يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس الاستجابة التغذية الناجم عن الجلوتاثيون في حيدرة

10.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52178

⸱

نوفمبر 16, 2014

 , 
1Centre of Excellence in Epigenetics, India Institute of Science Education and Research, Pune

في هذه المقالة

ملخص

هنا نصف فحصا بسيطا لقياس استجابة التغذية في الهيدرا الناجم عن الشكل المنخفض للجلوتاثيون. يعتمد هذا الاختبار على قياس المسافة بين الطرف القمي للمخالب وفم الهيدرا.

الملخص

Hydra هي من بين الكائنات الحية الأكثر بدائية التي تمتلك جهازا عصبيا وإحساسا كيميائيا للكشف عن انخفاض الجلوتاثيون (GSH) للقبض على الفريسة. تتسبب حركة الكائنات الحية المفترسة في إفرازات حسية ميكانيكية للخلايا اللاذعة التي تسمى الكيسات الخيطية من الهيدرا ، والتي يتم إدخالها في الفريسة. يتم تشغيل استجابة التغذية في هيدرا ، والتي تشمل تجعيد المجسات لجلب الفريسة نحو الفم ، وفتح الفم وما يترتب على ذلك من ابتلاع الفريسة ، عن طريق GSH الموجود في السائل المنبعث من الفريسة المصابة. لتكون قادرا على تحديد الآلية الجزيئية لاستجابة التغذية في هيدرا غير المعروفة حتى الآن ، من الضروري إنشاء اختبار لقياس استجابة التغذية. هنا ، نصف طريقة بسيطة لقياس كمية استجابة التغذية حيث يتم قياس المسافة بين الطرف القمي للمخالب وفم الهيدرا ويتم تحديد نسبة هذه المسافة قبل وبعد إضافة GSH. تم العثور على النسبة ، التي تسمى انتشار المجسات النسبي ، لإعطاء مقياس لاستجابة التغذية. تم التحقق من صحة هذا الاختبار باستخدام نموذج الجوع الذي تظهر فيه الهيدرا الجائعة استجابة تغذية محسنة مقارنة بالتغذية اليومية للهيدرا.

المقدمة

Hydra هو الكائن الحي الأكثر بدائية الذي يمتلك جهازا عصبيا وإحساسا كيميائيا للكشف عن انخفاض الجلوتاثيون (GSH) لالتقاط الفريسة1. يتغذى على مجموعة متنوعة من مثل الديدان الخيطية والقشريات ويرقات الحشرات والضفادع الصغيرة والأسماك حديثةالفقس 1. تتسبب حركة هذه الكائنات الحية المفترسة في إفرازات حسية ميكانيكية للكبسولات اللاذعة التي تسمى الكيسات الخيطية من الهيدرا ، والتي يتم إدخالها في الفريسة2. يعمل GSH الموجود في السائل المنطلق من الفريسة المصابة لاحقا على تنشيط استجابة التغذية في الهيدرا والتي تشمل تجعيد المجسات لجلب الفريسة نحو الفم ، وفتح الفم ، وما يترتب على ذلك من ابتلاع الفريسة. ثبت أن الجزيئات المتعددة ، مثل الدوبامين3 ، والغلوتامات4 ، و GABA ،والجلايسين 5 ، ومستقبلات NMDA6 ، و allatotropin7 ، متورطة في استجابة التغذية في الهيدرا. لقد ثبت أيضا أن الاستجابة الحسية الكيميائية التي يسببها GSH يتم تعديلها من خلال حالة تغذية بحيث أظهرت الهيدرا الجائعة استجابة تغذية محسنة1. هذه الزيادة في حساسية GSH ذات صلة بيولوجيا لأنه تحت الجوع تحتاج هيدرا إلى العثور على فريسته بحساسية أعلى.

على الرغم من أنه يمكن ملاحظة استجابة التغذية الناتجة عن GSH بوضوح تحت المجهر ، إلا أن الطرق المستخدمة عادة لقياس ملاحظات استجابة التغذية غير كمية. في معظم الحالات, تم أخذ الوقت الذي يظل فيه فم الهيدرا مفتوحا كمقياس لاستجابة التغذية8,9; بينما في حالة أخرى ، استند القياس الكمي إلى عدد الهيدرا من بين السكان الذين أظهروا استجابة التغذية10. ومع ذلك ، فإن مراقبة وقت فتح الفم لسلائل هيدرا أمر مرهق وعرضة للتباين الناجم عن معلمات لا يمكن السيطرة عليها مثل اتجاه اتجاه الفم أثناء الملاحظات. وبالمثل ، نظرا لأن استجابة التغذية هي معلمة كمية ، فإن الأساليب القائمة على السكان تخضع للاختلافات / الأخطاء الناجمة عن الرأي أو التحيز الرصدي للمراقب الفردي. للتحايل على هذه المشكلات ، قمنا بتطوير طريقة للقياس الكمي النسبي لاستجابة التغذية في هيدرا (Hydra vulgaris Ind-Pune 11) بناء على مسافة الطرف القمي للمخالب من فم سليلة هيدرا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. هيدرا الثقافة وقياس الاستجابة التغذية

