مقالة منهجية

هجين طريقة استخراج الحمض النووي للتقييم النوعي والكمي للمجتمعات البكتيرية من عينات الدواجن الإنتاج

DOI:

10.3791/52161

⸱

ديسمبر 10, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Egg Safety and Quality Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 2Poultry Microbiological Safety and Processing Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 3Department of Biochemistry and Biophysics, Oregon State University, 4College of Public Health, University of Georgia, 5Department of Biological Sciences, Center for Microbial Genetics and Genomics, Northern Arizona University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير طريقة جديدة لاستخراج الحمض النووي الهجين شبه الآلي للاستخدام مع عينات إنتاج الدواجن البيئية وأظهرت تحسينات على طريقة الاستخراج الميكانيكية والأنزيمية الشائعة من حيث التقديرات الكمية والنوعية لإجمالي المجتمعات البكتيرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فعالية بروتوكولات استخراج الحمض النووي يمكن أن تعتمد بشكل كبير على كل من نوع العينة التي يجري التحقيق فيها وأنواع من التحليلات المصب تنفيذها. يمكن النظر إلى أن استخدام تقنيات تحليل المجتمع البكتيرية الجديدة (على سبيل المثال، microbiomics، metagenomics) أصبحت أكثر انتشارا في مجال العلوم الزراعية والبيئية والعينات البيئية العديدة ضمن هذه التخصصات تكون physiochemically وفريدة من نوعها الميكروبيولوجية (على سبيل المثال، البراز وعينات القمامة / الفراش من الدواجن الطيف الإنتاج)، بحاجة الى طرق استخراج الحمض النووي المناسبة والفعالة ليتم اختياره بعناية. لذلك، تم تطوير DNA هجين طريقة استخراج رواية شبه الآلي خصيصا للاستخدام مع عينات إنتاج الدواجن البيئي. هذا الأسلوب هو مزيج من اثنين من أنواع رئيسية من استخراج الحمض النووي: الميكانيكية والأنزيمية. ومكثفة خطوة التجانس الميكانيكية من خطوتين (باستخدام حبة الضرب وضعت خصيصا للبالبيءهتمت إضافة عينات التل) إلى بداية "المعيار الذهبي" الأنزيمية طريقة استخراج الحمض النووي لعينات البراز لتعزيز إزالة البكتيريا وDNA من عينة مصفوفة وتحسين الانتعاش من أعضاء غرام إيجابي المجتمع البكتيري. مرة واحدة وقد بدأ الجزء استخراج الأنزيمي من الأسلوب الهجين، تم أتمتة عملية تنقية المتبقية باستخدام محطة عمل الروبوتية لزيادة الإنتاجية وتقليل العينة خطأ معالجة العينة. وبالمقارنة مع طرق استخراج الحمض النووي صارمة الميكانيكية والأنزيمية، وقدم هذه الطريقة الهجينة الرواية على أفضل أداء مجتمعة عموما عند النظر في الكمية (باستخدام 16S الرنا الريباسي QPCR) والنوعي (باستخدام microbiomics) تقديرات من إجمالي المجتمعات البكتيرية عند معالجة البراز الدواجن والعينات القمامة .

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند تحليل العينات السريرية أو البيئية المعقدة (مثل البراز والتربة) ، هناك طريقتان رئيسيتان تستخدمان لاستخراج الحمض النووي. الأول هو تعطيل ميكانيكي للمصفوفة باستخدام خطوة مكثفة لضرب الخرزة ، في حين أن الثاني هو تعطيل إنزيمي للمصفوفة لإطلاق الخلايا البكتيرية كيميائيا وتثبيط مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل من المصفوفة في وقت واحد. بالنظر إلى الوسائل المختلفة التي يعمل بها هذان النوعان من طرق الاستخراج ، فليس من المستغرب أن تظهر الدراسات السابقة أن طريقة استخراج الحمض النووي المناسبة تعتمد بشكل كبير على العينة والتحليل. أظهرت دراسات استخراج الحمض النووي المقارنة سابقا أن بعض الطرق أكثر ملاءمة لتحسين جودة الحمض النووي وكميته من العينات البيئية1-3 ، بينما أظهر البعض الآخر تحسينات في التحليلات على مستوى المجتمع مثل الرحلان الكهربائي للهلام المتدرج (DGGE) 4-6 ، وتعدد أشكال طول جزء التقييد النهائي (T-RFLP) 7 ، والتحليل الآلي للفاصل بين الجينات الريبوسومي (ARISA) 8 ، والمصفوفات الدقيقةالتطورية 9. لذلك ، يجب استخدام طرق استخراج الحمض النووي المناسبة ، أو تطويرها ، وفقا لأنواع العينات البيئية وأنواع التحليلات التي يتم إجراؤها على تلك العينات ، خاصة بالنظر إلى التطورات الحديثة في تحليلات المجتمع البكتيري.

