يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

كله جبل التصوير من جنين فأر التوقعات الحسية أكسون

9.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52212

⸱

ديسمبر 9, 2014

 ,  , 
1Brain and Mind Research Institute, Burke Medical Research Institute, Weill Medical College of Cornell University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا محسنا للنمط الجيني وتلميث الفئران الجنينية وتلطيخها وإعدادها لتصوير الإسقاطات العصبية المحيطية لمستقبلات الألم في بأكمله ، كطريقة فعالة لتقييم الأنماط الظاهرية لنمو المحور العصبي الحسي في تطوير الفئران المعدلة وراثيا.

الملخص

تصور كامل طول التوقعات العصبية في الأجنة أمر ضروري للحصول على فهم كيفية تطور الثدييات الشبكات العصبية. نحن هنا تصف طريقة لتسمية في الموقع مجموعة فرعية من عقدة الجذر الظهري (DRG) التوقعات محور عصبي لتقييم خصائصها المظهرية باستخدام عدة خطوط الماوس التلاعب بها وراثيا. الخلايا العصبية-TrkA الإيجابية هي الخلايا العصبية مستقبلة الأذية، مخصصة لنقل إشارات الألم. نحن نستخدم خط الماوس TrkA taulacZ لتسمية مسارات كافة محاور الطرفية-TrkA إيجابي في جنين الفأر سليمة. نحن أبعد تولد خط TrkA taulacZ على خلفية فارغة باكس، الذي يلغي أساسا موت الخلايا المبرمج العصبية، من أجل تقييم الأسئلة المتعلقة النمو بشكل مستقل عن الآثار المحتملة للالتلاعب الجيني على بقاء الخلايا العصبية. وفي وقت لاحق، هي ولدت الفئران المعدلة وراثيا في المصالح مع TrkA taulACZ / باكس خط باطل ونحن على استعداد لدراسة باستخدام التقنيات الموصوفة هنا ثم. ويشمل هذا العرض معلومات مفصلة عن خطط تربية الماوس، التنميط الجيني في وقت تشريح، وإعداد الأنسجة، وتلطيخ والمقاصة للسماح لرؤية كامل طول مسارات محور عصبي في إعداد كامل جبل.

المقدمة

إنشاء شبكات الخلايا العصبية الدقيقة هي عملية التنموية المعقدة ضرورية لوظائف الجهاز العصبي. اضطراب في هذه العملية يؤدي إلى اختلال الوظائف العصبية التي تورطت في الأمراض العصبية الإنسان 1-3. لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء نمو محور عصبي وتعصيب المستهدفة في الثدييات، وقد وضعنا بروتوكولا لتصور مسارات محور عصبي من TrkA، معربا عن الخلايا العصبية الحسية باستخدام مزيج من اثنين من خطوط الماوس المعدلة وراثيا.

TrkA هو مستقبلات لعامل نمو الأعصاب NGF، وهو علامة وظيفية من الخلايا العصبية الحسية مسبب للألم 4. وأعرب عن TrkA غاية في الخلايا العصبية مسبب للألم خلال التنمية في وقت مبكر ويتوسط بقاء الخلايا العصبية التي تعتمد على NGF، والنمو محور عصبي، تشجر والهدف تعصيب 5-9. في الفئران TrkA taulacZ، يتم استبدال البرية نوع الجينات TrkA من قبل taulacZ التعبير جassette 10، على ان يكون التشكل محور عصبي من الخلايا العصبية-TrkA الإيجابية المفترضة يمكن تصور كتبها β-غال (X-غال) تلطيخ 11. باستخدام سطر TrkA taulacZ / WT متخالف، يمكننا دراسة العوامل التي قد تتداخل مع تنظيم أو تطوير التوقعات وارد الحسية في الجسم الحي.

