تقنية جديدة لتحليل الكمي لتساقط الشعر في الفئران عن طريق تحليل درجات الرمادي

ملخص

الثعلبة هي شكل شائع من تساقط الشعر يمكن أن يحدث في العديد من الحالات المختلفة ، بما في ذلك كأثر جانبي للعلاج الكيميائي. لقد طورنا طريقة لقياس تساقط الشعر في الفئران ، باستخدام جهاز تصوير هلام قياسي لإجراء تحليل تدرج الرمادي ، لتسهيل دراسة علاجات الثعلبة الجديدة الواعدة.

الملخص

الثعلبة هو شكل شيوعا لفقدان الشعر التي يمكن أن تحدث في العديد من الظروف المختلفة، بما في ذلك فقدان الذكور نمط الشعر، ومتلازمة المبيض المتعدد الكيسات، وداء الثعلبة. يمكن أن تحدث حاصة أيضا كأثر جانبي للعلاج الكيماوي لدى مرضى السرطان. في هذه الدراسة، كان هدفنا لتطوير طريقة متسقة وموثوق بها لقياس تساقط الشعر لدى الفئران، والتي سوف تسمح للمحققين تقييم دقيق والمقارنة بين مناهج علاجية جديدة لهذه الأشكال المختلفة من تساقط الشعر. يستخدم طريقة هلام تصوير القياسية للحصول على والصور من الفئران العملية، وقياس امتصاص الضوء، والذي يحدث في نسبة تقريبية لكمية من الشعر الأسود (أو الرمادي) على الماوس. ومن ثم يمكن تحليل البيانات التي تم قياسها في هذا الشكل باستخدام الأساليب الإحصائية القياسية (أي ANOVA، T-اختبار). تم اختبار هذه المنهجية في نماذج الماوس التي يسببها العلاج الكيميائي الثعلبة، داء الثعلبة وتساقط الشعر من الصبح. في هذا التقرير، وبروتوكول مفصل هو بريهented لأداء هذه القياسات، بما في ذلك التحقق من صحة البيانات من C57BL / 6 و C3H / سلالات HEJ من الفئران. تقدم هذه التقنية الجديدة على عدد من المزايا، بما في ذلك البساطة النسبية للتطبيق، والاعتماد على المعدات التي تتوفر بسهولة في معظم مختبرات الأبحاث، وتطبيق موضوعي والتقييم الكمي التي هي أكثر قوة من التقييمات الذاتية. سوف التحسينات في تقدير حجم نمو الشعر في الفئران تحسين دراسة نماذج الثعلبة وتسهيل تقييم علاجات جديدة واعدة في الدراسات قبل السريرية.

المقدمة

ثعلبة (تساقط الشعر) يمكن أن يكون حدثا نفسيا وعاطفيا من الأسى ذات أسباب متعددة. الذكور نمط الصلع هو السبب الأكثر شيوعا لتساقط الشعر، مما يؤثر على ما يقرب من ثلثي الذكور قبل سن 35 ^1. ويمكن ملاحظة نمط مماثل من فقدان الشعر في الإناث يعانون من متلازمة المبيض المتعدد الكيسات. في كل من هذه الاضطرابات، والاندروجين توسط فقدان الشعر. يمكن أن تحدث حاصة أيضا أحد أمراض المناعة الذاتية، داء الثعلبة الذي يصيب 1.7٪ من السكان ^2. يمكن أن تحدث حاصة باعتباره من الآثار الجانبية لبعض العلاجات الطبية، مثل العلاج الكيميائي ^3. وهناك نسبة عالية (65-85٪) من المرضى العلاج الكيميائي تجربة بعض درجة من داء الثعلبة ^4،5. الآثار النفسية لفقدان الشعر وقد درست جيدا في وضع العلاج الكيميائي. الناجم عن العلاج الكيميائي حاصة يمكن أن يؤدي إلى القلق والاكتئاب وصورة الجسم السلبية، وانخفاض تقدير الذات والشعور المنخفض من الرفاه ^6،7. والمؤسسة العامة عاليةrcentage (47-58٪) من مرضى السرطان الإناث النظر في فقدان الشعر ليكون الجانب الأكثر صدمة من العلاج الكيميائي، وتصل إلى 8٪ انخفاض العلاج خوفا من فقدان الشعر ^4،6. وهناك أيضا أدلة في الصلع الوراثى لدعم العلاج للحد من الآثار النفسية وحتى الطبية لتساقط الشعر ^8،9. وبالمثل، تم الإبلاغ عن داء الثعلبة ليكون لها عواقب نفسية حادة ^2، وطبيعة غير مكتمل من فقدان الشعر يمكن أن تؤدي إلى نتيجة غير سارة التجميل أكثر من معظم الأسباب الأخرى لفقدان الشعر.