أصبح تسلسل الجيل التالي

، جنبا إلى جنب مع المزيد من تقييمات المجتمع الكمية (على سبيل المثال ، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)) ، أكثر انتشارا في العلوم البيئية والسريرية ، ومع ذلك ، تم إجراء القليل جدا من الأبحاث لتحديد تأثير طرق استخراج الحمض النووي على مجموعات البيانات هذه. تناولت معظم دراسات مقارنة استخراج الحمض النووي تقديرات المجتمع الميكروبيومي من عينات النموذج البشري أو البشري10،11 ، وليس عينات الزراعية. تناولت دراسات تسلسل الجيل التالي القليلة التي تركز على الدواجن أسئلة ميتاجينوميةمحددة 12،13 أو ميكروبيوميا14. لم يناقشوا تأثير طريقة استخراج الحمض النووي على التحليلات الميكروبيومية الناتجة. بالنظر إلى الطبيعة المعقدة للعينات البيئية المتعلقة بإنتاج الدواجن (على سبيل المثال ، البراز ، القمامة / الفراش ، تربة المراعي) ، يجب اختيار طرق استخراج الحمض النووي بعناية. من المعروف أن العينات البيئية المتعلقة بالدواجن تحتوي على أعداد كبيرة من مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل وقد كانت هناك حاجة إلى تخفيفات مستخلص الحمض النووي تصل إلى 500 ضعف لتفاعل البوليميراز المتسلسل والتحليل اللاحقللمصب 15-17. لذلك من الضروري تحسين طرق استخراج الحمض النووي لهذه الأنواع من العينات ليس فقط من أجل تعطيل المصفوفة جسديا ، ولكن أيضا لتكون قادرة على تقليل / القضاء على العدد الكبير من المثبطات الموجودة.

تعتبر QIAamp DNA Stool Mini Kit ، وهي طريقة استخراج إنزيمية ، "المعيار الذهبي" عند استخراج الحمض النووي من عينات الأمعاء / البراز الصعبة1،18،19 وتم تطبيقها بنجاح على عينات الدواجن البيئية8،14. تعد الإزالة الأنزيمية لمثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال استخدام مصفوفة خاصة واحدة من أعظم مزايا استخدام هذه الطريقة لهذه الأنواع من العينات البيئية ، وكذلك القدرة على تحسين الإنتاجية بشكل كبير (وتقليل خطأ معالجة العينات) باستخدام محطات العمل الآلية. أحد العيوب الرئيسية هو عدم وجود خطوة تجانس ميكانيكية لفصل الخلايا البكتيرية جسديا عن المصفوفة البيئية. عند اختبار عينات الأمعاء والبراز من أصل غير دواجن ، أدت إضافة خطوة ضرب الخرزة أو التعطيل الميكانيكي داخل بروتوكول استخراج الحمض النووي إلى زيادة كفاءة الاستخراجبشكل كبير 9 ، وإنتاجية / جودة الحمض النووي1،4،5 وتحسين تحليلات المجتمع النهائي بشكل كبير من حيث الثراء والتنوع والتغطية5،6،11. لم تقارن هذه الدراسات طرق ضرب الخرز الميكانيكية فقط بالطريقة الأنزيمية "المعيار الذهبي" ، ولكن أضاف بعضها أيضا خطوة ضرب الخرزة الميكانيكية إلى البروتوكول الأنزيمي لتحسين النتائج6،9،11.

