Method Article

افتعال ركائز الثقافة معقدة باستخدام الروبوتية Microcontact الطباعة (R-μCP) وتبديل أليف النواة متسلسل

DOI:

10.3791/52186

⸱

October 31st, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin, Madison, 2Department of Mechanical Engineering, University of Wisconsin, Madison

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ركائز زراعة الخلايا التي تعمل بأنماط دقيقة من الروابط البيولوجية لها فائدة هائلة في مجال هندسة الأنسجة. هنا ، نوضح التصنيع متعدد الاستخدامات والآلي لركائز زراعة الأنسجة باستخدام فرش متعددة متعددة من البولي (إيثيلين جلايكول) ذات منقوشة دقيقة تقدم كيمياء متعامدة تتيح تثبيت الروابط البيولوجية الدقيقة مكانيا والخاصة بالموقع.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هندسة الأنسجة ، من المستحسن إظهار التحكم المكاني في مورفولوجيا الأنسجة ومصير الخلية في الثقافة على مقياس ميكرون. يمكن استخدام ركائز الاستزراع التي تقدم فرش بولي (إيثيلين جلايكول) المطعمة (PEG) لتحقيق هذه المهمة من خلال إنشاء مناطق دقيقة وغير قاذورات ومقاومة للتصاق الخلايا بالإضافة إلى المناطق التي تشارك فيها الخلايا في تفاعلات حيوية محددة مع روابط مربوطة تساهميا. لهندسة الأنسجة المعقدة باستخدام مثل هذه الركائز ، سيكون من الضروري تصميم فرش PEG متعددة بشكل تتابع لمنح الأنشطة الحيوية التفاضلية ومحاذاة في الاتجاهات الدقيقة التي تحاكي منافذ في الجسم الحي. تعد طباعة التلامس الدقيق (μCP) تقنية متعددة الاستخدامات لتصميم فرش PEG المطعمة ، ولكن لا يمكن إجراء μCP اليدوي بدقة دقيقة. وهكذا ، قمنا بدمج الروبوتات المتقدمة مع تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة وتفاعلات كيمياء السطح الناشئة لتطوير طريقة روبوتية بمساعدة الطباعة الدقيقة (R-μCP) لتصنيع ركائز الاستزراع بأنماط معقدة ودقيقة الحجم ومرتبة للغاية من فرش PEG التي تقدم كيمياء "النقر" المتعامدة. هنا ، نصف بالتفصيل سير العمل لتصنيع مثل هذه الركائز.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدرة السطوح PEG المطعمة لعرضه بروابط كيميائية حيوية مرتبطة تساهميا مع الحفاظ في نفس الوقت المتأصلة خصائص غير قاذورات تجعلها خيارا مثاليا لبيئات الميكروسكيل الهندسة الجمركية على ركائز الثقافة 1،2،3. التفاعلات biospecific بوساطة يجند مترافق فرش PEG تتيح تحليل reductionistic من آثار الاشارات البيوكيميائية وجدت داخل المجمع في microenvironments أنسجة الجسم الحي على الظواهر الخلايا الفردية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم كيمياء الحيوية متعامد "فوق" لتسهيل تجميد الاتجاه من بروابط بحيث يتم تقديمها في التشكل الأصلي 4-6. وبالتالي، الزخرفة المكانية الميكروسكيل من PEG فرش هو أداة مرنة لخلق مصمم في محاريب المختبر للتحقيق إشارات الخلايا الناجم عن الإشارات البيوكيميائية يجمد 6،7.

وهناك طريقة شائعة لتوليد الأنماط المكانية للمكعب الكيمياء الحيويةوفاق ينطوي microcontact الطباعة (μCP) ركائز المغلفة بالذهب مع أنماط PEG alkanethiols مترافق. ثم، والطبقات الوحيدة الذاتي تجميعها micropatterned (سام) من alkanethiols PEG-ylated تقيد امتصاص المادي للجزيئات الحيوية، مثل البروتينات، إلا أن المناطق غير نمط الركيزة 8،9. ومع ذلك، فإن صواريخ سام التي تولدها هذه التقنية حساسة للأكسدة في المدى الطويل وسائل الإعلام ثقافة الخلية. وبالتالي، μCP'd alkanethiol سام غالبا ما المطعمة كذلك مع فرش PEG البوليمر باستخدام بمبادرة سطح نقل ذرة البلمرة الراديكالية (SI-ATRP) إلى زيادة غير قاذورات الاستقرار في المنطقة 10. على وجه التحديد، μCP من البلمرة البادئ alkanethiol، bromoisobutyrate ω-meraptoundecyl، على الأسطح المغلفة الذهب تليها SI-ATRP من بولي (جلايكول الإثيلين) ميتاكريليت الميثيل الأثير (PEGMEMA) أحادية يولد الأسطح مع micropatterned طويلة الأجل ومستقرة، وغير فرش قاذورات PEG. وعلاوة على ذلك، فإن هذه هي قابلة للتعديل أيضا على تقديم الأنصاف الكيميائية المتنوعة 11.

