مقالة منهجية

إجراء لغرس الدائرة العمود الفقري للالطولية في فيفو التصوير من الحبل الشوكي ماوس

14.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52196

⸱

ديسمبر 3, 2014

 , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Cornell University, 2Department of Biomedical Engineering, Cornell University

في هذه المقالة

ملخص

في هذا الفيديو، ونحن تصف الإجراء لزرع غرفة التصوير الضوئي مزمنة على الحبل الشوكي الظهري على فأرة الحاسوب الحية. تتم مراجعة الغرفة، إجراء العمليات الجراحية، والتصوير المزمن وأظهر.

الملخص

مكنت >jove_content<الدراسات التي أجريت على القشرة المخية الحديثة للثدييات من حل غير مسبوق للبنية القشرية والنشاط والاستجابة للإهانات التنكسية العصبية من خلال التصوير المكرر بفاصل زمني في الجسم الحي في القوارض الحية. أصبحت هذه الدراسات ممكنة من خلال الإجراءات الجراحية المباشرة ، والتي مكنت من الوصول البصري لفترة طويلة من الزمن دون تكرار العمليات الجراحية. في المقابل ، كانت الدراسات المماثلة للحبل الشوكي تقتصر سابقا على عدد قليل من جلسات التصوير ، كل منها تتطلب جراحة جراحية. كما هو موضح سابقا ، قمنا بتطوير غرفة العمود الفقري التي تتيح الوصول البصري المستمر لمدة تزيد عن 8 أسابيع ، وتحافظ على الاستقرار الميكانيكي للعمود الفقري ، ويمكن تثبيتها بسهولة خارجيا أثناء التصوير ، ولا تتطلب سوى عملية جراحية واحدة. هنا ، تتم مراجعة تصميم حجرة العمود الفقري مع الأدوات الجراحية المرتبطة بها وعرض الإجراء الجراحي بالتفصيل. باختصار ، سيوضح هذا الفيديو تحضير المنطقة الجراحية والفأر للجراحة ، وتعرض الفقرة الشوكية وتنضير الأنسجة المناسب ، وتسليم الغرسة وتثبيت العمود الفقري ، واستكمال الغرفة ، وإزالة نظام التوصيل ، وختم الجلد ، وأخيرا رعاية ما بعد الجراحة. سيتم أيضا توضيح إجراء التصوير المزمن في الجسم الحي باستخدام الفحص المجهري غير الخطي. أخيرا ، تتم مناقشة النتائج والقيود والتباين النموذجي ودليل لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.

المقدمة

الوقت الفاصل في الجسم الحي المجهري في الكائنات سليمة تمكن رؤية مباشرة من العمليات البيولوجية المعقدة التي لا يمكن الوصول إليها لالتقليدي تحليل نقطة لمرة واحدة، مثل المناعية. على وجه التحديد، المجهري متعدد الفوتون (MPM) 1 يسمح للتصوير في نثر الأنسجة، مثل القشرة المخية الحديثة القوارض، حيث تحقق التصوير تصل إلى 2،3 والتي تزيد من 4 1 مم. عندما جنبا إلى جنب مع الاستعدادات الجراحية 5-7 التي إجراء واحد يسمح بالوصول البصري إلى الدماغ لمدة أسابيع أو شهور، وقد استخدمت هذه الأساليب المجهر لدراسة العمليات الدينامية في الدماغ في الدول السليمة والمريضة 8-11. وبالإضافة إلى ذلك، تم وضع بروتوكولات 12،13 التي توفر للتصوير في الجسم الحي في مستيقظا (أي غير تخدير) الحيوانات، والسماح لالخلوية القرار التصوير وظيفية خلال المقايسات السلوكية. وقد استخدمت هذه البروتوكولات لcomparisإضافات من مترابطة نشاط الخلايا العصبية 14، نجمية الكالسيوم مما يشير إلى 15 في الحيوانات تخدير ومستيقظا، وتحديد مهمة محددة مجموعات الخلايا العصبية 16، وقدرة الخلايا العصبية لتميز موقع الكائن على الخط الطولي التحفيز 17.

ونظرا للإمكانات هذا النهج لتوضيح آليات صحية ومرضية، والوقت الفاصل بين التصوير في الجسم الحي تم تطبيقها على الحبل الشوكي الماوس (SC)، والسماح لتحديد انحطاط محور عصبي حاد (AAD) كآلية المرض 18. التحقيق دراسات لاحقة آثار الآفات المحيطية على العقد الجذرية الظهرية (DRG) محور عصبي تجديد 19، ودور الأوعية الدموية في محور عصبي تجديد 20، الكيميائي الدبقية ردا على إصابة 21، والهجرة T-خلية في التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) 22، والنشاط من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية 23،24 25 ردا على amyotrophالتصلب الجانبي جيم (ALS)، ودور STAT-3 في تبرعم محور عصبي بعد SC إصابة (SCI) 26، وآلية من فقدان محور عصبي والانتعاش في EAE 27. وعلى الرغم من نجاح هذه المناهج، وجميع هذه الدراسات تقتصر على إما جلسة التصوير واحدة، مما يحد من الدراسات لديناميكية على المدى القصير، وإلا اللازمة المتكررة الفتحات الجراحية للحيوان في كل نقطة زمنية التصوير، مما يحد من عدد من النقاط الزمنية الوصول إليها ويزيد من احتمال من التحف التجريبية التباس. وقد نشرت البروتوكولات لهذه العمليات الجراحية سابقا 28،29.