وفقا لنتائج الدراسات المذكورة أعلاه ، يمكن تحسين تحليلات المجتمع البكتيري (النوعي والكمي) من العينات البيئية المتعلقة بالدواجن من خلال إضافة خطوة تجانس ميكانيكي إلى الطريقة الأنزيمية. لذلك ، كان الهدف من هذه الدراسة ذو شقين: (1) تطوير تقنية جديدة لاستخراج الحمض النووي تستخدم الجوانب الأكثر رواجا لكل من طرق الاستخراج الميكانيكية (خطوة التجانس القوية) والأنزيمية (إزالة مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل والأتمتة) و (2) مقارنة تقييمات المجتمع البكتيري الكمية (عبر qPCR) والنوعية (عبر الميكروبيومات) لهذه الطريقة الجديدة بالطرق الميكانيكية والأنزيمية التمثيلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التجانس الميكانيكي للدواجن البيئي عينات الإنتاج

  1. قبل استخراج، تعيين حمام مائي إلى 95 درجة مئوية، وتسمح في الوقت حمام الماء لتصل إلى أن درجة الحرارة.
  2. تزن من 0.33 غرام من التربة أو المواد البرازية إلى 2 مل الناشر مصفوفة E الأنبوب.
    1. لا تتجاوز 0.33 غرام من العينة في الأنبوب، لأن هذا سوف يتسبب في الحلول التالية لتتجاوز قدرة الأنبوب.
    2. العينات المجمدة ذوبان الجليد لRT قبل وزنها.
    3. من أجل تحليل ما مجموعه 1 غرام من التربة / البراز، وتزن من 3 تكرار 0.33 ز عينات لكل عينة البيئية الفردية.
    4. عينات في مخزن -20 ° C داخل أنابيب مصفوفة المخروطية قبل الاستخراج، وإذا لزم الأمر.
  3. إضافة 825 ميكرولتر فوسفات الصوديوم العازلة و 275 ميكرولتر من PLS حل لأنبوب العينة. مزيج باستخدام الدوامة ل~ 15 ثانية ثم الطرد المركزي العينات في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق.
  4. صب supernaتانت وإضافة 700 ميكرولتر من العازلة ASL. مزيج باستخدام الدوامة لمدة 5 ثانية.
    1. ضمان وجود فراغ الرأس (~ الحجم الكلي 10٪) متوفرة في أنبوب مخروطي الشكل في هذه المرحلة. إذا لم يكن هناك فراغ الرأس، فإن أنابيب لديهم ميل إلى تسرب خلال الخطوة التجانس المقبلة مما قد يؤدي إلى انتقال التلوث و / أو فقدان العينة.
  5. وضع العينات في FastPrep 24 الصك، والتجانس العينات بسرعة 6.0 م / ثانية لمدة 40 ثانية.
  6. أجهزة الطرد المركزي لعينة متجانسة في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق. نقل طاف لالعقيمة 2 مل أنبوب microcentrifuge.
  7. لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش DNA من العينة، كرر الخطوات من 1،4-1،6، والجمع بين supernatants في نفس عقيمة، 2 مل أنبوب microcentrifuge.

2. الأنزيمية تثبيط المانعون من عينة الخليط

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول كيت QIAamp DNA البراز البسيطة.

  1. احتضانطاف في 95 ° C حمام الماء لمدة 5 دقائق لتعظيم الانتعاش DNA من أي الخلايا المتبقية داخل طاف.
    1. احتضان عند 70 درجة مئوية لمدة العينات التي تحتوي على الكائنات الحية في معظمها سلبية الغرام. لكن في حالة وجود (كما هو الحال مع عينات البراز الدواجن) الكائنات إيجابية الجرام، في احتضان 95 درجة مئوية.
    2. استخدام البلاستيك قفل قطات على أنابيب microcentrifuge للتأكد من أن أنابيب لن "البوب" فتح ويحتمل أن تفقد حجم العينة كما ضغط يمكن أن تتراكم في هذه أنابيب microcentrifuge مختومة.
  2. فتح كل أنبوب microcentrifuge للافراج عن الضغط، وإعادة للحد الأقصى للأنابيب microcentrifuge ومزيج باستخدام الدوامة لمدة 15 ثانية.
  3. الطرد المركزي العينة في 14،000 x ج لمدة 1 دقيقة، وإزالة 1.2 مل من طاف ووضعه في العقيمة 2 مل أنبوب microcentrifuge جديد.
  4. إضافة 1 التبويب InhibitEx لكل عينة، ومزيج باستخدام الدوامة حتى تصبح العينة أبيض موحد / السائل من البيض.
    1. تجنب رouching علامة التبويب InhibitEx حين وضعها في أنبوب microcentrifuge تحتوي العينة. ولتحقيق ذلك، وضع حزمة نفطة التي تحتوي على علامة التبويب مباشرة فوق أنبوب microcentrifuge مفتوحة ودفع برفق فوق علامة التبويب للخروج من حزمة نفطة وإلى أنبوب microcentrifuge.
  5. احتضان العينة لمدة 1 دقيقة في RT (~ 25 ° C) وأجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق.
  6. نقل جميع السائل إلى العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق.
    1. تجنب أي الجسيمات المتبقية التي قد تكون مكعبات في الجزء السفلي من الأنبوب microcentrifuge في نهاية الخطوة 2.5 عند نقل السائل.

