، هذاويرتبط الإجراء مع المضاعفات التي تشمل إصابة القصبة الهوائية، والنزف واسترواح الصدر مما يؤدي إلى معدل الوفيات الإجمالي تتراوح 1،5-6٪ 2- 4.
وعلى مدى العقدين الماضيين تحسينات في تقنيات التيموس انخفضت مضاعفات المحيطة بالجراحة وتحسنت معدلات البقاء على قيد الحياة. التنبيب الرغامي السماح للتهوية بالضغط الإيجابي قد تراجعت معدلات استرواح الصدر 5. طرق التنبيب وصف في وقت سابق مجموعة من التعرض مفتوحة إلى القصبة الهوائية إلى أساليب أقل الغازية باستخدام التصور الحبال الصوتية المباشر. المضاعفات المرتبطة إجراء التنبيب وتشمل إصابة القصبة الهوائية، وتمزق الحبال الصوتية، التنبيب المريء غير مقصود، ونزيف الناتجة عن ثقب في القلب أو تهتك من الوريد الأجوف العلوي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن مقربة من فصوص الغدة الصعترية السفلى لبطانة الجنبي يؤدي إلى استرواح الصدر.
نحن هنا وصف تقنيةالتيموس من خلال مينيملي 2 سم شق الجلد التالية طريقة بسيطة لالتنبيب الرغامي باستخدام angiocatheter اضعافها نهاية والقصبة الهوائية عبر الجلد الإضاءة. والتيموس ينطوي على 1.5 سم القص وإغلاق ثلاث طبقات مع تطبيق الغراء الجراحي لختم المنصف والحد من حدوث النزف ومضاعفات في الجهاز التنفسي. هذه الطريقة يؤدي بشكل موثوق في التيموس كاملة كما يتضح من اختفاء CD4 + CD8 + وخلايا T ساذجة التالية التيموس وعدم وجود أنسجة الغدة الصعترية على IHC تلطيخ. يتم الاحتفاظ مرات المنطوق وفيات شبه الإجرائية إلى أدنى حد ممكن.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تم القيام به جميع الإجراءات التجريبية التي تنطوي على استخدام الجرذان وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان في جامعة ديوك.
1. إعداد تنبيب الرغامي قنية
- قطع نهاية الإبرة من 2 بوصة 14 G angiocathether إبرة مع كماشة.
- قرصة التجويف من الإبرة مغلق مع كماشة إبرة الانف.
- قطع قسم مقروص وصولا الى حافة الجزء التجويف المفتوح مع كماشة القطع، ثم قطع حواف على جانبي نهاية المتبقية في 30 - 45 درجة زاوية إلى حافة الإبرة.
- ضع أسفل 3-4 ملم قنية في منطقة مفتوحة من كماشة الانزلاق مشترك على التوالي، وسحب صعودا حتى تم تشكيل منحنى صاعد طفيف في نهاية المطاف.
ملاحظة: وسوف يسهل هذا توجيه قسطرة في القصبة الهوائية (الشكل 1). - استخدام الصنفرة غرامة لضمان سلاسة أسفل حواف في نهاية قنية.
- العودة الصك اضعافها في أنابيب angiocatheter. تأكد من أن أنابيب أقصر قليلا من الإبرة أضعفت.
إجراءات 2. قبل الجراحة
- إعداد موقع لإجراء العملية عن طريق وضع مجهر التشغيل المقرر أن 10X التكبير على المنطقة التشغيل.
- وضع وسادة الاحترار على منطقة التشغيل وتغطية مع وسادة الاستيعابية نظيفة.
- تشكيل لمعدل ضربات القلب ورصد الأوكسجين في الدم بالقرب من حقل الجراحي.
- وزن الفئران في الوزن القائم على الدواء الجرعات (على سبيل المثال، تسكين بعد العملية الجراحية، والمضادات الحيوية، أو اللمفاويات المستنفدة الضد).