  1. الحفاظ على الاورام الحميدة هيدرا في الثقافة عن طريق تغذية لهم يوميا مع الأرتيميا وابقائها في المتوسط ​​(1 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك العازلة، ودرجة الحموضة 7.6، 1 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم CaCl 2، 0.1 ملم بوكل، و 0.1 ملي MgSO 4) الواردة في زجاج وعاء عند 18 درجة مئوية تحت 12 ساعة ضوء لمدة 12 ساعة دورات مظلمة كما هو موضح سابقا (12).
  2. لقياس استجابة للتغذية، ونقل احد تنضج سليلة هيدرا وجود بين 5 و 6 مخالب لبئر واحد من 24 لوحة جيدا. إزالة المتوسطة المتبقية من البئر عن طريق إمالة، ثم تضاف على الفور 500 ميكرولتر من متوسطة جديدة.
  3. تحضير 9 ميكرومتر حل الجلوتاثيون في المتوسط ​​حيدرة. منذ حل الجلوتاثيون هو عرضة للأكسدة، استخدم دائما حل الجلوتاثيون الطازجة لكل تجربة.
  4. نقل لوحة لمنصة التصوير من المجهر وجود أحكام لتسجيل الصورة. استخدام خلفية داكنة تلك التي س السلوكو سليلة هيدرا يمكن تصويرها بشكل واضح على خلفية المتناقضة.
  5. غرفة تستخدم للمراقبة والتصوير سلوك هيدرا خالية من الأضواء من تذبذب شدة، وتيارات الهواء والضوضاء. يمكن لهذه الاضطرابات أيضا أن يسبب ورم هيدرا لتظهر انكماش مخالب - حتى في حالة عدم وجود الجلوتاثيون.
  6. السماح للورم للاسترخاء لمدة 5 دقائق.
  7. تأكد من أن ورم يقع على طول المنطقة الوسطى من مثل جيدا أن السلوك يمكن تصويرها بشكل واضح. إذا كانت سليلة هو على حافة البئر، وإحضاره إلى المركز من قبل بيغ المتوسطة باستخدام ماصة والسماح لها مرة أخرى للاسترخاء.
  8. التقاط صورة من هيدرا في حالة استرخاء. وستكون هذه الملاحظة نقطة الصفر مرة.
  9. بسرعة إضافة 9 ميكرومتر حل الجلوتاثيون للوصول إلى تركيز النهائي من 3 ميكرومتر في البئر. اعتمادا على الغرض من التجربة والرد الذي أبداه هيدرا، واختبار مجموعة من تركيزات مختلفة من الجلوتاثيون وتشوحد ذاته تركيز مناسب المطلوبة.
  10. بدء الموقت فورا بعد إضافة حل الجلوتاثيون والتقاط الصور بعد كل 15-30 ثانية لمدة 4-5 دقيقة. لا تغيير إعدادات التكبير خلال الوقت الفاصل بين التصوير.
  11. إضافة محلول الجلوتاثيون بلطف ومع تدفق موحد من هذا القبيل أن موقف الحيوان في البئر سوف تضطرب طفيفة في مجال الرؤية من المجهر. ومع ذلك، إذا يتحرك سليلة على نطاق واسع بعد إضافة حل الجلوتاثيون، حرك لوحة بلطف جدا لجلب ورم في مجال الرؤية لالتقاط الصور.
  12. في تجربة السيطرة، واستخدام تفتقر المتوسطة الجلوتاثيون مع الحفاظ على جميع المعلمات أخرى مماثلة.
  13. تأكد من تنفيذ كافة الخطوات التجريبية السابقة خلال النصف الأول من اليوم - قبل 13:00 لتجنب التأثير المحتمل لإيقاع الساعة البيولوجية على مدى استجابة التغذية.
  14. فتح كل واحدة من الصور التي تم التقاطها باستخدام برنامج التلاعب جنو صورة (الأعرج). استخدام "القياس" وسيلة متاحة من القائمة> الأدوات> قياس لتحديد المسافة بين نهاية قمية كل من مخالب والكارح. إذا لاحظت فتحة الفم في أي من الصور، وتحديد المسافة بين وسط الفم وافتتح نهاية قمية من اللامسة. الرجوع إلى هذه المسافة مع انتشار اللامسة.
  15. حساب معدل انتشار اللامسة لكل ورم قبل وبعد التعرض الجلوتاثيون. حساب متوسط ​​نسبة انتشار اللامسة عند نقطة الصفر مرة لأنه في كل لاحقة نقاط الوقت. وسوف يطلق هذا نسبة انتشار اللامسة النسبي.
  16. تكرار القياسات لا يقل عن 20 البوليبات.

