كله جبل التصوير من جنين فأر التوقعات الحسية أكسون

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا محسنا للنمط الجيني وتلميث الفئران الجنينية وتلطيخها وإعدادها لتصوير الإسقاطات العصبية المحيطية لمستقبلات الألم في بأكمله ، كطريقة فعالة لتقييم الأنماط الظاهرية لنمو المحور العصبي الحسي في تطوير الفئران المعدلة وراثيا.

الملخص

تصور كامل طول التوقعات العصبية في الأجنة أمر ضروري للحصول على فهم كيفية تطور الثدييات الشبكات العصبية. نحن هنا تصف طريقة لتسمية في الموقع مجموعة فرعية من عقدة الجذر الظهري (DRG) التوقعات محور عصبي لتقييم خصائصها المظهرية باستخدام عدة خطوط الماوس التلاعب بها وراثيا. الخلايا العصبية-TrkA الإيجابية هي الخلايا العصبية مستقبلة الأذية، مخصصة لنقل إشارات الألم. نحن نستخدم خط الماوس TrkA ^taulacZ لتسمية مسارات كافة محاور الطرفية-TrkA إيجابي في جنين الفأر سليمة. نحن أبعد تولد خط TrkA ^taulacZ على خلفية فارغة باكس، الذي يلغي أساسا موت الخلايا المبرمج العصبية، من أجل تقييم الأسئلة المتعلقة النمو بشكل مستقل عن الآثار المحتملة للالتلاعب الجيني على بقاء الخلايا العصبية. وفي وقت لاحق، هي ولدت الفئران المعدلة وراثيا في المصالح مع TrkA ^taulACZ / باكس خط باطل ونحن على استعداد لدراسة باستخدام التقنيات الموصوفة هنا ثم. ويشمل هذا العرض معلومات مفصلة عن خطط تربية الماوس، التنميط الجيني في وقت تشريح، وإعداد الأنسجة، وتلطيخ والمقاصة للسماح لرؤية كامل طول مسارات محور عصبي في إعداد كامل جبل.

المقدمة

إنشاء شبكات الخلايا العصبية الدقيقة هي عملية التنموية المعقدة ضرورية لوظائف الجهاز العصبي. اضطراب في هذه العملية يؤدي إلى اختلال الوظائف العصبية التي تورطت في الأمراض العصبية الإنسان ^1-3. لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء نمو محور عصبي وتعصيب المستهدفة في الثدييات، وقد وضعنا بروتوكولا لتصور مسارات محور عصبي من TrkA، معربا عن الخلايا العصبية الحسية باستخدام مزيج من اثنين من خطوط الماوس المعدلة وراثيا.

TrkA هو مستقبلات لعامل نمو الأعصاب NGF، وهو علامة وظيفية من الخلايا العصبية الحسية مسبب للألم ^4. وأعرب عن TrkA غاية في الخلايا العصبية مس....

البروتوكول

ملاحظة: جميع إجراءات تتوافق مع دليل المعاهد الوطنية للصحة لاستخدام ورعاية الحيوانات المختبرية. وتمت الموافقة على بروتوكول الحيوان من قبل IACUC في كلية ويل كورنيل الطبية.

1. إعداد الأنسجة

1. الموت ببطء الإناث توقيت الحمل خلع عنق الرحم ^15. تشريح الجنينية E16 - E18 الأجنة من الإناث توقيت الحمل والأجنة مكان فردي في الآبار من صحن 6 جيدا، مليئة المالحة الفوسفات البارد مخزنة (PBS).
2. شطف الأجنة في برنامج تلفزيوني الباردة. ....

النتائج

التراكيب الوراثية من TrkA ^{WT / taulacZ:} باكس ^{- / -} وTrkA ^{taulacZ / taulacZ:} باكس ^{- / -} الأجنة يمكن تحديد بشكل لا لبس فيه من قبل ستاندرد PCR التنميط الجيني (الشكل 1). يعرض تلطيخ X-غال بالتفصيل العرش محور عصبي المحيطية تحت الجلد في الأجنة الملون تقليدية (أرقام 2، 3A)، وطوال الجنين بعد تطهير الأنسجة (أرقام 3B، 4).

لقد ولدت.......

المناقشة

الإجراء المبين أعلاه تلطيخ X-غال من الفئران الجنينية TrkA ^taulacZ يسمح لتصور سريع ومفصل من التوقعات محور عصبي لمسافات طويلة في الجنين ثابتة على حالها. بسبب الخلفية فارغة باكس هذه الفئران تسمح للتحقق من الإشارات الآليات التي يمكن أن تسهم في نمو كل من محور عصبي وبقاء الخلايا العصبية. التزاوج مع المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب الفئران التي تهم يسمح لتقييم شامل من الظواهر محور عصبي ويمكن أن تكون دليلا مفيدا بالنسبة للتجارب المستقبلية لدراسة الإشارات النمو م.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
PFA	Sigma-Aldrich	P6418
PBS	Life Tech	10010-023
محلول شطف المناديل A	Millipore	BG-6-B
شطف الأنسجة B	Millipore	BG-7-B
قاعدة بقع الأنسجة	Millipore	BG-8-C
X-gal	Sigma-Aldrich	B4252
قارورة زجاجية ومضادة	Kimble Chase	74500-20
حاضنة	Labline	Model 120
دبابيس حشرات	FST	26000-30
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
طبق 6 آبار	الولايات المتحدة الأمريكية Scientific	CC7672-7506
بادئات	IDT	بادئات
تاكارا خليط dNTP	تاكارا	4030
تاكارا لوس أنجلوس عازلة	تاكارا	RR002A
تاكارا LA	Taq تاكارا	RR002A
جهاز PCR	Bio-Rad	محرك الحمض النووي ثنائي
كحول البنزيل	سيجما ألدريتش	B-1042
بنزوات البنزيل	سيجما ألدريتش	B-6630
تشريح المجهر	Leica	M205A
كاميرا	Leica	DFC310FX
حلقة ضوء	Leica	MEB110
فوتوشوب	أدوبي	فوتوشوب 4.0

محلول محلول الحمض النووي المخصصة