الاستفادة من هذه الخاصية، شا آخرون. الله. وضعت طريقة لهندسة ركائز الثقافة مع فرش PEGMEMA المتعددة المكونات تقديم المتعامدة كيمياء "فوق". في هذه الطريقة، فإنها تستخدم سلسلة من الخطوات μCP / SI-ATRP تتخللها أزيد الصوديوم متتابعة، ايثانول، وpropargylamine بدائل أليفة النواة لخلق ركائز ثقافة تقديم أنماط الميكروسكيل من بروابط متعددة يجمد 6. في حين أن احتمال استخدام تلك كيمياء بالتزامن مع μCP اليدوي لهندسة ركائز ثقافة جديدة هائلة، ويقتصر من قبل على الدقة والدقة التي μCP خطوات متعددة يمكن محاذاة على ركيزة واحدة. سوف تكون هناك حاجة لمستوى عال من الدقة والدقة لتصنيع بتكاثر مجمع في محاريب المختبر باستخدام هذه التقنيات تنوعا.

e_content "> ولمعالجة هذا الحد، فقد تم إنشاء العديد من أنظمة μCP الآلية وشبه الآلية. شقرا وآخرون وضع نظام μCP التي توضع الأختام الجمركية على نظام السكك الحديدية وأدى إلى امتثالي اتصال مع الشرائح المغلفة الذهب باستخدام والمحرك الكمبيوتر التي تسيطر عليها الهوائية. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب تصنيع الدقيق للتصاميم طابع العرف وتقارير 10 ميكرومتر الدقة مع أي تقرير من دقة تحقيقها عند تنفيذ العديد من الخطوات μCP 12. وفي الآونة الأخيرة، وهي طريقة استخدام نظام اقتران الحركية متكامل ذكرت الدقة أقل من 1 ميكرون باستخدام نمط واحد، ولكن لم تتمكن من محاذاة بدقة أنماط متعددة نظرا لعدم وجود مراقبة دقيقة من الميزات ختم من العفن العفن 13. بالإضافة إلى ذلك، كل من الطرق السابقة تتطلب الركيزة لتظل ثابتة بين الخطوات الزخرفة ، مما يحد بشكل كبير من التنوع في كيمياء تعديل السطح التي يمكن أن تكونالمستخدمة. هنا، نحن تصف نظام R-μCP الآلي قادرة على محاذاة دقيقة ودقيقة من الخطوات μCP متعددة مع السماح بالمرونة القصوى في تصميم الطوابع وتلفيق. وعلاوة على ذلك، فإن ركائز نمط يمكن إزالة مرارا وتكرارا من النظام بين تركيب الجمله، وبالتالي السماح باستخدام المتنوعة كيمياء تعديل الركيزة، بما في ذلك بدائل أليفة النواة متتابعة. وقد استخدمت ركائز هندسيا باستخدام هذه كيمياء للثقافة الخلية من قبل كلا منا 6،14 7 وغيرهم. وبالتالي، فإننا اندمجت R-μCP وردود الفعل استبدال شغوف بالنواة متتابعة لتطوير طريقة لصنع قابلة للمن ركائز الثقافة مع الاشارات الكيميائية الحيوية المعقدة وmicropatterned.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توليد المرنة طوابع