في الآونة الأخيرة، نشرنا تقنية 30 لغرس غرفة العمود الفقري المزمنة التي مكنت الوقت الفاصل بين التصوير MPM في SC الماوس فوق أسابيع عدة دون الحاجة إلى تكرار عملية جراحية. لفترة وجيزة، وشملت هذه إعداد الجراحية أداء الثقب في العمود الفقري الصدري السفلي وغرس غرفة من أربعة أجزاء. الغرفة شملتثلاثة أجزاء الفولاذ المقاوم للصدأ خصيصا تشكيله التي فرضت فقرات المحيطة الثقب، وساترة الزجاج توضع فوق SC والمضمون مع سيليكون المطاط الصناعي. هذه التقنية سمحت للتصوير روتيني إلى أكثر من 5 أسابيع بعد العمل الجراحي في حالات صحية والجرحى دون الحاجة لتكرار عملية جراحية. عدد نقاط وقت التصوير كان محدود فقط من التردد الذي الحيوان يمكن أن يتسامح مع تحريض التخدير. تم تصوير حياة محدودة بسبب نمو، النسيج الليفي كثيفة على سطح SC. وبالإضافة إلى ذلك، نحن التحقق من أن عملية الزرع الجراحي لم يكن لها تأثير على المدى الطويل على وظيفة الحركة.

منذ نشر لدينا الأولي، وقد وصفت النهج البديلة أيضا تمكين التصوير طويل الأجل في أماكن أخرى SC 31-33. يوضح هذا البروتوكول إجراءاتنا لزرع الغرفة العمود الفقري وضعنا.

البروتوكول

وتمت الموافقة على الرعاية والتلاعب التجريبية من جميع الفئران في هذه الورقة من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة كورنيل: ملاحظة.

1. الإعداد للجراحة

  1. تعقيم جميع الأدوات المطلوبة باستخدام الأوتوكلاف أو إجراءات التعقيم المعتمدة. كحد أدنى، وتشمل مشرط، مقص، مقص فانا، ملقط، مفك البراغي الجواهري، ومسحات القطن، ومجموعة من الكامشات، الزرع (الشكل 1A) ونظام التسليم بها (الشكل 1D، E).
  2. مسح أسفل جميع الأسطح، بما في ذلك أي المقابض المجسام، مع 70٪ من الإيثانول و / أو المطهرات المناسبة.
  3. إنشاء حقل العقيمة التي تتراكب stereotax مخصصة (1D الشكل) والمحيطة الفوق مع الستائر العقيمة. يجب وضع وسادة التدفئة (يفضل ردود الفعل رقابة) على رأس stereotax وتحت الستائر العقيمة.

2. إعدادالماوس لجراحة

  1. تخدير ماوس تحت 5٪ الأيزوفلورين / الأكسجين في غرفة الاستقراء حتى معدل التنفس يبطئ إلى حوالي 1 نسمة / ثانية.
  2. نقل الماوس إلى منطقة التدريج بعيدا عن حقل معقمة، وذلك باستخدام مخروط الأنف لمواصلة التعرض الأيزوفلورين. تخفيض الأيزوفلورين إلى 2٪. تطبيق مرهم العين لمنع جفاف القرنية.
  3. إدارة غليكوبيرولات (دواء مضادات الكولين) في 0.05 ملغ / 100 غ الماوس العضل في hindlimbs باستخدام 29-30 الإبر G و3/10 سم مكعب حقنة، وتقديم ما يقرب من 50٪ من حجم الحقن في أطرافهم.
    ملاحظة: يخدم غليكوبيرولات لمنع تراكم السوائل في الرئتين في حين أن الفأر هو تحت التخدير.
  4. استخدام كليبرز الكهربائية، ويحلق جزء من الجانب الظهري من الفأرة، ما يقرب من 3 سم طويلة بنسبة 2 سم واسعة، وتركزت على القوس الصدري. تنظيف أي شعر قلصت بشكل جيد بعيدا عن منطقة حلق.
  5. إدارة الحقن تحت الجلد التالية والبعيدة للحلقالتصحيح باستخدام 29-30 الإبر G و3/10 الحقن سم مكعب: 1 مل / 100 ز الماوس الجلوكوز 5٪ في المياه المالحة (لترطيب)، و 5 ملغ / كغ كيتوبروفين الماوس (الأدوية المضادة للالتهاب لتسكين الألم)، 0.2 ملغ / كغ ديكساميثازون الماوس ( الستيرويد مضادة للالتهاب للحد من الالتهاب).
  6. باستخدام قطعة قطن، نفذ ثلاثة يغسل بالتناوب من اليود و 70٪ من الإيثانول، في انتظار 1 دقيقة بين يغسل.
  7. إدارة 100 ميكرولتر من 0.125٪ بوبيفكين (كتلة الأعصاب الطرفية) تحت الجلد باستخدام 29-30 الإبر G و3/10 سم مكعب المحقنة إلى مركز التصحيح حلق للحد من الألم في موقع شق.
  8. نقل الماوس إلى stereotax مخصصة (1D الشكل)، وإدراج مقياس الحرارة المستقيم، والانتظار حوالي 10 دقيقة لbupivicaine نافذة المفعول.