بينما المخدرات مع تأثيرات مضادة للالذكورة معتدلة (أي السبيرونولاكتون) استخدمت بنجاح محدود كعلاج لتساقط الشعر، وكان أول دواء فعال لتساقط الشعر مينوكسيديل ^10. هذا يقلل ضغط الدم المرتفع لديه الملحوظ الآثار الجانبية لتسبب نمو الشعر، ويستخدم الآن كعلاج موضعي لأشكال عديدة من ثعلبة. ومع ذلك، غالبا ما تكون الردود غير مكتملة، مع بعض المواضيع تظهر بطيئة فقطجي تساقط الشعر بدلا من إعادة النمو الفعلي ^10. فيناستريد هو خصم تنافسية لكتابة II 5α اختزال الكتل التي تحول التستوستيرون إلى ديهدروتستوسترون، مما أدى إلى تحسينات في الصلع الوراثى على حساب الجزئي النظامية الحصار الاندروجين. معدلات الاستجابة مع المدى الطويل (10 عاما) العلاج هي حوالي 50٪ ^11. وعموما، على الرغم قدرا كبيرا من البحث في هذا المجال، لا يوجد حتى الآن علاج مناسب لتساقط الشعر.

على مدى عقود، وقد درست العلماء والأطباء طرق قياس نمو الشعر فروة الرأس في التجارب السريرية. مع تطور العقاقير التي تعالج تساقط الشعر، كانت هناك حاجة أكبر لوسائل موثوقة واقتصادية والغازية الحد الأدنى لقياس نمو الشعر، وعلى وجه التحديد، والاستجابة للعلاج. صورة تكنولوجيا التحليل الكمي لالدقيق لكثافة الشعر في المرضى الذين يعانون من اضطرابات فقدان الشعر أسفرت نتائج متسقة وصحيحة في الماضي باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيهوفاق، بما في ذلك تحليل الصور الرقمية ^12، تحليل الصور من فرد الشعر والآفات ¹³ الجلد، والمسح المجهري لتحديد كتلة الشعر في منطقة فروة الرأس محددة ^14.

لسوء الحظ، في حين وفرت منهجيات أعلاه تحسين تقييم فعالية للشعر نمو تعزيز التدخلات في التجارب السريرية، لم يتم تطبيق هذه الأساليب لدراسات القوارض في التحقيقات قبل السريرية. هدفنا هو تطوير طريقة متسقة وموثوق بها لقياس تساقط الشعر لدى الفئران، والتي سوف تسمح للمحققين تقييم أكثر دقة والمقارنة بين مناهج علاجية جديدة لأشكال مختلفة من الصلع. لقد قمنا بتطوير منهجية باستخدام المعدات المتاحة بسهولة في معظم المختبرات التي تسمح الكمي السريع وموثوق بها من كثافة الشعر في الفئران مع الشعر البني أو الأسود. وقد تم اختبار هذه المنهجية في نماذج الماوس التي يسببها العلاج الكيميائي الثعلبة، داء الثعلبة، وحاصة من waxinز. ويرد بروتوكول مفصلة لأداء هذه القياسات، بما في ذلك التحقق من صحة البيانات من C57BL / 6 و C3H / سلالات HEJ من الفئران. كما تعتمد هذه التقنية على كشف امتصاص الضوء من أصباغ في جذع الشعرة، فإنه لا يمكن أن تستخدم للكشف عن نمو الشعر في الفئران البيضاء أو الفئران البيضاء.

البروتوكول

بيان الأخلاق: يجب الموافقة على جميع الدراسات التي تنطوي على الحيوانات من قبل IACUC للمؤسسة (للبيانات الذي يتبع، تمت الموافقة على البروتوكولات التي مونتيفيوري IACUC، بروتوكول # 11-6-240 و# 13-7-100). وتقدم الحيوانات التخدير الخفيفة كما هو مبين لغرض وحيد من ابقائها تزال أثناء التصوير، لا توجد إجراءات مؤلمة المطلوبة لهذا البروتوكول.