  1. لتوليد سادة السيليكون ختم PDMS، وتصميم أنماط الميزة الضوئية باستخدام برمجيات التصميم بمساعدة الكمبيوتر.
    1. تصميم النمط الأول بمثابة 20 × 20 مجموعة من للحلقة مع 300 ميكرون قطرها الداخلي (ID) و 600 ميكرون OD مع 1200 ميكرون مركز إلى مركز تباعد.
    2. تصميم النمط الثاني بوصفه 20 × 20 مجموعة من للحلقة مع 600 معرف ميكرون و 900 ميكرون OD مع 1200 ميكرون مركز إلى مركز تباعد.
    3. بالإضافة إلى ذلك، ضع 1 × 1 مم 2 العلامات المرجعية مربع في جميع الزوايا الأربع من كل تصميم مجموعة متباعدة 1200 ميكرون مركز إلى مركز من نمط الزاوية في زاوية 45 درجة.
    4. افتعال سادة السيليكون لاستخدامها في هذه التجربة مع 1: 1 الجانب نسب، رابطا إلى عمق ميزة 300 ميكرون باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية في أماكن أخرى القياسية بالتفصيل 15 أو بالتعاون مع مسبك ميكروفلويديك.
      ملاحظة: ميزة أعماق أقل من 100 ميكرون يمكن أن يؤدي إلى تشوه غير طبيعي من الطوابع مسبقة في الاتصال مع السطوح الركيزة.
      ملاحظة: هذا البروتوكول يبدأ مع وجود سادة السيليكون حصل بالفعل مع أنماط صفها من مقاومة للضوء، الأمر الذي يتطلب معدات متخصصة وغرف نظيفة لخلق. فمن الأفضل أن يتشاور مع منشأة كاذب أو الأساسية لإنشاء هذه سادة نمط.
  2. سادة السيليكون Silanize O / N قبل الحضانة مع (tridecafluoro-1،1،2،2-tetrahydroocty) trichlorosilane بخار.
    ملاحظة: سيلاني بخار عالية السمية ويجب فقط أن تعالج في غطاء الدخان الكيميائي.
  3. إنشاء نسخ متماثلة العكسية للسادة السيليكون من قبل علاج 10: 1 نسبة من PDMS قبل البوليمر وكيل PDMS علاج على رأس سادة السيليكون silanized في طبق بتري O / N عند 60 درجة مئوية.
  4. إزالة الطوابع PDMS من سادة السيليكون، والسندات والطوابع لالأكريلونيتريل ستايرين (ABS) المساند أو أي مادة صلبة أخرىليالي باستخدام الغراء.
    ملاحظة: المادة المفضلة لا يلزم أن تكون شفافة أو حيويا. ومع ذلك، يجب أن توفر سطح مستو لواجهة مع الأدوات الروبوتية وصلابة أعلى من PDMS.

2. إعداد Coverslides

  1. coverslides المجهر شطف في التولوين، الميثانول ويصوتن في الأسيتون لمدة 1 دقيقة قبل الشطف مع الإيثانول والتجفيف تحت تيار النيتروجين لطيف (24 ملم × 50 ملم 1 #).
    ملاحظة: التعامل مع التولوين، والأسيتون فقط في غطاء الدخان الكيميائي.
  2. coverslides معطف مع ~ 3.5 نانومتر التيتانيوم (تي)، يليه 18.0 نانومتر الذهب (الاتحاد الافريقي) باستخدام تركيز شعاع الإلكترون المبخر.
    ملاحظة: هذا الإجراء هو متوافق مع مجموعة متنوعة من ركائز المغلفة بالذهب بما السيليكون والبوليسترين. في حين أنه من الممكن أن تولد هذه في الموقع، وركائز المغلفة بالذهب متوفرة عن طريق الموردين التجاريين أيضا.
    ملاحظة: يجب أن تكون طبقات تي 3 على الأقل نانومتر سميكة، في حين ينبغي أن تكون طبقات الاتحاد الافريقي على ركائز ور الأقل 5 نانومتر سميكة ويمكن أن تتراوح كل وسيلة ل1MM في سمك اعتمادا على الخصائص البصرية مثالية الركيزة النهائية 16،17. ليس مطلوبا من ركائز لتكون واضحة بصريا للتصنيع. ومع ذلك، فإنه يسهل التحليل المجهري للركائز ملفقة.
  3. شطف coverslides المطلي بالذهب مع الإيثانول والجافة تحت النيتروجين لطيف مباشرة قبل الاستعمال.