3. كشف وتنظيف الظهرية صفيحة من 3 المجاورة الصدر فقرات

  1. باستخدام شفرة مشرط، إنشاء صغيرة (5 ملم أو أقل) شق فوق فقرات من الفائدة (الشكل 2A).
  2. استخدام إما ملقط أو عن طريق إدراج غيض من مقص جراحي ونشر مقابض، وزيادة حجم فتحة في الجلد عن طريق تشريح حادة.
  3. باستخدام مشرط أو مقص جراحي، فصل بلطف فآسيا الضام بين الجلد والعضلات الأساسية.
  4. استخدام الكامشات لابعاد الجلد، والسماح لكبيرة كمنطقة عمل ممكن (الشكل 2B). والحرص على عدم زيادة الحمل على صدره، وبالتالي عرقلة التنفس.
  5. باستخدام زوج من ملقط، قبضة منقاري-معظم فقرة التي سوف يتعرض من خلال العضلات الفوقية. باستخدام مشرط، وقطع النسيج بعيدا عن جانبي عملية الظهرية من كل 3 فقرات (الشكل 2C).
  6. باستخدام أي مزيج من شفرة مشرط، ومسحات القطن، و / أو مكشطة العظام، وإزالة جميع الأنسجة المغطي من الصفائح الظهرية (الشكل 2D).
  7. باستخدام مقص جراحي، وقطع بعناية بعيدا الأوتار التي تعلق على فقرات على كل lateraحواف لتر من العمود الفقري (الشكل 2E).
  8. باستخدام مشرط، وإزالة بلطف قدر الأنسجة من الحواف الجانبية للعمود الفقري ممكن من أجل توفير سطح لقط نظيفة.
  9. ينضر بلطف فقرات من أي نوع من الأنسجة الناعمة المتبقية باستخدام مكشطة العظام و / أو مسحة القطن. تقليم بعيدا أي نوع من الأنسجة غير المترابطة في أماكن أخرى باستخدام مقص جراحي (الشكل 2F).
    ملاحظة: من الضروري لكل من تحامل وأداء الثقب الظهرية أن فقرات يتعرض نظيفة. قد يكون من المفيد cauterizer في السيطرة على النزيف اللاحق.
  10. تحويل الكامشات لابعاد الأنسجة المحيطة العمود الفقري بالإضافة إلى الجلد (الشكل 2F).
  11. إرفاق الحانات الجانب زرع للشوكات على المشاركات التسليم وتحميل هذه إلى ما بعد أصحاب (كما في الشكل 1E).
  12. المشبك فقرات 3 باستخدام القضبان الجانبية، وممارسة الضغط فقط ما يكفي لعقد securelص (الشكل 2G، H). استخدام ملقط للمساعدة في ضمان لقط مستوى الفقرات 3. لاحظ أن عدة محاولات قد تكون ضرورية. تأكد من أن القضبان الجانبية كلا مستوى وبالتوازي قبل تنفيذ الثقب.
  13. نظيفة بعناية ويجف السطح الظهري للفقرات فرضت باستخدام قطعة قطن.

4. إجراء استئصال الصفيحه الظهرية

  1. إدراج نصائح من مقص vannas في الفضاء فوق الجافية للفقرة فرضت وسطي والضغط على مقابض طفيفة. إذا كانت العظام جافة، وينبغي أن الكراك على طول الصفيحة الظهرية. كرر هذا الإجراء على الجانب المقابل للافراج عن الصفيحة.
  2. تجتاح بلطف الصفيحة فضفاضة من خلال عملية الظهرية مع ملقط، وقطع بعناية بعيدا أي النسيج الضام في نهايات منقاري والذيلية من الصفيحة ورفعه بعيدا.
  3. باستخدام المياه المالحة 0.9٪ و / أو الاصطناعي السائل الشوكي الدماغي (ACSF)، يغسل جيدا بعيدا أي overlyi الدمنانوغرام الحبل الشوكي. استخدام مسحات القطن لامتصاص السوائل الزائدة.
  4. باستخدام مقص vannas، وتقليم بعناية الحواف الجانبية للعظم إلى القضبان الجانبية لعملية الزرع. مرة أخرى، يغسل والسيطرة على النزيف باستخدام قطعة قطن والمالحة / ACSF.
  5. في حالة عدم وجود جزء من السمحاق وفصل ويعتلي الحبل الشوكي، وإزالة بلطف هذا النسيج باستخدام قطعة قطن و / أو 29 - G 30 إبرة. احرص على عدم إصابة الحبل الشوكي في هذا الجزء من الإجراء. لا تخلط بين السمحاق فضفاض مع جافية ملفوفة بإحكام.
  6. بعناية، وختم حواف المتبقية المكشوفة من العظام مع واحد أو كلا من الاكريليك الأسنان وcyanoacrylate (الشكل 2I). عناية خاصة عدم السماح للالغراء بالتدفق على الحبل الشوكي المكشوفة.