وعلاوة على ذلك، TrkA التعبير غائبة في الفئران متماثلة اللواقح TrkA taulacZ / taulacZ، والتي يمكن بالتالي استخدامها لتقييم نمو محور عصبي تعزيز آليات في غياب NGF / TrkA الإشارات. منذ الخلايا العصبية مسبب للألم تعتمد على NGF / TrkA يشير ليس فقط للنمو محور عصبي، ولكن أيضا من أجل البقاء، ونحن توظيف خط الماوس آخر، تفتقر إلى الجين باكس المؤيد لأفكارك، لمنع موت الخلايا المبرمج في الخلايا العصبية DRG الجنينية، إنقاذهم من موت الخلايا التي هي على خلاف ذلك لوحظ في غياب TrkA الإشارات. وباكس - / - 12 الخلفية مما يسمح للmolecuتشريح لار من مسارات الإشارات التي تؤثر على وجه التحديد 7-9،13-15 نمو محور عصبي. في TrkA - / -: باكس - / - الفئران، والخلايا العصبية DRG البقاء على قيد الحياة، ولكن الحسي تعصيب وارد في الجلد وألغيت تماما 14،15. يمكننا تفعيل انتقائي مسارات إشارات لتحديد مساهماتها في تطوير التوقعات محور عصبي. فائدة هذه الطريقة هي أنها تسمح للتقييم التغيرات في الظواهر نمو محور عصبي عندما تربى تعديلات وراثية مختلفة على TrkA taulacZ / taulacZ: باكس - / - أو TrkA taulacZ / WT: باكس - / - الخلفيات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: جميع إجراءات تتوافق مع دليل المعاهد الوطنية للصحة لاستخدام ورعاية الحيوانات المختبرية. وتمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل IACUC في كلية ويل كورنيل الطبية.

1. إعداد الأنسجة

  1. الموت ببطء الإناث توقيت الحمل خلع عنق الرحم 15. تشريح الجنينية E16 - E18 الأجنة من الإناث توقيت الحمل والأجنة مكان فردي في الآبار من صحن 6 جيدا، مليئة المالحة الفوسفات البارد مخزنة (PBS).
  2. شطف الأجنة في برنامج تلفزيوني الباردة.
  3. إزالة جزء صغير من الغشاء الذي يحيط بالجنين من الجنين ووضعه في حل بروتين K معدة سلفا لالتنميط الجيني لاحق. بدلا من ذلك، في حالة فقدان الغشاء الذي يحيط بالجنين، وإزالة جزء صغير من طرف الذيل الجنين ووضعه في بروتين K الحل
  4. كزة ثقوب في الجلد في جميع أنحاء الجنين باستخدام دبابيس الحشرات (100 لكل جانب على الأقل).
  5. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة ببطء الطازجة بارافورمالدهيد 2٪ (PFA)،الرقم الهيدروجيني 7.4، إلى البئر.
  6. يهز بلطف لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
  7. شطف الأجنة مرتين في برنامج تلفزيوني وتخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى تلطيخ.