3. R-μCP من بالطوق الخارجي

  1. قبل R-μCP مع ذراع الروبوت المفصلية (SCARA) متوافق مع نظام انتقائي، معايرة المستجيبات أداة الروبوتية وأنظمة كاميرا مزدوجة المرفقة باستخدام برنامج النظام.
    ملاحظة: في الصورة هذه الأدوات في الشكل 1.

figure-protocol-1
الشكل 1. R- نظام μCP والأدوات الروبوتية الذراع. (A) عرض على نطاق واسع للنظام R-μCP مع جميع الأدوات والتركيبات، (أ) تشوك فراغ، (ب) حمام كاشف، (ج) لأسفل الكاميرا، (د) ختم التعشيش لاعبا اساسيا، (ه) الروبوتية الأداة. (ب) الأدوات الروبوتية الذراع تصور (و) ذات الرؤوس الماس أداة الحفر و (ز) أداة الشفط الهوائية عقد (ح) المدعومة ABS PDMS الطوابع.

  1. وضع ختم PDMS مع 600 معرف ميكرون و 900 ميكرون OD جاحظ للحلقة تواجه هبوطا في المباراة طابع التعشيش يدويا. وضع يدويا coverslide المغلفة بالذهب تنظيفها حديثا على رأس تشوك فراغ، المعروضة في الشكل 1A، وذلك باستخدام شل الفراغ مختبر المتصلة.
  2. باستخدام عناصر التحكم الروبوت، محاذاة الكاميرا لأسفل على نقطة وسط coverslide المغلفة بالذهب، كما في الشكل 2A.
    ملاحظة: يمكن في البداية أن تحدد هذه النقطة عن طريق التفتيش البصري ولا تتطلب دقة كبيرة، كما هو الطابع PDMS الكثير من تأإيه من الشريحة المغلفة بالذهب.
  3. تعليمات الذراع الروبوتية لحفر أربعة إشارة "X" علامات في القمم من مربع مع أبعاد 3.8 مم 3.8 مم تركزت على coverslide المغلفة الذهب باستخدام أداة الحفر ذات الرؤوس الماس تعلق على الذراع الروبوتية. (مبين في الشكل 2B، عملية مؤتمتة)
    ملاحظة: هذا يضمن كافة العلامات المرجعية الأربعة هي ضمن الاطار البصري واحدة من الكاميرا أسفل.
  4. باستخدام الروبوتات الهوائية شفط الأدوات، والبيك اب وعقد PDMS ختم 1 مم فوق اعبا اساسيا ختم التعشيش كما في الشكل 2C. (العمليات التكنولوجية)
  5. استخدام الكاميرا تواجه التصاعدي وLED حلقة إضاءة الصورة في الشكل 2D و E، تصور العلامات المرجعية مربع ختم والتعرف عليها مع برنامج الكاميرا 10 مرات من أجل تحديد متوسط ​​X الطابع، وY، وتعويض الزاوي من وسط محور الروبوت الأدوات. (العمليات التكنولوجية)
  6. كما هو الحال في ملاحظة: يتم إجراء عملية الحساب الداخلي بواسطة برنامج النظام الآلي لمحاذاة بالضبط الطوابع وX ساترة، ومواقع مراكز Y وإزاحة الزاوية في الخطوات R-μCP المستقبلية.
  7. 3.8) ضع ختم في حمام من alkanethiol البادئ ATRP، bromoisobutyrate ω-mercaptoundecyl (2 ملم في الإيثانول) كما هو مبين في الشكل 2F. (العمليات التكنولوجية)
  8. إزالة ختم من حل alkanethiol ووضعه على تيار النيتروجين المضغوط إلى 0.48 شريط (5 رطل) حتى يتبخر الإيثانول كما في الشكل 2G. بعد 1 دقيقة زيادة الضغط على تيار النيتروجين هو 1.03 بار (15 رطل) لضمان جفاف موحد. (العمليات التكنولوجية)
    ملاحظة: سوف التجفيف غير الكامل يؤدي إلى فقدان كلي أو جزئي للنمط الإخلاص.
  9. بعد التجفيف، ونقل ختم على موقف وسط المحسوب من الشريحة المغلفة بالذهب وخفضه إلى 100 ​​ميكرون الزيادات في حين رصد قوة المحرك المحور Z كما هو مبين في الشكل 2H.
    ملاحظة: يتم إبلاغ هذا الأمر عزم الدوران التي يعاني منها المحرك المحور Z وعرضها في برنامج التوجيه الروبوت. (العمليات التكنولوجية)
  10. وقف خفض ختم مرة واحدة وقد حقق ضغط محدد مسبقا من 79.2 كيلو باسكال، والبقاء على اتصال مع الشريحة المغلفة الذهب لمدة 15 ثانية. (العمليات التكنولوجية)
    ملاحظة: قيم الضغط هنا هي الأمثل لتصميم طابع وميزة الارتفاع الحالي. إذا تم تغيير تصميم الطوابع، وتحديدا للجانب ارتفاع نسبة الطوابع ولحن هذه وفقا لذلك من خلال عملية التجربة والخطأ.
  11. إزالة ببطء الطابع من الشريحة المغلفة بالذهب ووضع ختم العودة في المباراة طابع التعشيش. (العمليات التكنولوجية)
4. SI-ATRP من PEGMEMA على Micropatterned Coverslides
  1. الافراج عن الضغط فراغ عقد coverslide micropatterned، وتحويلها إلى 50 مل دورق شلنك. وختم ديغا في دورق شلنك باستخدام مضخة فراغ.
  2. إضافة 5.5 مل من ATRP خليط التفاعل التي تحتوي على macromonomer PEGMEMA (208.75 ملمول) والمياه (34.4 مل)، والميثانول (43.8 مل)، والنحاس (II) بروميد (1 ملمول)، و 2، 2-bipyridine (3 ملمول) ل القارورة Schlenk.
  3. إضافة 0.5 مل من أسكوربات L-الصوديوم (454.3 ملم) في الماء لبدء التفاعل، والسماح لها أن تستمر لمدة 16 ساعة على RT تحت غاز خامل.
    ملاحظة: بعد إضافة أسكوربات L-الصوديوم، واللون رد فعل التحول من الضوء الأخضر إلى البني الداكن كما هو مبين في الشكل 3A-B.
    ملاحظة: إن رد فعل يمكن أن يستمر إلى ما بعد 16 ساعة، ولكن ذلك لن زيادة كبيرة في طول فرش PEG.