ملاحظة: النموذجية الجرذان الكبار تزن ما بين 350-450 جرام. - رزين الفئران مع تبخيرها 3٪ الأيزوفلورين-O 2 (3 لتر / دقيقة) باستخدام غرفة الاستقراء تنفيس إلى نظام الكسح الغاز مخدر النفايات المحتوية على الفحم المنشط. سماح 5 دقائق للتخدير الحث على توفير التخدير العميق ضروري لالتنبيب الرغامي.
- إدارة كاربروفين أو Meloxicane (4.4 ملغ / كلغ) تحت الجلد لالفئران قبل الشروع في التنبيب والجراحة.
- استخدام كليبرز الكهربائية لحلاقة الرقبة والصدر من الفئران تخدير قبل التنبيب.
3. التنبيب
- تحضير الإعداد التنبيب عن طريق فرك كمية صغيرة من تزييت (على سبيل المثال، هلام KY) على نهاية قنية التنبيب. بدوره على جهاز التنفس الصناعي لبدء تدفق الغاز الأيزوفلورين من خلال أنابيب الموصل.
- نقل الفئران إلى جهاز التنبيب وتعليق الفئران على قضيب معدني التي كتبها العلوي القاطعة الأسنان (الشكل 2A).
ملاحظة: يمكن شراء الأجهزة التنبيب بعض على الانترنت. محلية الصنع نموذج هو موضح هنا باستخدام الاكريليك ورقة مصبوب حول أجزاء من 2 × 4 بوصة قطعة قطني باستخدام شعلة غاز البوتان، وتعلق تعزيزات مع الكلوروفورم. يتم إرفاق شريط (أو الأسلاك المعدنية) من خلال حفر ثقوب على اخفاء الشريط وضعت على الصورةبيئة تطوير متكاملة من الاكريليك لمنع انشقاق أو تكسير. - عبر تسليط الضوء على رقبة الفئران عن طريق وضع مرنة مصدر ضوء عالي الكثافة 1 - 2 سم من السطح البطني من الرقبة (الشكل 2B).
- استخدام زوج من الطلاب ملقط نمط القياسية لسحب اللسان بلطف صعودا وإلى جانب الأسنان السفلية. قبضة اللسان بين الإبهام والسبابة من يد واحدة في حين وضع السطح داخل شقة من جانب واحد من ملقط ضد الطرف الأدنى من اللسان. الصحافة البطني لفضح سان المزمار وفتحة الحنجرة (الشكل 2C).
- تصور الحبال الصوتية وتوجيه مقلوبة، نهاية قلل من قنية التنبيب الأمامية من خلال المزمار مفتوحة إلى القصبة الهوائية حتى محور angiocatheter اللمسات القواطع.
- إزالة مرود المعدنية، وإرفاق أنابيب التخدير لافتتاح angiocatheter لبدء التهوية مع isoflurane.
ملاحظة: فلو الأوكسجين نموذجيمعدل ث إلى التنفس الصناعي هو 3 لتر / دقيقة مع 3٪ الأيزوفلورين.- ضبط التنفس الصناعي بمعدل 60 التنفس / دقيقة في حجم تسيطر وضع جهاز التنفس الصناعي الذي يحقق ضغط ~ 12-14 مم زئبق. استخدام إيجابي ضغط نهاية الزفير (اللمحة) 3 سم H 2 O.
- مراقبة الصدر التوسع الثنائي جدار متزامنا مع التنفس الصناعي لضمان تحديد المكان المناسب من الأنبوب الرغامي.
- تطبيق الموصى بها الطبيب البيطري العين مرهم للعيون الفئران لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
- تطبيق مرهم البيطري في عيون الفئران لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
- تأمين أنبوب القصبة الهوائية لرئيس الفئران مع شريط من شريط من القماش. ضمان اتصال قوي بين الأنبوب الرغامي وتدفق أنابيب مخدر.
- إرفاق الأوكسجين في الدم ورصد معدل ضربات القلب إلى القدم الفئران ويبدأ الرصد. تأكيد التخدير المناسبة التي تؤكد عدم وجود رد فعل لقرصة ه.