5. ختم الغرفة

  1. ضع الصفيحة العلوية بعناية بحيث 4 فتحات يصطف مع 4 ثقوب على أشرطة الجانب وفتح يعتلي تدور يتعرضآل الحبل (1B الشكل و2J).
  2. باستخدام مفك البراغي الصائغ، وبدء بعناية المسمار الأول، وتحقيق الاستقرار رمح من مفك البراغي مع زوج آخر من الملقط. لا تشديد المسمار في هذه المرحلة، ولكن أدخله بحيث يشاركون في المواضيع القليلة الأولى. كرر هذه العملية لمدة 3 مسامير أخرى.
    ملاحظة: من المفيد استخدام التيتانيوم أو غيرها من ملقط غير magnetizable للمساعدة في وضع مسامير في هذه المرحلة.
  3. مع كل المسامير 4 في مكان، وتشديد كل برغي بالتناوب من قبل نفس المبلغ في زيادات صغيرة حتى يتم تأمين مسامير بحزم (الشكل 2K). لاحظ أنه ليس من غير المألوف لوحة العليا لثني أثناء هذه العملية. والحرص على عدم تضييق الخناق كثيرا، وعلى رأس المسمار قد تكسر وسوف الضغط النزولي المفرط طرد المشبك و / أو يؤدي إلى وقوع إصابات في النخاع الشوكي.
  4. استخدام المطاط الصناعي السيليكون لملء الفراغ بين الحبل الشوكي وزجاج النافذة. لأنه ظبيةق لا تنتج حامض الخليك خلال علاج، استخدم KwikSil المطاط الصناعي العلامة التجارية ونصائح الخلط. تطبيق الليبرالية جزء من السيليكون إلى الحبل الشوكي المكشوفة. احرص على التخلص من أي سيليكون تحتوي على فقاعات الهواء من طرف خلط قبل تطبيق إلى الحبل الشوكي.
  5. العمل بسرعة، اضغط بلطف على بعد 5 ملم # 0 ساترة في أقحم في الصفيحة العلوية. تطبيق ما يكفي من الضغط للضغط تدريجيا المطاط الصناعي السائل لتطويق الحبل الشوكي، ولكن لا يؤدي إلى انضغاط الحبل الشوكي (الشكل 2L). تحديد وقت للالمطاط الصناعي حوالي 90 ثانية، لذلك تأكد من تطبيق ساترة بسرعة.
  6. في حال وجود الختم فشل، والانتظار حتى وضعت المطاط الصناعي، وإزالة بلطف من عملية الزرع بالملقط، وكرر 5،4-5،5.
  7. تغطية حواف المطاط الصناعي ناضح مع الأسنان الاكريليك / cyanoacrylate والتمسك العظام المحيطة بها قدر الإمكان لمنع المطاط الصناعي من التحول على سطح الحبل الشوكي.
  8. إزالة الكامشات وسحب الجلد في كل أنحاء حافة الزرع. استخدام cyanoacrylate، والتمسك الجلد لحواف الزرع (الشكل 2M، N).
  9. إدراج # 0-80 - 1/4 "مجموعة مسامير في أجنحة الصفيحة العلوية (الشكل 1C و 2 O).
  10. باستخدام الاكريليك الأسنان، وختم أي ثغرات في فتحات المسمار من أعلى لوحة (الشكل 2P).

6. بعد العملية الجراحية العناية

  1. إزالة الحيوانات من التخدير ومكان في قفص نظيف واسع. تأكد من أن قفص كبير بما فيه الكفاية أن الغرفة لن بعقبة على أي شيء (مثل تراجع على شكل حرف V لزجاجة المياه و / أو المواد الغذائية) أثناء تحرك طبيعي في جميع أنحاء القفص.
    ملاحظة: قفص الفئران هو معيار مثالي.
  2. وضع القفص على سطح ساخن في حين يتعافى الحيوان. لا عودة الماوس للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى بشكل كامل.
  3. تحقق بهاء الحيوانvior داخل 1 - 2 ساعة postoperation عن علامات الألم أو الضيق ووحدة زرع.
    ملاحظة: في ظل ظروف طبيعية، وينبغي أن يكون الحيوان قادرا على ambulate مع الاضطرابات متواضعة إلى الحركة.
  4. مواصلة للتحقق الحيوان كل 8-12 ساعة لساعة ال 72 الأولى، وقياس الوزن ومراقبة السلوك. تأكد من أن الحيوانات النشطة والمتحركة أثناء الليل. الغذاء الرطب في شكل الأرض تشاو مختلطة مع الماء أو المواد الهلامية الغذائية، والكريات طعام، وينبغي توفير مياه الشرب على مستوى الأرض. وينبغي توفير ترطيب إضافي عن طريق الحقن تحت الجلد أو intraperiotoneal حسب الضرورة.
  5. إدارة 5 ملغ / كغ كيتوبروفين الماوس و 0.2 ملغ / كغ تحت الجلد الماوس ديكساميثازون في 24 و 48 نقطة الساعة ساعة، بعد العمل الجراحي. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تدار 0،005-0،010 ملغ / 100 غ الماوس كل 8 ساعة عن طريق الحقن تحت الجلد لمدة 72 ساعة.