figure-protocol-2 الشكل 3. بدء SI-ATRP. (A) الشروع في رد فعل و (ب) تغيير لون لاحقا بعد إضافة أسكوربات L-الصوديوم. (C) مجهر صورة سطح coverslide micropatterned بعد إجراء SI-ATRP. شريط النطاق 1 مم.

  1. إزالة coverslide micropatterned من القارورة شينك وشطف مع الايثانول والماء والإيثانول والجافة تحت تيار النيتروجين لطيف.
    ملاحظة: بعد SI-ATRP، وينبغي أن تكون التعديلات السطح المرئي للعين، ويمكن تصوير وتحليل تحت المجهر كما في الشكل 3C.
    ملاحظة: هذا هو أبسط طريقة لاختبار دقة المحاكمة لأنه يغني عن الحاجة إلى immunostain ركائز.

5. Functionalization أزيد من سلاسل Micropatterned PEGMEMA

  1. وضع coverslide micropatterned في 20 مل قارورة زجاجية رد فعل.
  2. إضافة 6 مل من N، N -dimethylformamide (DMF) تحتوي على 100 ​​ملي أزيد الصوديوم في قارورة التفاعل. الحفاظ على هذا التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: التعامل مع DMF فقط في غطاء الدخان الكيميائي. توخي الحذر عندما يزن من أزيد الصوديوم.
  3. عند الانتهاء، وإزالة coverslide micropatterned من القارورة رد فعل وشطف مع الماء والإيثانول ثم تجف تحت تيار النيتروجين.

6. التخميل من سلاسل البروم بين functionalized PEGMEMA

  1. وضع coverslide micropatterned في 20 مل قارورة زجاجية رد فعل.
  2. إضافة 6 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) تحتوي على 100 ملي و 300 ملي إيثانولامين ثلاثي الإيثيلامين إلى قارورة التفاعل. عقد هذا التفاعل عند 40 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: التعامل مع DMSO، ايثانول، وثلاثي الإيثيلامين فقط في غطاء الدخان الكيميائي.
  3. عند الانتهاء إزالة coversl micropatternedبيئة تطوير متكاملة من القارورة رد فعل، ثم شطف مع الماء والإيثانول الجافة تحت تيار النيتروجين.