3. الآلي DNA تنقية باستخدام الروبوتية محطة QIAcube

ملاحظة: عدد من المواد الاستهلاكية البلاستيكية، وترتيب محولات عينة الدوار داخل أجهزة الطرد المركزي، والكميات المطلوبة من مخازن / حلول تعتمد على الأسطواناتنوفمبر من العينات التي يتم تشغيل.

  1. إضافة أنابيب شطف وأنابيب مرشح لفتحات مناسبة داخل محولات الدوار. لكل عينة، إضافة 400 ميكرولتر إلى فتحة الوسطى من محول الدوار. وضع محولات الدوار في أجهزة الطرد المركزي محطة عمل في الترتيب الصحيح وفقا لعدد من العينات التي تنقيته.
    1. تأكد من أن جميع الأغطية أنبوب microcentrifuge يتم تأمينها بشكل صحيح داخل محول الدوار منذ الفشل في القيام بذلك قد يؤدي إلى قص خلال واحدة من الخطوات الطرد المركزي من بروتوكول تنقية.
  2. إضافة العدد المطلوب من 1،000 ميكرولتر و 200 ميكرولتر تصفية نصائح إلى محطة العمل، وملء الزجاجات عازلة المتوفرة مع حجم المطلوب من المخازن المؤقتة.
    ملاحظة: وترد جميع المخازن المؤقتة اللازمة لهذا البروتوكول تنقية (AL، AW1، AW2، وAE) ضمن مجموعة QIAamp DNA البراز البسيطة. يحتاج المستخدم لتوريد الإيثانول بنسبة 100٪ أن هناك حاجة لبو AWffers وكحل المستخدمة في عملية التنقية.
  3. إضافة الكمية المطلوبة من بروتين K الحل الموردة إلى العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge ووضعه في فتحة وعلى محطة العمل. أيضا، إضافة العدد المطلوب (مساو لعدد العينات التي يجري تنقيتها) من 2 مل آمنة للانغلاق أنابيب العينات ميكروسنتريفوج RB إلى قسم شاكر من محطة العمل.
    1. تأكد من أن أغطية الأنابيب عينة يتم وضعها بإحكام في فتحات مناسبة على محطة العمل، لأن عدم القيام بذلك سيؤدي إلى خطأ عندما يكون الجهاز بمسح البداية محطة العمل للتأكد كلها البلاستيك والسوائل اللازمة المتاحة للطلب تشغيل.
  4. استخدام الشاشة التي تعمل باللمس على محطة العمل، حدد البراز DNA - البراز البشري - بروتوكول كشف مسببات الأمراض، وقراءة من خلال شاشات اللاحقة للتأكد من أن محطة العمل تم تحميلها بشكل صحيح. مرة واحدة يتم تمرير جميع الشاشات الاختيار، حدد ابدأ لتشغيل هذا البروتوكول.
    1. إذا استخراج الحمض النووي من أكثر من 12 عينة، تبدأ عملية التجانس (الخطوة 1) للمجموعة التالية من العينات، منذ سلسلة من 12 عينة يأخذ ~ 72 دقيقة لإكمال على محطة العمل.
  5. إزالة عينات من محولات الدوار، وكأب لهم، ومكان في -20 ° C لحين الحاجة إليها لتحليل المصب اللاحقة.
    1. في هذه المرحلة، والجمع بين التنقيات تكرار 3 لعينة الفردية (المجموع تحليل كمية = 1 غرام) باستخدام / نظام قائم على التبخر الطرد المركزي. الجمع بين مكررات وإعادة أزل إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر من العازلة تريس، ETDA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لهذه الدراسة، تم انتشال فضلات البراز الطازجة وعينات القمامة من منزل التجاري اللاحم (~ 25،000 الطيور) في جنوب شرق الولايات المتحدة. وكانت الفراريج (جالوس جالوس) كوب-500 الصلبان، وكانوا 59 يوما من العمر في وقت أخذ العينات. تم انتشال عينات برازية والقمامة جديدة من أربع مناطق داخل المنزل (قرب تبريد وسادة، بالقرب من خطوط الساقي / المغذية، في ما بين السطور الساقي / المغذية، وبالقرب مراوح العادم)، وعينات من كل من هذه المجالات يتضمن خمسة المجمعة عينات من داخل تلك المنطقة. تم استخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة استخراج الحمض النووي المستخدمة تنفذ إجمالي تقديرات المجتمع البكتيرية الكمية والنوعية لكل من عينات برازية والقمامة، ودعم تحاليل العينة طبيعة تعتمد أساليب الاستخراج DNA كما كان في السابق 1،3،6. لكل من عينات برازية والقمامة، وكان ترتيب أداء أساليب الاستخراج DNA مختلف لالكمي (الميكانيكية> الهجين> الأنزيمية) والنوعي (الأنزيمية> الهجين> الميكانيكية) إجمالي تقديرات المجتمع البكتيرية. في حين أن طريقة الهجين لم تسفر عن أعلى التقديرات الكمية أو النوعية، أنتج في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم لاتويا ويجينز وكاتلين جريفين لمساعدتهم في الحصول على العينات ، وكذلك لورا لي رذرفورد لمساعدتهم في أخذ العينات والتحليلات الجزيئية. نود أيضا أن نشكر سارة أوينز من مختبر أرجون الوطني على إعداد العينات الميكروبيومية وتسلسلها. تم دعم هذه التحقيقات بالتساوي من قبل خدمة البحوث الزراعية ، مشاريع وزارة الزراعة الأمريكية CRIS "الحد من مسببات الأمراض ومعالجتها في أنظمة معالجة الدواجن" # 6612-41420-017-00 و "الأساليب الجزيئية لتوصيف مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء في الدواجن" # 6612-32000-059-00.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Lysing Matrix E أنبوبMPBio6914-050أحجام مختلفة متاحة وآخر 3 أرقام من القط. لا. حدد الحجم (-050 = 50 أنبوبا ، -200 = 200 أنبوب ، -1000 = 1,000 أنبوب)