7. في فيفو التصوير

  1. تخدير ماوس تحت5٪ الأيزوفلورين / الأكسجين في غرفة الاستقراء حتى معدل التنفس يتباطأ إلى ما يقرب من 1 التنفس / ثانية.
  2. نقل الماوس إلى stereotax مخصصة (1D الشكل) مع ردود الفعل التي تسيطر عليها سادة التدفئة وإدراج مقياس الحرارة المستقيم. تخفيض الأيزوفلورين إلى 2٪.
  3. إدارة غليكوبيرولات 0.05 ملغ / 100 غ الماوس العضل في hindlimbs باستخدام 29-30 الإبر G و3/10 سم مكعب حقنة، وتقديم ما يقرب من 50٪ من حجم الحقن في أطرافهم.
  4. إدارة 1 مل / 100 ز الماوس 5٪ جلوكوز (لترطيب) تحت الجلد في المياه المالحة مرة واحدة في الساعة.
  5. إدراج أصحاب غرفة الخيوط في مرحلة ما بعد أصحاب المستخدمة في الجراحة (الشكل 1F). ضبط ارتفاع وتطور الوظائف على مسامير مجموعة في الصفيحة العلوية.
  6. مع إرفاق كل من أصحاب، ورفع حامل اللقب في ما بعد حاملي حتى الصدر يمكن أن تتوسع بحرية على الإلهام.
    ملاحظة: كل من التعلق الراسخ من أصحاب وتوسيع الحر للsignifican الصدرتخفيض TLY الحركة الفنية بسبب التنفس.
  7. أداء التصوير كما تريد.
  8. عندما التصوير اكتمال، وانخفاض وظيفة، وتطور قبالة أصحاب الغرفة، وإزالة الحرارة المستقيم، ومكان الماوس على سطح ساخن لاسترداد. لا عودة الماوس للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى بشكل كامل.

النتائج

باتباع الإجراء أعلاه، يجب على كل مرحلة من مراحل عملية جراحية تحاكي نتائج كل مرحلة من مراحل عملية جراحية المبين في الشكل 2. يجب توخي الحذر خاصة عند تطبيق المطاط الصناعي السيليكون للقضاء على فقاعات الهواء تحت الزجاج أو على الأقل ضمان أنهم تقع في محيط منطقة الفائدة (الشكل 2L). لجراح ذوي الخبرة، والمضاعفات الجراحية التي تتطلب القتل الرحيم إما أثناء الجراحة أو خلال أول 24 ساعة postsurgery تحدث في حوالي 20٪ من العمليات. تنشأ هذه المضاعفات الأكثر شيوعا من نزيف مفرط الأنسجة اللينة أو عدم إرفاق آمن الغرفة إلى العمود الفقري.

في غرف زرعها بنجاح، يبقى نافذة عادة شفافة بصريا لأسابيع متعددة (الشكل 3). وعلى الرغم من أفضل الجهود، يشكل، ليفي، ونمو الأورام مبهمة في كثير من الأحيان في غضون بضعة أيام، مما أدى إلى obscuri جزئينانوغرام من النافذة (الشكل 3C - F، خط متقطع الأسود). الهياكل الفلورسنت من الصعب أن نرى باستخدام 2PEF المجهري تحت هذا النسيج الليفي. نجد التوزيع ذات النسقين النتائج، مع ما يقرب من 50٪ من النوافذ زرعها بنجاح المتبقية واضحة لأكثر من 5 أسابيع بعد العمل الجراحي، وحوالي 50٪ تصبح التعتيم ضمن 1 - 3 أسابيع. للنوافذ التي لا تزال واضحة، ومعظم الأماكن داخل نافذة عرض تجربة فقط على درجة متواضعة من اتساع الأوعية الدموية في أو فوق الجافية (الشكل 3D - F، النجمة الخضراء)، والتي لا تعيق 2PEF التصوير. وأظهرت دراستنا السابقة 30 زيادة في الخلايا الدبقية الصغيرة ولكن ليس كثافة نجمية تحت النافذة وفقرات المجاورة، مشيرا إلى التهاب خفيف مماثل لتلك التي شوهدت في الجمجمة الاستعدادات نافذة 5.