7. R-μCP من الحلقة الداخلية وSI-ATRP من PEGMEMA

  1. تنفيذ الخطوات R-μCP كما هو موضح سابقا في خطوات 3.2 و 3،6 حتي 3،12، استبدال طابع PDMS مع 300 ميكرون و 600 ميكرون ID OD جاحظ للحلقة، على ان يكون للحلقة مع ميزات أصغر يتم وضعها داخل للحلقة micropatterned سابقا.
    ملاحظة: عتبة الضغط لهذا الطابع هي 132.0 كيلو باسكال. كما ذكر سابقا، يتم تحسين هذه الإعدادات الضغط للميزات الطوابع المستخدمة في هذه التجربة.
  2. تنفيذ الخطوات SI-ATRP كما هو موضح سابقا في خطوات 4،1-4،4.

8. الأسيتيلين Functionalization من سلاسل Micropatterned PEGMEMA

  1. وضع coverslide micropatterned في 20 مل قارورة زجاجية رد فعل.
  2. إضافة 6 مل من DMSO تحتوي على 100 مليpropargylamine إلى قارورة التفاعل. الحفاظ على هذا التفاعل على RT لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: التعامل مع DMSO وpropargylamine فقط في غطاء الدخان الكيميائي.
  3. عند الانتهاء إزالة coverslide micropatterned من القارورة رد فعل وشطف مع الماء والإيثانول ثم تجف تحت تيار النيتروجين.

9. المحفز النحاس "انقر" Biotinylation من الأسيتيلين إنهاء سلاسل PEGMEMA

  1. وضع coverslide micropatterned في 20 مل قارورة زجاجية رد فعل.
  2. إضافة 6 مل من كبريتات النحاس (15 ملم) / تريس [(1-البنزيل 1-H--1،2،3 triazol-4-YL) الميثيل] أمين (TBTA، 30 ملي) (1: 1 V / V المياه / DMF) التي تحتوي على 562 ميكرومتر أزيد PEG-4 -Biotin المكورات إلى قارورة التفاعل. إضافة 1.2 مل من حمض L-الاسكوربيك (0.15 ملم) في الماء إلى الخليط لتهيئة التفاعل.
  3. النيتروجين فقاعة من خلال محلول التفاعل لمدة 10 ثانية، وختم القارورة مع بارافيلم، وتتفاعل لمدة 24 ساعة على RT.
  4. على completioن إزالة coverslide micropatterned من القارورة رد فعل، وشطف مع الماء ووضعه في طبق البوليسترين 12-جيدا.

10. كشف مناعي من المجموعات المعقدة البيروكسيديز الأسيتيلين

  1. منع coverslide micropatterned في DPBS (3٪ المصل حمار) لمدة 1 ساعة على RT. وصمة عار للجماعات الأسيتيلين المعقدة البيروكسيديز مع Streptavidin-546 المترافقة (2 ميكروغرام / مل) في DBPS (3٪ المصل حمار في برنامج تلفزيوني) لمدة 2 ساعة على RT.
  2. شطف coverslide micropatterned 5 مرات مع DPBS لمدة 10 دقيقة مع الإثارة لطيف.
    ملاحظة: الشكل 4B يصور صورة من الشريحة بعد اكتمال هذه الخطوة.

مجانا النحاس و11. "انقر" Biotinylation أزيد من إنهاء سلاسل PEGMEMA

ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، وهذا التعديل خطوة الركيزة يمكن أن يؤديها في الموقع خلال زراعة الخلايا.

  1. ترك coverslide micropatterned في 12-جيدا صطبق olystyrene DBPS التالية يشطف.
  2. إضافة 2 مل من DBPS (أو خلية الإعلام الثقافة) تحتوي على 20 ميكرومتر DBCO-PEG 4 -Biotin، والسماح لهذا التفاعل أن تستمر لمدة 24 ساعة على RT (أو على 37 درجة مئوية في حاضنة).
  3. عند الانتهاء، شطف coverslide micropatterned 5 مرات مع DPBS (أو ببساطة إجراء تغيير وسائل الإعلام).