2. التنميط الجيني

  1. تزج الأغشية الذي يحيط بالجنين أو ذيول الجنين في بروتين K الخليط وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. احتضان عند 56 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. استخراج الحمض النووي باستخدام المتاحة تجاريا طقم تنقية الحمض النووي.
  4. خذ 0.5 ميكرولتر من إجمالي 200 ميكرولتر تنقيته حل الحمض النووي الجيني، والجمع بين ذلك مع 0.5 ميكرولتر من كل من الإحساس والعقاقير الاشعال الجينات المحددة (10 ميكرومتر)، 2 ميكرولتر dNTP ميكس (2.5 ملم من dATP، dCTP، dGTP وdTTP) ، 0.2 ميكرولتر بوليميريز طق (5 U / ميكرولتر) و 2 ميكرولتر PCR عازلة (10X)، إضافة H 2 O إلى الحجم الكلي لل20 ميكرولتر.
    ملاحظة: تسلسل التمهيدي هي كما يلي (الجدول 1):
    TrkA: TrkA_F: GCG GGC دول مجلس التعاون الخليجي GCC GCG ATG، TrkA_R: غا دول مجلس التعاون الخليجي TGC دول مجلس التعاون الخليجي GCG GCT CTG CCA GGG TG. PCR سفر و السياحةطول منة: 400 basepairs (بي بي).
    باكس: In5R: GTT GAC CAG AGT GGC GTA GG، Ex5F: TGA TCA غا CCA TCA TG، NeoR: CCG CTT CCA TTG CTC AGC GG. PCR أطوال شظية: النوع البري، 304 سنة مضت. باكس اغية، 507 سنة مضت.
    TauLacZ: lacZup: ACA ACG TCG TGA GTG GGA AAA، lacZdown: ATC AAC ATT AAA TGT GAG CGA G. PCR طول القطعة: 360 نقطة أساس.
  5. تشغيل PCR مع البرنامج التالي للTrkA: خطوة 1: 1 دقيقة في 95 ° C، خطوة 2: 10 ثانية في 95 درجة مئوية، الخطوة 3: 20 ثانية عند 68 ° C، الخطوة 4: 30 ثانية عند 72 ° C. كرر الخطوات من 2 - 4 لصالح 40 دورة.
    1. لLacZ وباكس، تشغيل PCR مع البرنامج التالي: خطوة 1: 1 دقيقة في 95 ° C، خطوة 2: 10 ثانية في 95 درجة مئوية، الخطوة 3: 1 دقيقة في 54 ° C، الخطوة 4: 1 دقيقة في 72 ° C، كرر الخطوات من 2 - 4 لصالح 35 دورات.
  6. عينات تشغيل PCR على هلام الاغاروز 2٪ عند 100 V في المخزن 1X تريس، خلات-EDTA لمدة 20 دقيقة مع حارة من سلم DNA لتقييم أطوال شظية.
  7. تحليل الأجنة لوجود نوع البرية TrkA، TRKA-tauLacZ وباكس الأليلات فارغة. التراكيب الوراثية للأجنة التجريبية هي TrkA taulacZ / WT: باكس - / - وTrkA taulacZ / taulacZ: باكس - / -، اعتمادا على الأسئلة التجريبية. سوف الأجنة التي تفتقر إلى مراسل tauLacZ تكون سلبية لمحواري تلطيخ، وبالتالي يمكن أن تخدم ضوابط السلبية لمعايرة عملية تلطيخ.

3. الأجنة تلطيخ

  1. استخدام مجموعة تجارية لتلطيخ lacZ مع بعض التعديلات كما هو موضح أدناه في أقسام 3،2-3،8. هنا، استخدام عدة ميليبور.
  2. تزج الأجنة في الواق A لا يقل عن 1 ساعة، والهز برفق في درجة حرارة الغرفة.
  3. تزج مباشرة الأجنة في B الاحتياطي لمدة 15 دقيقة على الأقل، والهز برفق في درجة حرارة الغرفة.
  4. بينما الأجنة في الواق A / B، قبل دافئ حل الأنسجة قاعدة عند 37 درجة مئوية. استخدام 5 مل من محلول الأنسجة قاعدة في الجنين.
  5. بينما الأجنة في الواق A / B، وإعداد الطازجة 5 رomo- 4- اللون الأخضر 3- indolyl α-D-galactopyranoside (X-غال) بتركيز 40 ملغ / مل في 100٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
  6. تمييع X-غال في حل الأنسجة قاعدة قبل تحسنت بتركيز 1 ملغ / مل وإضافة 5 مل من X-غال / الأنسجة خليط قاعدة لقارورة زجاجية التلألؤ.
  7. نقل الأجنة إلى قارورة زجاجية تحتوي على التلألؤ X-غال / الأنسجة خليط قاعدة. ختم غطاء مع بارافيلم واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل، والتحقق من وجود وصمة عار الزرقاء.
  8. الأجنة بوستفيكس مع طازجة 4٪ PFA، ودرجة الحموضة 7.4. يهز بلطف لمدة 4 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  9. شطف الأجنة مرتين في برنامج تلفزيوني الباردة.