في الفئران المعدلة وراثيا معربا عن البروتين أصفر فلوري (YFP) في مجموعة فرعية من ظهري gangl الجذرIA (DRG) الخلايا العصبية (خط YFPH، جاكسون مختبرات)، وكانت محاور بوضوح مميزة لعدة أسابيع بعد العملية (الشكل 4A و ب) وطالما أربعة أشهر في حيوان واحد (لا تظهر البيانات). وقدمت الأوعية الدموية (4A الشكل وباء) مرئية عن طريق حقن-orbitally الرجعية الفلورسنت تكساس الأحمر المسمى ديكستران في بلازما الدم. تم تصور الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا في الفئران معربا عن GFP في CX3CR1 الضربة القاضية في الماوس (CX3CR1-GFP، جاكسون مختبرات) عبروا إلى خط YFPH (الشكل 4C). وعلى النقيض من قرار تدهورت بشكل متواضع على مر الزمن (الشكل 4C) بسبب تشكيل لفرط ليفي وصفه سابقا 30. نحن تصويرها بشكل روتيني لمدة 3 ساعة في جلسة واحدة دون وفيات وبقدر ما كل 12 ساعة. مدة الدورة وتردد محدودة بسبب التسامح من الحيوان لتحريض التخدير، يصاحب ذلك مع الاعتبارات الأخلاقية المصاحبة بالألم والضيق للحيوانات المختبر.

< ص الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> figure-results-1
Figure1. جناح العمليات الجراحية المخصصة يسهل تسليم الغرفة خلال زرع واستقرار الغرفة خلال جلسات التصوير لاحقة. اثنين من الجانب القضبان والصفيحة العلوية (A) يتم تجميعها (ب) باستخدام مسامير صغيرة في غرفة العمود الفقري (C). يسمح جدول الجراحي على مشاركات قابلة للتمديد (D) لتسليم وتحامل من الجانب القضبان إلى فقرات باستخدام دبابيس عقد (E). جلسات التصوير لاحقة بدلا من استخدام الخيوط المشاركات داخليا لنعلق على غرفة عبر مجموعة مسامير على الأجنحة للزرع (F). لقد تم تعديل لوحة (ب) من هذا الرقم من فارار وآخرون، طرق الطبيعة، 2012 30 بإذن من الطبيعة المجموعة النشر.96 / 52196fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. يتم تنفيذ الثقب الظهرية ويتم زرع في غرفة التصوير المزمنة لتوفير الوصول البصري إلى الحبل الشوكي. ووصف الإجراء في المونتاج. أولا، والجلد (لوحات A، B، أقسام بروتوكول 3،1-3،4) والعضلات (C؛ 3.5) وتراجع لفضح فقرات الأساسية الثلاث. تتم إزالة الأنسجة المغطي هذه الفقرات الثلاث (D، E، F، 3،6 حتي 3،10) والعمليات الجانبية يتم كشط نظيفة قبل أن يتم فرضت أنها على كلا الجانبين (G، H، 3.12). بعناية، والصفيحة الظهرية للفقرة المركزية تتم إزالة وحواف العظام مختومة (I (J؛ 5.1) ومسامير تثبيتها في مكانها (K، 5.3) لتأمين غرفة قبل ختم الغرفة مع المطاط الصناعي السيليكون والزجاج غطاء (L، 5.5). بعد إزالة المسامير تسليم (M، 5.8)، يتم لصقها على الجلد على جانبي الغرفة (M، N، 5.8) ويتم إدراج مجموعة مسامير في أجنحة (O؛ 5.9). وأخيرا، وأغلقت فتحات المسمار مع الاكريليك الأسنان (P؛ 5.10). ويتم وضع الماوس في قفص نظيفة لاسترداد الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3

وما زالت هناك غرفة في العمود الفقري المزمنة الشكل 3. اوف شفافة بصريا إيه أسابيع متعددة. صور الضوء الأبيض من الحبل الشوكي، والتي تتراوح بين عدة دقائق (A) إلى ثلاثة أسابيع بعد العمل الجراحي (F). معالم الأوعية الدموية يمكن تمييزها في جميع نقاط الوقت (الأسهم الصفراء). وينظر تغيير يذكر في postsurgery يوم واحد (B). فرط كثيفة ليفي (C - F، يحدها خط متقطع على أسفل اليمين) هو الحاضر في وقت مبكر من ثلاثة أيام والنتائج في التعتيم الجزئي للمنطقة التصوير. اتساع الأوعية الدموية معتدل (D، E، F، النجمة الخضراء) موجود أيضا، ولكن لا تحجب الأوعية الدموية الأصلي في ضوء أبيض أو 2PEF التصوير. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4