12. كشف مناعي من المجموعات المعقدة البيروكسيديز أزيد

  1. وصمة عار للجماعات أزيد المعقدة البيروكسيديز مع Streptavidin-488 المترافقة (2 ميكروغرام / مل) في 2 مل DPBS (3٪ المصل حمار) لمدة 2 ساعة على RT.
  2. شطف coverslide micropatterned 5 مرات في DPBS لمدة 10 دقيقة مع الإثارة لطيف.
  3. صورة micropatterned coverslide باستخدام المجهر متحد البؤر مضان. الشكل 4A-C يصور الصور من الشريحة بعد اكتمال هذه الخطوة.
    ملاحظة: عند استخدام ركائز لفحوصات زراعة الأنسجة، انتقل المادتين 10 و 12 من هذا البروتوكول. بعد degre المطلوب(ه) من functionalization، تعقيم coverslide هندسيا من قبل الشطف كلا الجانبين مع الإيثانول بنسبة 100٪ والتجفيف تحت تيار النيتروجين. نقل الشريحة إلى خزانة السلامة البيولوجية العقيمة وشطف الشريحة مع برنامج تلفزيوني خمس مرات قبل الشروع في بذر الخلية والثقافة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام تقنيات المحاذاة μCP اليدوية لمهندس ركائز الثقافة مع صفائف فرش PEG-المطعمة بين functionalized متعامد مع "فوق" وقد ثبت كيمياء في العمل السابق 6. ومع ذلك، وهذا يوفر الحد الأدنى من السيطرة على توجيه نمط وغالبا ما يؤدي إلى تداخل بين functionalized المناطق. هنا، يتم استخدام الرواية نظام R-μCP للتغلب على هذا القيد، وقدرته على نمط بدقة مجموعة من PEG للحلقة فرشاة مع 300 ميكرون و 600 ميكرون ID OD يقدمون مجموعة آلكاين الطرفية ضمن مجموعة منفصلة من PEG للحلقة فرشاة مع 600 مي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سوف ركائز مثالية لهندسة الأنسجة وبالتالي يتم bioinspired ألخص التوزيع المكاني للبروابط النشطة بيولوجيا الحيوية الموجودة داخل أنسجة الأم. فإنها تمتلك أيضا خصائص الديناميكية التي تمكن التعديلات الزمنية للبروابط والأنماط المكانية التي يتم تقديمها للسماح توجه التشكل الأنسجة والمقيدة مكانيا تحريض مصير الخلية. تلفيق مثل هذه ركائز يتطلب تجميد للمنبهات الكيميائية الحيوية المعقدة متعددة في التوجهات وأمر كبير على ركائز. في حين تحاكي جميع العوامل الذاتية من مكانة خلية في المختبر من ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصلحة مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير تمويل هذا العمل و GTK و TK و JDM من قبل معهد ويسكونسن للاكتشاف ومؤسسة أبحاث خريجي ويسكونسن.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
SCARA طرازات EpsonLS3-401STذات الدقة المتزايدة إذا رغبت في ذلك.
(Tridecafluoro-1،1،2،2-tetrahydrooctyl) ثلاثي كلورو سيلانGelestSIT8174.0تحذير ، يجب التعامل معه فقط في غطاء الدخان الكيميائي. عند سيلان الرقائق ، لا ينبغي لأحد أن يدخل غطاء المحرك حتى يتبخر كل السيلان.
المطاط الصناعي سيليكون Sylgard 184شركة Ellsworth AdhesiveCo NC9020938محاليل إزالة الغازات تقريبا عن طريق التعرض للفراغ قبل الاستخدام. مجموعات بديلة مثل Kit 182 مقبولة.
24 مم × 50 مم # 1 غطاء زجاجي شرائحفيشر Scientific48393106يمكن شراؤها من عدد من الموردين بأبعاد متفاوتة لتناسب الحاجة.
CHA-600 Telemark شعاع الإلكترون المبخرTelemarkSEC-600-RAPمتطلبات التدريب المتخصص.
EPSON LS3 SCARAEPSONLS3-401ST
& omega ;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrateProchimiaFT 015-m11-0.2يحفظ عند -20 درجة مئوية. يمكن استخدام البادئات الأخرى ATRP مثل R-& mu ؛ منصة CP قابلة للتطبيق على جميع طرق الزخرفة الدقيقة.
Schlenk قارورة أنبوبية 50 ملSynthware60003-078تتطلب سدادات مطاطية مع غشاء
بولي (إيثيلين جلايكول) ميثيل الأثير ميثاكريلاتسيجما ألدريتش447943يتم شحنها تحتوي على مثبطات قراءية خالية من MEHQ و BHT.
الميثانول (معتمد ACS)Fisher ScientificA412-4CAUTION ، التعامل معه فقط في غطاء الدخان الكيميائي.
النحاس (II) بروميدسيجما ألدريتش437867الحذر ، قلل من التعرض للقناع الجراحي.
2،2'-BipyridineSigma AldrichD216305الحذر ، قلل من التعرض للقناع الجراحي.
الصوديوم L-AscorbateSigma AldrichA4034
20 مل قوارير البورسليكات الزجاجية المتلألئةفيشر Scientific03-340-4E
أزيد الصوديومSigma AldrichS2002تحذير ، قلل من التعرض باستخدام قناع جراحي.
N ، N < / em >-dimethyformamideSigma Aldrich227056الحذر ، تعامل فقط في غطاء الدخان الكيميائي.
الإيثانولامينسيجما ألدريتش398136الحذر ، التعامل مع غطاء الدخان الكيميائي فقط.
TriethylamineSigma AldrichT0886CAUTION ، التعامل مع غطاء الدخان الكيميائي فقط.
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتش276855الحذر ، التعامل معه فقط في غطاء الدخان الكيميائي.
PropargylamineSigma AldrichP50900CAUTION ، التعامل مع غطاء الدخان الكيميائي فقط.
200 دليل علىتوزيع المواد بجامعة ويسكونسن2292تحذير ، تعامل فقط في غطاء الدخان الكيميائي.
Azide-PEG3-BiotinClickChemistryToolsAZ104-100قابل للذوبان في DMF
النحاس (II) كبريتاتسيجما ألدريتشC1297الحذر ، قلل من التعرض باستخدام قناع جراحي.
تريس [(1-بنزيل -1 ح-1،2،3-تريازول-4-يل) ميثيل] أمين (TBTA)سيجما ألدريتش678937
حمض الأسكوربيكسيجما ألدريتشA7506
عازلة الفوسفات الملحيةInvitrogen14190144
مصل الحمارسيجما ألدريتشD9663تعتبر العناصر الملوثة بمصل الحمار مواد خطرة بيولوجيا ويجب التخلص منها وفقا لذلك. تتوفر العديد من المركبات الأخرى ( على سبيل المثال < / em > BSA) وتخدم هذا الغرض.
البوليسترين الحرارية ذات الطابع الحراري 12 بئر- NUNC07-200-81من عدد من الموردين بأبعاد مختلفة.
DBCO-PEG4-BiotinClickchemistytoolsA105P4-10قابل للذوبان في DMF
Streptavidin ، Alexa Fluor 488 ConjugateLife TechnologiesS-11223قابل للذوبان في PBS
Streptavidin ، Alexa Fluor 546 ConjugateLife TechnologiesS-11225قابل للذوبان في PBS
Nikon A1-R مجهر متحد البؤرنيكونEclipse Ti ، A1Rالمجهر الفائفلورسنت كاف لتصوير ركائز منقوشة دقيقة.
تتوفر مجموعة خدمات يمكن شراء ألواح نيكون