4. بضع الصدر والتيموس
- اتبع الأسلوب العقيم القياسية لمجمل العملية.
- تنظيف الطاولة المنطقة والتشغيل العمل وتطهير مع حل الإيثانول 70٪.
- استخدام القفازات الجراحية المعقمة أثناء إجراء، والأوتوكلاف جميع الأدوات والمواد المستخدمة أثناء العملية.
- تطبيق providone اليود إلى منطقة الصدر بالكامل واتركه حتى يجف. ثم تنظيف سطح الجلد مع الايثانول 70٪ على الشاش. تغطية الفئران مع التفاف واضح من البلاستيك قطع حفرة لفضح مجال التشغيل العقيمة.
- تحديد الشق فوق القص في منطقة الصدر العلوية. جعل 2 سم شق خط الوسط من خلال الجلد ابتداء من 2 - 3 مم فوق الشق فوق القص وتمتد بشكل أقصى خط الوسط على طول القص باستخدام مقص شي حادة ذات الرؤوس.
- إجراء القص 1.5 سم متوسط من الشق فوق القص مرة أخرى باستخدام مقص شي حادة ذات الرؤوس. Kالآثار البيئية الحافة السفلية من مقص فقط تحت القص والتقدم ببطء.
- إدراج ضام ALM صغير فقط تحت عظمة القص فصل ومفتوحة لتكشف عن عضلات حزام قبل القصبة الهوائية (العضلة القصية والعضلات قصي درقي). فصل عضلات حزام قبل القصبة الهوائية باستخدام ملقط غريف حادة. ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن أن ينظر إلى القصبة الهوائية، وينبغي تصور أنبوب التنبيب داخل القصبة الهوائية.
- ضع شوكات من ضام ALM صغير تحت عضلات حزام يفصل والقص. فتح ضام لفضح الجانب متفوقة من الغدة الصعترية.
- استخدام ملقط دومون غرامة للافراج عن الحواف الجانبية للأنسجة الغدة الصعترية وفضح فصوص الغدة الصعترية أقل.
- سحب الغدة الصعترية بلطف متفوق في موقع شق مفتوح، مع الحرص على تجنب الاتصال مع الوريد الأجوف، تحت الترقوة والأوعية السباتية متفوقة، وتقليل تعطل بطانة الجنبي الحساسة بين الغدة الصعترية والرئتين.
- كما رانه الغدة الصعترية يتم تشريح السفن وكشف، استخدم مقص الدقيقة لتفريقهم. استخدام قطعة من القطن لعقد الضغط على السفن لالارقاء إذا لزم الأمر.
- تقديم فصوص الغدة الصعترية أقل في شق ثم ليز بحدة المرفقات الخلفي. إزالة الغدة الصعترية سليمة وتفتيش بعناية الغدة الصعترية إزالة لأية أقسام عداد المفقودين.
ملاحظة: قد يكون تصور الغدد الليمفاوية الصدرية الصغيرة المحيطة الغدة الصعترية وغالبا ما يصعب تمييزها عن نسيج الغدة الصعترية. وستكون هذه العقد جولة منفصلة مع مظهر مماثل لأنسجة الغدة الصعترية ولكن لن يكون في تواصل مع الغدة الصعترية. - إزالة ضام ألم وإغلاق عضلات القصية اللامية وsternothyoid مع اثنين من توقف 5-0 الغرز ماكسون.
- تطبيق 2 قطرات من الصف الجراحية لاصقة الأنسجة cyanoacrylate عبر الغرز لختم المنصف تحت التهوية بالضغط الإيجابي.
ملاحظة: هذا سيقلل من حدوث استرواح الصدر وورم دموي. - إغلاق شارعernum مع اثنين من توقف 4-0 خيوط الحرير على إبرة القطع. أدخل الإبرة من خلال الفجوات بين الأضلاع، مع الحرص على توجيه الإبرة فقط تحت القص لتجنب طبقة العضلات الأساسية.