محلول فوسفات الصوديومMPBio6570-205يمكن شراؤه بشكل فردي ، أو موجودة أيضا في مجموعة FastDNA Spin Kit للبراز (Cat. رقم 116570200)
PLS BufferMPBio6570-201
Buffer ASL (560 مل)Qiagen19082
FastPrep 24 homogenizerMPBio11600450048 × 2 مل محول HiPrep (Cat. رقم 116002527) متاح لمضاعفة الإنتاجية لخطوة التجانس الميكانيكي
QIAamp DNA Stool Mini KitQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292تظهر النتائج الأولية أن QIAcube HT (Cat. رقم 9001793) يمكن استخدامها لتحسين الإنتاجية ، ولكن هناك حاجة إلى مواد استهلاكية مختلفة من هذه الآلة ويجب القيام بمزيد من العمل المقارن.
نصائح الفلتر، 1,000 مل (1024)990352Qiagen
، 200 مل (1024)Qiagen990332
QIAcube (10 × 24)Qiagen990394بالنسبة لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل المضمنة في مجموعة محول الدوار ، هناك بديل. إنه أنبوب صغير Sarstedt 1.5 مل غطاء أمان ، Cat. رقم 72.690
أنابيب العينة RB (2 مل)Qiagen990381البديل: أنبوب اختبار Eppendorf Safe-Lok الصغير ، Cat. رقم 022363352
أطراف الفلتر محولات الدوار

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
  2. Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
  3. McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
  4. Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23(2010).
  5. Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
  6. Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
  7. Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
  8. Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
  9. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
  10. Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
  11. Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865(2012).
  12. Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945(2008).
  13. Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
  14. Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190(2013).
  15. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
  16. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
  17. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
  18. Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
  19. Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063(2009).
  20. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
  21. Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
  22. Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
  23. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
  24. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
  25. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
  26. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
  27. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
  28. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  29. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
  30. Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490(2010).
  31. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
  32. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
  33. Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Hybrid DNA ExtractionMechanical HomogenizationEnzymatic ExtractionBead BeatingRobotic WorkstationPCR Inhibitor Removal16S rRNA qPCRMicrobiome AnalysisPoultry Fecal SamplesEnvironmental Sample Processing

مقالات ذات صلة