الطبقة = "jove_content"> الشكل 4. غرفة في العمود الفقري المزمنة تسمح المتكررة التصوير متعدد الفوتون دون الحاجة لتكرار عملية جراحية. التصوير المتكرر من الفئران المعدلة وراثيا معربا عن YFP في مجموعة فرعية من المحاور DRG (الأخضر) في حبلات الظهري من العمود الفقري الحبل والأوعية الدموية (أحمر) وصفت من قبل داخل الأوعية الدموية حقن صبغة (A، B). ويمكن أيضا أن يتم تعقب نشاط الخلايا الدبقية الصغيرة (البنفسجي) على مر الزمن في Thy1-YFP / CX3CR1-GFP الفئران المعدلة وراثيا المزدوج (C). في حين محاور والخلايا الدبقية الصغيرة لا تزال مرئية، وعلى النقيض من قرار انخفاض طفيف مع مرور الوقت (C). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

هذه التقنية أثبتت هنا تسمح المتكررة، الوقت الفاصل، في الجسم الحي التصوير من ظهري الماوس SC إلى عدة أسابيع بعد الجراحة دون الحاجة إلى عمليات جراحية لاحقة. يمثل هذا الإجراء تحسنا كبيرا خلال دراسات التصوير تكرار جراحة أو على النهج النسيجية portmortem، حيث يتم فقدان المعلومات عن ديناميات الخلوية. لدينا في السابق 30 أثبتت قيمة هذه التقنية لدراسة SCI علم الأمراض في الجسم الحي.

تم تحديد أقصى مدى الطولي للتصوير من خلال نمو لذلك، النسيج الليفي كثيفة على السطح الظهري للSC. مع مرور الوقت، وأدى هذا النمو إلى فقدان النقيض من الصورة والقرار. كما تم رأيت هذا النمو في الأعمال التحضيرية الجراحية البديلة 31. الروايات المتناقلة، لاحظنا أن هذا النمو يمكن التقليل من غسل بعناية السطح الظهري SC لإزالة منتجات الدم، وختم سطحقطع العظام مع cyanoacrylate، وختم حواف من الغرفة جيدا مع السيليكون والمطاط الصناعي، والتقليل من الفضاء الخلالي بين SC الظهرية وغطاء زجاجي.

في الآونة الأخيرة، فقد ثبت مقاربة أخرى مماثلة لمنطقتنا باستخدام غرفة البولي 32. استخدام البولي هو مفيد لأنه متوافق مع الأشعة السينية وطرائق التصوير الصوتية، وهي ليست الحال بالنسبة لأجزاء لدينا الفولاذ المقاوم للصدأ. ومع ذلك، مع التكنولوجيا الآن في كل مكان من الطابعات 3D، يمكن أن تكون ملفقة أجزاء الغرفة من مجموعة واسعة من المواد لتتناسب مع احتياجات محددة. لقد طبعت مؤخرا جميع أجزاء لدينا في فوتوبوليمير واضح.

عيب واحد رئيسي في غرفة مغلقة هو عدم القدرة على إدارة جرعات متكررة من الأدوية أو الأصباغ الخارجية مناسبة لSC التصوير 34. ومع ذلك، من خلال الاستفادة من الاستقرار الميكانيكي للنظام الحالي دينا، ونحن قد استخدمت بالفعل لدينا غرفة الحالية إلى النجاحلاي ترسيخ قسطرة داخل القراب متصلة تحت الجلد المزروع ميناء حقن، مما سمح لتسليم المخدرات في نقاط زمنية متعددة حتى في نظام الدائرة المغلقة (عمل غير منشورة). وعلاوة على ذلك، نظرا لطبيعة وحدات من الصفيحة العلوية، سوف الإصدارات المستقبلية من هذا المستحضر تشمل غرفة الأغلاق للسماح لتطبيق المتكررة من كل من العوامل العلاجية والعلامات الفلورية. ومن الممكن أيضا أن نتصور العليا لوحات مع تصاعد لتسجيل الأقطاب، وتدرج البصرية، ومنافذ لتوصيل الدواء. ان مثل هذه الإضافات من المرجح أن تكون أكثر تحديا لتنفيذ باستخدام نظام أكثر الحد الأدنى من Fenrich وآخرون. 31. وفي الختام، تقدم غرفة لدينا منصة بوابة التي تقوم عليها ويمكن أن تستند التجارب المتنوعة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه ، ولا مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور جوزيف ر. فيتشو على مساهمته طوال تطوير الإجراء. يسعدنا أن نعرب عن تقديرنا للتمويل من المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (R01 EB002019 إلى CBS و DP OD006411 إلى Joseph R. Fetcho) والمجلس الوطني للعلوم والبحوث في كندا (إلى M.J.F.) للدعم المالي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مقص فاناسأدوات العلوم الدقيقة15000-04
ملقط ، مقص ، مشرط ، إلخ.أدوات العلوم الدقيقةمتعددة 
طقم الضام - المثبت المغناطيسيأدوات العلوم الدقيقة18200-02
طقم الضام - ضامأدوات العلومالدقيقة 18200-09يمكن أيضا استخدام أدوات
الضام الأخرى - أدوات العلوم الدقيقة المطاطية18200-07
بطانية التدفئة التي يتم التحكم فيها بردود الفعلCWE Inc.الموديل: TC-1000 الماوس                           الجزء رقم 08-13000
التجسيمانظر Farrar et al، Nat. Meth.، 9 ، 297 ، 2012 ، ملحق (عبر الإنترنت)
العمود الفقريانظر Farrar et al، Nat. Meth. ، 9 ، 297 ، 2012 ، ملحق (عبر الإنترنت)
حامليانظر Farrar et al، Nat. Meth. ، 9 ، 297 ، 2012 ، ملحق (عبر الإنترنت)
غراء سيانواكريليتLoctiteLoctite 495متعدد الموردين
Teets مسحوق المرجان البارد (مسحوق أكريليك الأسنان)TeetsMfg. الجزء: 8101الموردين المتعددين
Teets سائل العلاج البارد (سائل أكريليك الأسنان)TeetsMfg. الجزء: 8501موردين متعددين
GlycopyrrolateMWI Veterinary SupplyMWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602) D
- (+) -GlucoseSigma-AldrichG5767
BupivacaineMWI Veterinary SupplyMWI SKU: 029841 (Hospira 116301) Ketoprofen
MWI Veterinary SupplyMWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)
ديكساميثازونMWI Veterinary SupplyMWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)
KwikSil ElastomerWorld Precision Inc.KWIK-SIL
KwikSil نصائح الخلطالعالمية الدقة Inc.كويكميكس
غرفة الغرفة الشوكية