- إغلاق طبقة الجلد مع تشغيل 4-0 نايلون خياطة. وقف الأيزوفلورين في هذه المرحلة لتقصير فترة الشفاء التخدير بعد الجراحة.
- تنظيف الموقع وشق الجلد المحيط مع مبلل المالحة الشاش.
- تطبيق عدة قطرات من Bupivicaine (0.25٪) لتخدير موضعي، تليها 1 - 2 قطرات من الغراء cyanoacrylate خلال شق لختم الجرح.
- مواصلة لتهوية حتى يظهر الفئران علامات من الجهد التنفسي مستقل ويبدأ التحرك الأطراف فيها. ينزع الأنبوب الفئران والسماح لها لاسترداد تحت مراقبة وثيقة في قفص وضعها على وسادة الاحترار.
- إدارة البوبرينورفين (0،01-0،05 ملغ / كلغ) تحت الجلد لالفئران مباشرة بعد العملية وتكرار كل 8-12 ساعة لمدة 48 ساعة بوالحادي والجراحة (عادة 5 جرعات الإجمالية). في 24 و 48 ساعة بعد العملية، وإدارة كاربروفين أو Meloxicane (4.4 ملغ / كلغ) تحت الجلد (3 مجموع الجرعات بما في ذلك جرعة ما قبل المنطوق).
- تواصل رصد حتى الفئران تتحرك حول القفص. في أي علامات ضيق التنفس، وأداء إعادة التنبيب وإعادة استكشاف للالصدر.
- لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه أنه كاف للحفاظ على الاستلقاء القصية.
- لا يعودون الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.
- إزالة الغرز طبقة الجلد 1 أسبوع بعد العملية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تنفيذ هذا الإجراء على الفئران لويس البالغين (ن = 26). كان الوقت تشغيل متوسط 15 ± 3 دقائق. لم يكن هناك أي وفيات أثناء العملية. كان 45 ± 5 ثانية - في الوقت نفسه التنبيب - من وضع الفئران على الجهاز التنبيب لإنشاء التهوية. وكان 24 الفئران الشفاء التام من العملية مع أي دليل على صعوبة التنفس أو النزف خلال اليوم بعد العمليات الجراحية (POD) 14. أحد الفئران المتقدمة صعوبة في التنفس على POD 4 وخضعت إعادة عملية لاستكشاف المنصف. تم العثور على الفئران أن يكون الفص الرئة المنهار. وبعد إعاد...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوفر هذا البروتوكول لالتيموس الكامل نهج مينيملي مع شق ثلاث طبقات الإغلاق مع تطبيق الغراء الجراحية مصممة لتقليل المضاعفات. وقد تجلى إزالة كاملة من الغدة الصعترية عن فقدان خلايا T ساذجة وIHC تلطيخ من الأنسجة اللمفاوية المنصفية لcytokeratin.