4. الأنسجة الجفاف والمقاصة

  1. مكان الأجنة في 50٪ الميثانول / 50٪ PBS الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والهز في قوارير زجاجية.
  2. مواصلة يذوى في 75٪ الميثانول PBS / 25٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والهز في قوارير الزجاج.
  3. مواصلة يذوى في 90٪ الميثانول / 10٪ PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والهز في قوارير الزجاج.
  4. مواصلة يذوى في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 30 دقيقة (2X) في درجة حرارة الغرفة، والهز في قوارير الزجاج.
  5. بينما الأجنة والتجفيف، وإعداد 1: 1 (ت: ت) خليط من الكحول بيروكسايد وبيروكسايد بنزوات.
    ملاحظة: الكحول البنزويل بيروكسايد بنزوات وسامة.
  6. تزج الأجنة في 1: 1 (ت: ت) خليط من الميثانول بنسبة 100٪: BABB 100٪ لمدة 15 دقيقة. فقط استخدام الزجاج لأن BABB سوف تذوب البلاستيك.
  7. تزج الأجنة في 100٪ BABB لواضحة تماما في الأنسجة وتصور X-غال تلطيخ في الجنين مسح.
    ملاحظة: صورة في أقرب وقت ممكن لأن وصمة عار X-غال سوف تتلاشى مع مرور الوقت.

5. الجامع جبل التصوير

  1. استقرار الجنين، منغمسين في 100٪ BABB، في الزوايا المناسبة للتصوير باستخدام ملقط معدني. إلقاء الضوء باستخدام مزيج من يصل الضوء وتحت ضوء ضوء المصادر.
  2. الحصول على صور مع المجهر تشريحتجهيزه مع كاميرا رقمية. خذ متعددة التعرض الحقل مشرق في خمس طائرات التنسيق متتالية 0.5 مم وبصرف النظر على طول محور Z. قد تختلف الأوقات التعرض وتوقف F-وفقا لإضاءة وكاميرا المواصفات وتحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل الإعداد.
  3. استخدام معيار برامج معالجة الصور لمعالجة الصور تراكب وتوليد الصور المركبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

التراكيب الوراثية من TrkA WT / taulacZ: باكس - / - وTrkA taulacZ / taulacZ: باكس - / - الأجنة يمكن تحديد بشكل لا لبس فيه من قبل ستاندرد PCR التنميط الجيني (الشكل 1). يعرض تلطيخ X-غال بالتفصيل العرش محور عصبي المحيطية تحت الجلد في الأجنة الملون تقليدية (أرقام 2، 3A)، وطوال الجنين بعد تطهير الأنسجة (أرقام 3B، 4).

لقد ولدت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الإجراء المبين أعلاه تلطيخ X-غال من الفئران الجنينية TrkA taulacZ يسمح لتصور سريع ومفصل من التوقعات محور عصبي لمسافات طويلة في الجنين ثابتة على حالها. بسبب الخلفية فارغة باكس هذه الفئران تسمح للتحقق من الإشارات الآليات التي يمكن أن تسهم في نمو كل من محور عصبي وبقاء الخلايا العصبية. التزاوج مع المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب الفئران التي تهم يسمح لتقييم شامل من الظواهر محور عصبي ويمكن أن تكون دليلا مفيدا بالنسبة للتجارب المستقبلية لدراسة الإشارات النمو م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور لويس Reichardt للفئران TrkA taulacZ والدكتور أنيت ماركوس للمناقشة والاقتراحات الثاقبة. وأيد هذا العمل من جانب صناديق بدء التشغيل من مؤسسة بيرك وكذلك مؤسسة وايت هول منحة بحثية 2010-08-61، منحة بحثية من أجنحة لمؤسسة الحياة (WFL-US-028/14)، منح ZB1-1102-1 من كريستوفر ودانا ريف مؤسسة، والمنح 1R01EY022409 و3R01EY022409-01S1 من المعهد الوطني للعيون، لJZ. عمليات الخفجي المشتركة هو زميل جولدسميث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
PFASigma-AldrichP6418
PBSLife Tech10010-023
محلول شطف المناديل AMilliporeBG-6-B
شطف الأنسجة BMilliporeBG-7-B
قاعدة بقع الأنسجةMilliporeBG-8-C
X-galSigma-AldrichB4252
قارورة زجاجية ومضادةKimble Chase74500-20
حاضنةLablineModel 120
دبابيس حشراتFST26000-30
DMSOSigma-AldrichD8418
طبق 6 آبارالولايات المتحدة الأمريكية ScientificCC7672-7506
بادئاتIDTبادئات
تاكارا خليط dNTPتاكارا4030
تاكارا لوس أنجلوس عازلةتاكاراRR002A
تاكارا LATaq تاكاراRR002A
جهاز PCRBio-Radمحرك الحمض النووي ثنائي
كحول البنزيلسيجما ألدريتشB-1042
بنزوات البنزيلسيجما ألدريتشB-6630
تشريح المجهرLeicaM205A
كاميراLeicaDFC310FX
حلقة ضوءLeica MEB110
فوتوشوبأدوبيفوتوشوب 4.0
محلول محلول الحمض النووي المخصصة