1. اقتناء صور

1. تعيين التركيز ومجال الرؤية للتصوير باستخدام هلام الورقة مع النص المطبوع. تحقق التوحيد من مصدر الضوء عبر المنطقة تصويرها. للمساعدة على ضمان التوحيد، استخدام جهاز تصوير هلام مع بني في مصدر الضوء للتصوير الفوتوغرافي عاكس. لا تستخدم مصدر الضوء تضوء، لأن هذا من شأنه أن يخلق صورة ظلية للحيوان وهي غير مناسبة لمزيد من التحليل الرمادي.
   ملاحظة: هذا وضع الماوس قليلا من التركيز، والتي تنص على المتوسط ​​البصرية في جميع أنحاء المنطقة ذات الاهتمام (ROI) وسوفتساعد على تقليل الأخطاء كمي للصغيرة جدا (أي، <10 بكسل) المناطق ذات الاهتمام. لن تتأثر مناطق أكبر من الاهتمام من قبل هذه قاصر التركيز التعديل، كما أنها لا تتأثر الاختلافات في حجم الحيوان.
2. تخدير الحيوانات باستخدام الكيتامين (100 ملغ / مل) / زيلازين (20 ملغ / مل) (2: 1)، وهذا يوفر تأثير التخدير والانتعاش السريع وغير الأمثل لتصوير الحيوانات متعددة.
   تأكيد التخدير عند الحيوان لا يزال كافيا للسماح التصوير الفوتوغرافي: ملاحظة. كما يتعافى الحيوانات عادة من هذا التخدير الخفيفة في غضون 10-15 دقيقة، والطبيب البيطري لا ينصح استخدام المراهم العين.
3. وضع الحيوانات تخدير على هلام تصوير في المحاذاة العمودية (أقرب إلى موازية ممكن).
   1. للصور الفوتوغرافية الظهرية، ووضع الحيوانات في موقف المعرضة مع أطرافه الموسعة.
   2. للصور الفوتوغرافية البطنية، والحيوانات وضع في موقف ضعيف، مع الحرص على أن الحيوانات لا استدارة أفقيا.
4. وضع معيار الرمادي في المنطقة تصويرها.
5. وثيق وصول الباب. المهم: يمكن إدخال الضوء المحيط الاختلافات في التعرض.
6. تعيين F وقفة وإلى التعرض الذي يضع المنطقة ذات الاهتمام ضمن مجموعة خطية من الاستحواذ (القراءة F-توقف).
   ملاحظة: معظم أنظمة العرض حيث مشبعة الصورة.
7. تأخذ صورة.
8. تغيير F-وقف إلى مكان التعرض آخر الذي يضع المنطقة ذات الاهتمام ضمن مجموعة خطية عن طريق زيادة أو خفض F وقفة من قبل 1، مثل أن كلا من مستوى والمنطقة من الفائدة ستبقى في مجموعة خطية من الاستحواذ (المرجع F- توقف).
9. تأخذ صورة.
10. بمجرد الانتهاء من التصوير، والحيوانات وضع على طاولة الاحترار ورصد حتى يتمكنوا من الحفاظ على الاستلقاء القصية. العودة الحيوانات إلى أقفاصها. إعادة مجموعة من الحيوانات إلى الحظيرة مرة واحدة يتم استردادها بالكامل جميع الحيوانات.

2. الكمي لامتصاص الضوء

1. المناطق كافة من الفائدة على صور الحيوانات باستخدام قدم البرنامج للحصول على هلام تصوير.
   1. لعرض ظهري كله الحيوانية، واستخدام صورة مستطيلة أو بيضاوية تمتد من الأطراف العلوية إلى الأطراف السفلية، وتمتد أفقيا قدر الإمكان بحيث أي جزء من مربع يمتد إلى أبعد من ظهر الحيوان كما هو مبين في الشكل 1A.
      ملاحظة: يمكن للمرء أيضا تحديد المنطقة ذات الاهتمام باستخدام أداة رسم اليد الحرة.
   2. لكله الحيوان رأي بطني، استخدم 2 المستطيلات: واحد يغطي منطقة الحوض واحدة تغطي منطقة الصدر كما هو موضح في الشكل 1B.
   3. لمنطقة صغيرة من الفائدة، أي موقع إدارة المخدرات، وعلامة حسب الاقتضاء.
2. المنطقة علامة (ق) من الفائدة على الرمادي مستوى الاستيعاب.
3. امتصاص سجل من كل منطقة من المناطق ملحوظ في المصالح.