إجراءات التيموس الفئران الكبار وقد تعقدت معدلات وفيات تتراوح 1،5 حتي 20٪ بسبب شبه المنطوق مضاعفات، ومعظمها هي تعزى إلى جمعية الحميمة من الفصوص السفلى من الغدة الصعترية مع غشاء ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل AI101263 من المعاهد الوطنية للصحة (T.V.B) ، وبمنحة من مؤسسة هارتويل (M.L.M). M.L.M. عضو في مركز ديوك الشامل للسرطان.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2 بوصة 14 جرام قسطرة | |||
| مجهر تشغيل | وسادة | ||
| ضربات القلب وأكسجة الدم للقوارض مع مستشعرات القدم | Harvard Apparatus | ST1 72-8010 ، ST1 72-8098 (مستشعر قدم الفئران) | |
| انظر <قوي>الشكل 2< / قوي > | |||
| نظام تخدير للحيوانات الصغيرة مع صندوق الحث وخزان الأيزوفلوران وخزان O2< / sub> | Harvard Apparatus | ST1 72-6420 | |
| جهاز تهوية الصغيرة مع أنابيب | CWE | 12-02000 (جهاز التنفس الصناعي) و 12-04000 (مجموعة الصمام الخارجي للفئران / الفئران) | |
| الألياف البصرية عالي الكثافة | دولان جينر | EEG 2823M | |
| ملقط نمط قياسي للطالب | أدوات العلوم | الدقيقة 91100-16 | |
| مقص مستقيم ناعم | أدوات العلوم | الدقيقة 14060-09 | |
| مقص الشيا ذو الرأس الحاد | أدوات العلوم | الدقيقة 14105-12 | |
| ضام الصدق الصغير (للقص) | أدوات العلوم الدقيقة | 17008-07 | |
| ملقط غرايف حاد | أدوات العلوم الدقيقة | 11050-10 | |
| ملقط دومون | ناعم أدوات العلوم | الدقيقة 11254-20 | |
| 5-0 خيوط ماكسون | Ethicon | ||
| 4-0 خيوط حريرية (مع إبرة قطع) | Ethicon | ||
| 6-0 خياطة نايلون | غراء Ethicon | ||
| Cyanoacrylate (Endermil) | |||
| جل تزييت | Akorn Animal المساهمات الوطنية للصحة | 17478-162-35 |
المراجع
- Hard, G. C. Thymectomy in the neonatal rat. Lab. Anim. 9 (2), 105-110 (1975).
- Kobayashi, E., et al. A technique for complete thymectomy in adult rats. J. Immunol. Methods. 1759 (94), 0-3 (1994).
- Delrivière, L., Gibbs, P., Kobayashi, E., Kamada, N., Gianello, P. New technique of complete thymectomy in adult rats without tracheal intubation. Microsurgery. 18 (1), 6-8 (1998).
- Walker, K. G., Jacques, B. C., Tweedle, J. R., Bradley, J. A. A simpler technique for open thymectomy in adult rats. J. Immunol. Methods. 175 (1), 141(1994).
- Na, N., Zhao, D., Huang, Z., Hong, L. An improved method for rat intubation and thymectomy. Chin. Med. J. (Engl). 124 (17), 2723-2727 (2011).
- Kastl, S., et al. Simplification of rat intubation on inclined metal plate). Adv. Physiol. Educ. 28 (1-4), 29-34 (2004).
- Weksler, B., Ng, B., Lenert, J., Burt, M. A simplified method for endotracheal intubation in the rat. J. Appl. Physiol. 76 (4), 1823-1825 (1994).
- Jou, I. M., et al. Simplified rat intubation using a new oropharyngeal intubation wedge. J. Appl. Physiol. 89 (5), 1766-1770 (2000).
- Rivard, A. L., et al. Rat intubation and ventilation for surgical research. J. Invest. Surg. 19 (4), 267-274 (2006).
- Zhao, D., et al. A model of isolated, vascular whole thymus transplantation in nude rats. Transplant Proc. 44 (5), 1394-1398 (2012).
- AbuAttieh, M., et al. Affinity maturation of antibodies requires integrity of the adult thymus. Eur. J. Immunol. 42 (2), 500-510 (2012).
- Reeves, J. P., Reeves, P. A., Chin, L. T. Survival surgery: removal of the spleen or thymus. Curr. Protoc. Immunol. 1 (Unit 1.10), (2001).
- Siemionow, M., Izycki, D., Ozer, K., Ozmen, S., Klimczak, A. Role of thymus in operational tolerance induction in limb allograft transplant model. Transplantation. 81 (11), 1568-1576 (2006).
- Satoh, E., et al. Immunosuppressive effect of long-term drainage of thoracic duct on immunological memory in adult thymectomized rats. Transplant. Proc. 37 (4), 1947-1948 (2005).
- Groen, H., Klatter, F., Pater, J., Nieuwenhuis, P., Rozing, J. Temporary, but Essential Requirement of CD8+ T Cells Early in the Pathogenesis of Diabetes in BB Rats as Revealed by Thymectomy and CD8 Depletion. Clin. Dev. Immunol. 10 (2-4), 141-151 (2003).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