figure-protocol-1
figure-protocol-2

2. طريقة التحقق من صحة استخدامالمجاعة نموذج

  1. لالمجاعة، ونقل بعض الاورام الحميدة هيدرا إلى وعاء زجاجي منفصل ولا إطعامهم لمدة 5 أيام. إطعام مجموعة مراقبة من بضعة الاورام الحميدة يوميا مع الأرتيميا في وعاء مماثل الحجم. تغيير المتوسطة من كلا التجريبية الأوعية يوميا لتجنب نمو الفطريات في المتوسط.
  2. في يوم من التجربة، وإطعام مجموعة مراقبة من هيدرا مع الأرتيميا لمدة 1 ساعة واستخدام هذه هيدرا لتجارب لاحقة بعد إزالة جميع الأرتيميا غير مأكول وميت من المتوسط.
  3. قياس استجابة للتغذية هيدرا تجويع بالمقارنة مع هيدرا من المجموعة الضابطة التي كتبها الطريقة الموضحة في الخطوة 1. في وقت سابق لتفادي أي تحيز بسبب وقت الرصد، بالتناوب قياسات كل من تجويع الاورام الحميدة والسيطرة هيدرا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يسبب الجلوتاثيون هيدرا لتظهر الشباك من مخالب نحو الفم لغرض تجتاح فريسة. مثل هذا الشباك من مخالب يجلب نهايات قمية من مخالب أقرب إلى الكارح. هذا يؤدي إلى انخفاض في انتشار اللامسة، أو المسافة الخطية بين نهاية قمية من اللامسة والكارح (الشكل 1). انتشار اللامسة النسبي، أو نسبة متوسط ​​اللامسة انتشر قبل وبعد إضافة الجلوتاثيون، بلغ متوسط ​​عبر الاورام الحميدة متعددة يقلل بمرور الوقت. انتشار اللامسة النسبي بعد إضافة وسيلة تفتقر الجلوتاثيون، ومع ذلك، يقلل بشكل عابر فقط ويبل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

سلوك التغذية في حيدرة يمثل واحدا من أكثر أنظمة حسي كيميائي الأجداد في metazoans. على الرغم من أن تم الكشف عن وجود الجلوتاثيون في السائل القشريات صدر بعد بمساعدة كيسة خيطية التقاط الفريسة منذ فترة طويلة 1، وقد تميزت أيا من البروتين GSHR ولا المفترض الجين الترميز / ث من هيدرا حتى الآن. وقد بذلت محاولات قليلة لوصف GSH البروتينات ملزمة في هيدرا 8 و 14 و 15. ومع ذلك، فإن هوية هذه البروتينات المستقبلة المفترضة تبقى المكونات الجزيئية الأخرى غامضة وقليلة جدا، والتي م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يعرب المؤلفون عن امتنانهم ل K.P. Madhu و Nita Beliappa وموظفي المركز الإعلامي للمعهد الهندي لتعليم العلوم والبحث ، بيون لمساعدتهم في إنتاج الفيديو. تم دعم العمل بتمويل في إطار برنامج مركز التميز التابع لقسم التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند إلى SG وزمالة ما بعد الدكتوراه من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا ، حكومة الهند إلى RK.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حاضنة مبردةباناسونيك MIR-254-PE
مجهرلايكاS8AP0   ؛
كاميرا للمجهرLeica EC3
الجلوتاثيون المخفضSigmaG4251المخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية أحضر الزجاجة إلى درجة حرارة الغرفة قبل الفتح لتجنب الأكسدة
برنامج تحرير الصورGIMPالإصدار 2.8

المراجع

  1. Loomis, W. F. Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra. Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).
  2. Beckmann, A., Ozbek, S. The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle. Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).
  3. Venturini, G., Carolei, A. Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations. Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).
  4. Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris. Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).
  5. Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa). Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).
  6. Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study. Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).
  7. Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding. PLoS ONE. 8, (2013).
  8. Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins. FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).
  9. Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. Glutathione in the Nervous System. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).
  10. Venturini, G. The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies. Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).
  11. Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. Description and phylogenetic characterization of common hydra from India. Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).
  12. Horibata, Y., et al. Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase. J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).
  13. Koizumi, O., Maeda, N. Rise of feeding threshold in satiated Hydra. J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).
  14. Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra. Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).
  15. Morita, H., Hanai, K. Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra. Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).
  16. Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system. Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).
  17. Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra. J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).
  18. Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione. J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).
  19. Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands. Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).
  20. Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. Computer automated movement detection for the analysis of behavior. J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

قياس الاستجابة التغذية الناجم عن الجلوتاثيون في حيدرة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.