3. تحليل

مستويات امتصاص obtaineد لمناطق الفائدة قد تحتاج إلى تطبيع لمعيار خلفية للمقارنة بين الصور. العلاقة بين التعرض لامتصاص هي سجل سجل (أي العلاقة خطية بين السجل (التعرض) وسجل (الاستيعاب)). باستخدام هذه العلاقة، واستيعاب المنطقة من الفائدة يمكن أن يكون تطبيع إلى قيمة الخلفية القياسية، والتي سوف تسمح الجواذب إلى أن مقارنة مباشرة بين الصور المختلفة، بما في ذلك تلك التي اتخذت في نقاط زمنية مختلفة (أي قياسات التسلسلي داخل بروتوكول الدراسة). وترد تفاصيل إجراءات تنفيذ هذه التصحيحات في الخطوات الاختيارية 3.1 و 3.2.

1. (اختياري) منحنى قطعة السجل (التعرض) مقابل سجل (امتصاص) باستخدام القيم التي تم الحصول عليها من الرمادي مستوى الاستيعاب.
2. (اختياري) ضبط للاختلافات في مستوى كل صورة على النحو التالي:
   1. اختر F-توقف عن القراءة (كما هو محدد في الخطوة 1.6) وF-توقف كمرجع (كما هو محدد في الصورةتيب 1.8).
   2. حساب متوسط ​​امتصاص المعيار في جميع الصور في القراءة F-توقف. هذا المتوسط ​​هو المعيار المرجعي القيمة (RSV).
   3. حساب الفرق في امتصاص بين القراءة وإعدادات F وقفة والمرجع في كل صورة لمعيار (دلتا-S) ولكل ROI محددة (دلتا-ROI-1، دلتا ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
   4. حساب امتصاص تصحيح لكل ROI على النحو التالي: امتصاص تصحيح (ROI-X) = الامتصاص (ROI-X) في قراءة F وقفة + (RSV - امتصاص القياسية في قراءة F-المحطة) * (دلتا-ROI-X / دلتا-S)
3. تجميع البيانات التجريبية وإجراء تحليل البيانات باستخدام الأساليب الإحصائية القياسية للمتغيرات المستمرة (أي ANOVA، T-اختبار).

النتائج

تم التحقق من صحة هذه التقنية باستخدام C3H / الفئران HEJ المغروسة نموذج الفأر من داء الثعلبة ^(16). هذه الحيوانات تطوير فقدان الشعر العالمية التي تقدم تدريجيا مع مرور الوقت. ومع ذلك، فإن تساقط الشعر يحدث في بقع، ويمكن أن تختلف من الماوس واحدة إلى أخرى، وإدخال تفاوتا كبيرا ويعرقل التقييمات النوعية. وقدم هذا النموذج فرصة لاختبار الارتباط بين قياسات الكثافة البصرية في مواقع مختلفة على الماوس إلى تقييم الصلاحية.

المناقشة

في هذا التقرير وتقدم وصفا مفصلا لتقنية جديدة لقياس فقدان الشعر في القوارض. هذه التقنية تستخدم لتصوير هلام لاقتناء الصور وتحليلها، والمعدات التي تتوفر بسهولة في معظم المختبرات. وقد أظهرت القياسات أن تكون قوية لاختلافات طفيفة في تقنية (الأرقام 4-5)، وترتبط بشكل جيد لدرجة فقدان الشعر البصرية في نماذج العلاج (الشكل 6). وقد استخدمت هذه التقنيات بنجاح في تقييم العلاجات التجريبية للحاصة ^17.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
نظام التصوير KODAK Gel Logic 100 شركة	Eastman Kodak Company ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية		تصوير جل للحصول على الصور الفوتوغرافية وتحليلها ، قد تم بناؤه في مصدر ضوء للتصوير العاكس.
مقياس رمادي Kodak / Tiffen Q-13