المراجع

  1. Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
  2. Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents with complex regional pain syndromes. Pain. 131, 153-161 (2007).
  3. Uceyler, N., et al. Small fibers in Fabry disease: baseline and follow-up data under enzyme replacement therapy. J Peripher Nerv Syst. 16, 304-314 (2011).
  4. Reichardt, L. F., Mobley, W. C. Going the distance, or not, with neurotrophin signals. Cell. 118, 141-143 (2004).
  5. White, F. A., et al. Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root ganglia. J Neurosci. 16, 4662-4672 (1996).
  6. Farinas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., Patapoutian, A. Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia: direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron. 21, 325-334 (1998).
  7. Markus, A., Zhong, J., Snider, W. D. Raf and akt mediate distinct aspects of sensory axon growth. Neuron. 35, 65-76 (2002).
  8. Kuruvilla, R., et al. A neurotrophin signaling cascade coordinates sympathetic neuron development through differential control of TrkA trafficking and retrograde signaling. Cell. 118, 243-255 (2004).
  9. Zhong, J., et al. Raf kinase signaling functions in sensory neuron differentiation and axon growth in vivo. Nature. 10, 598-607 (2007).
  10. Bulfone, A., et al. An olfactory sensory map develops in the absence of normal projection neurons or GABAergic interneurons. Neuron. 21, 1273-1282 (1998).
  11. Moqrich, A., et al. Expressing TrkC from the TrkA locus causes a subset of dorsal root ganglia neurons to switch fate. Nature. 7, 812-818 (2004).
  12. Knudson, C. M., Tung, K. S., Tourtellotte, W. G., Brown, G. A., Korsmeyer, S. J. Bax-deficient mice with lymphoid hyperplasia and male germ cell death. Science. 270 (5233), 96-99 (1995).
  13. Lentz, S. I., Knudson, C. M., Korsmeyer, S. J., Snider, W. D. Neurotrophins support the development of diverse sensory axon morphologies. J. Neurosci. 19, 1038-1048 (1999).
  14. Patel, T. D., Jackman, A., Rice, F. L., Kucera, J., Snider, W. D. Development of sensory neurons in the absence of NGF/TrkA signaling in vivo. Neuron. 25, 345-357 (2000).
  15. Donovan, K. J., et al. B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS. The Journal of experimental medicine. 211, 801-814 (2014).
  16. Mercer, K., et al. Expression of endogenous oncogenic V600EB-raf induces proliferation and developmental defects in mice and transformation of primary fibroblasts. Cancer research. 65, 11493-11500 (2005).
  17. Tronche, F., et al. Disruption of the glucocorticoid receptor gene in the nervous system results in reduced anxiety. Nature genetics. 23, 99-103 (1999).
  18. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  19. Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  20. Schmidt, H., Rathjen, F. G. DiI-labeling of DRG neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. , (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

العصبونات الموجبة لـ TrkAمراسل Tau LacZخلفية Bax Nullتصفية الأنسجةمحلول BABBصبغ ALSبروتوكول التنميط الجيني
كله جبل التصوير من جنين فأر التوقعات الحسية أكسون
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.