المراجع

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 μm in living brains by use of a Ti: Al 2 O 3 regenerative amplifier. Optics Letters. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  3. Kobat, D., Durst, M. E., Nishimura, N., Wong, A. W., Schaffer, C. B., Xu, C. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  4. Horton, N. G., Kobat, D., Wang, K. In Vivo, Deep Tissue Three-Photon Imaging at the 1700-nm Spectral Window. Biomedical Optics. 7 (3), (2012).
  5. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  6. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  7. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7 (12), 981-984 (2010).
  8. Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 7 (6), 449-463 (2006).
  9. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
  10. Kerr, J. N. D., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Reviews Neuroscience. 9 (3), 195-205 (2008).
  11. Lichtman, J. W., DENK, W. The Big and the Small: Challenges of Imaging the Brain's Circuits. Science. 334 (6056), 618-623 (2011).
  12. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake, Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  13. Wienisch, M., Blauvelt, D. G., Sato, T. F., Murthy, V. N. Two-Photon Imaging of Neural Activity in Awake, Head-Restrained Mice. Neuromethods. 67 (18), 45-60 (2011).
  14. Greenberg, D. S., Houweling, A. R., Kerr, J. N. D. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats). Nature Neuroscience. 11 (7), 749-751 (2008).
  15. Thrane, A. S., Thrane, R. V., Zeppenfeld, D., Lou, N., Xu, Q., Nagelhus, E. A., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (46), 18974-18979 (2012).
  16. Dombeck, D. A., Graziano, M. S., Tank, D. W. Functional Clustering of Neurons in Motor Cortex Determined by Cellular Resolution Imaging in Awake Behaving Mice. Journal Of Neuroscience. 29 (44), 13751-13760 (2009).
  17. Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
  18. Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nature Medicine. 11 (5), 572-577 (2005).
  19. Ylera, B., Ertürk, A., et al. Chronically CNS-Injured Adult Sensory Neurons Gain Regenerative Competence upon a Lesion of Their Peripheral Axon. Current Biology. 19 (11), 930-936 (2009).
  20. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (23), 9459(2009).
  21. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58 (9), 1133-1144 (2010).
  22. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).
  23. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. Plos One. 6 (3), 17910(2011).
  24. Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nature Communications. 3, 1227(2012).
  25. Dibaj, P., Steffens, H., Zschüntzsch, J., Kirchhoff, F., Schomburg, E. D., Neusch, C. In vivo imaging reveals rapid morphological reactions of astrocytes towards focal lesions in an ALS mouse model. Neuroscience Letters. 497 (2), 148-151 (2011).
  26. Bareyre, F. M., Garzorz, N., Lang, C., Misgeld, T., Buning, H., Kerschensteiner, M. In vivo imaging reveals a phase-specific role of STAT3 during central and peripheral nervous system axon regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (15), 6282-6287 (2011).
  27. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nature Medicine. 17 (4), 495-499 (2011).
  28. Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nature Protocols. 2 (2), 263-268 (2007).
  29. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy. J. Vis. Exp. 59, 2760(2012).
  30. Farrar, M. J., Bernstein, I. M., Schlafer, D. H., Cleland, T. A., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nature. Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  31. Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).
  32. Figley, S. A., et al. A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model. Plos One. 8 (3), 58081(2013).
  33. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. 82, 50826(2013).
  34. Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes. Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

زراعة غرفة نخاعيةإجراء جراحيمجهرية متعددة الفوتوناتتثبيت الفقراتاستئصال الصفائح الفقرية الظهريةسد باستخدام إيلاستومر السيليكونالتصوير المزمنالرعاية بعد الجراحة
إجراء لغرس الدائرة العمود الفقري للالطولية في فيفو التصوير من الحبل الشوكي ماوس
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.