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives. Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).
  2. Hucknall, A., Kim, D. -H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood. Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).
  3. Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins. Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).
  4. Rozkiewicz, D. I., Jańczewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. Click” Chemistry by Microcontact Printing. Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).
  5. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology. Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).
  6. Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes. Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).
  7. Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -A. RGD—Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells. Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).
  8. Ashton, R. S., et al. High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays. Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).
  9. Koepsel, J. T., Murphy, W. L. Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology. ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).
  10. Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).
  11. Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. Non-Fouling” Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization. Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).
  12. Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment. Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).
  13. Trinkle, C. A., Lee, L. P. High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling. Lab on a Chip. 11 (3), 455(2011).
  14. McNulty, J., et al. High-precision robotic microcontact printing (R-μCP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm. Lab on a Chip. , (2014).
  15. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
  16. Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).
  17. Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold. Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).
  18. Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), (2006).
  19. Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry. Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).
  20. Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition. Chemical Communications. 46 (1), 97(2010).
  21. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).
  22. Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. Inkjet printing for high-throughput cell patterning. Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).
  23. Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. Biomaterials. Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).
  24. Brouzes, E., et al. Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).
  25. Meitl, M. A., et al. Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp. Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Robotic Microcontact PrintingSequential Nucleophilic SubstitutionPEG Brush FunctionalizationGold Coated SubstratesOrthogonal Click ChemistriesTissue Culture SubstratesMicron Scale PatterningFluorescent Probe ConjugationStreptavidin BindingCustom Image Analysis

Related Articles