نصف وسيلة لقياس قدرة انتشار الرئة بسرعة وبساطة في الفئران ونظهر أنها حساسة بما فيه الكفاية لتغيرات النمط الظاهري في أمراض الرئة الشائعة المتعددة. وبالتالي ، فإن هذا المقياس يجلب أهمية انتقالية مباشرة لنماذج الفأر ، حيث يمكن أيضا قياس قدرة الانتشار بسهولة في البشر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Phenotyping ماوس الرئوي وظيفة في فيفو مع قدرة الرئة نشرها
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الفأر هو الآن الحيوان الأولية المستخدمة في تصميم نموذج لمجموعة متنوعة من أمراض الرئة. لدراسة الآليات التي تكمن وراء مثل هذه الأمراض، وهناك حاجة إلى أساليب المظهرية التي يمكن قياس تغيرات مرضية. وعلاوة على ذلك، لتوفير صلة متعدية إلى نماذج الماوس، وينبغي أن تكون هذه القياسات الاختبارات التي يمكن بسهولة أن يتم ذلك في كل من البشر والفئران. لسوء الحظ، في الأدب الحالي القليلة القياسات المظهرية وظائف الرئة لدى التطبيق المباشر للبشر. الاستثناء الوحيد هو القدرة نشرها لأول أكسيد الكربون، وهو القياس الذي يتم بشكل روتيني في البشر. في هذا التقرير، وصفنا وسيلة بسرعة وببساطة لقياس هذه القدرة نشرها في الفئران. ويشمل الإجراء التضخم الرئة وجيزة مع الغازات التتبع في الماوس تخدير، تليها 1 دقيقة وقت تحليل الغاز. لقد اختبرنا قدرة هذه الطريقة للكشف عن عدة أمراض الرئة، بما في ذلك انتفاخ الرئة والتليف، إصابة الرئة الحادة، والإنفلونزا، والتهابات الرئة الفطرية، فضلا عن رصد نضوج الرئة في الجراء الصغار. أظهرت النتائج انخفاض كبير في جميع أمراض الرئة، وكذلك زيادة في القدرة نشرها مع نضوج الرئة. هذا القياس من الرئة نشرها قدرة بالتالي يوفر اختبار وظيفة الرئة التي لديها تطبيق واسع النطاق مع قدرتها على اكتشاف التغيرات الهيكلية المظهرية مع معظم النماذج الرئة المرضية الموجودة.
المقدمة
الفأر هو الآن الحيوان الأولية المستخدمة في تصميم نموذج لمجموعة متنوعة من أمراض الرئة. لدراسة آليات تشكل أساس هذه الأمراض، وهناك حاجة إلى أساليب المظهرية التي يمكن قياس ذلك التغيرات المرضية. على الرغم من أن هناك العديد من الدراسات الماوس حيث يتم قياس الميكانيكا والتهوية، وهذه القياسات هي عموما لا علاقة لها التقييمات القياسية من وظائف الرئة يتم عادة في الجسم البشري. وهذا أمر مؤسف، لأن القدرة على أداء قياسات تعادل في الفئران والموضوعات الإنسان قد تسهيل ترجمة نتائج في نماذج الماوس إلى الأمراض التي تصيب البشر.
واحدة من القياسات الأكثر شيوعا وأدلى بسهولة في المواد البشرية هو القدرة نشرها لأول أكسيد الكربون (DLCO) 1،2، ولكن نادرا ما تم القيام به هذا القياس في نماذج الماوس. في تلك الدراسات حيث أفيد 3-7، لم تكن هناك أي دراسات المتابعة، وذلك جزئيا بسبب الإجراءات غالبا ما تكون مرهقة أو مساuire المعدات المعقدة. وثمة نهج آخر هو استخدام طريقة CO إعادة التنفس في نظام الدولة مطرد، والتي لديها ميزة كونها قادرة على قياس CO نشر في الفئران واعية. ولكن هذا الأسلوب هو مرهقة جدا، والنتائج يمكن أن تختلف مع مستوى التهوية الماوس، وكذلك O 2 وCO 2 تركيزات 8،9. ويبدو أن هذه الصعوبات قد تحول دون الاستخدام الروتيني للنشرها القدرة على كشف الأمراض الرئة في الفئران، على الرغم من عدة مزاياه.
للتحايل على مشاكل مع قياس نشرها القدرات في الفئران، وتفاصيل وسيلة بسيطة لقياس ذلك في الفئران تم الإبلاغ مؤخرا 10. الإجراء يلغي المشكلة الصعبة المتمثلة في أخذ عينات الغاز السنخية غير ملوثة من قبل بسرعة أخذ عينات من حجم مساو للغاز وحي بأكمله. ويؤدي هذا الإجراء في قياس استنساخه للغاية، وصفه عامل نشر لأول أكسيد الكربون (DFCO)، التي تعتبر حساسة لمجموعة من السلطة الفلسطينيةالتغييرات thologic في النمط الظاهري الرئة. وبالتالي، تقدر DFCO ك 1 - (CO 9 / CO ج) / (ني 9 / ني ج)، حيث ج و 9 السفلية تشير إلى تركيزات الغازات المعايرة حقن والغازات إزالتها بعد 9 ثانية عقد التنفس الوقت، على التوالي. DFCO هو متغير أبعاد، والتي تختلف بين 0 و 1، مع 1 يعكس امتصاص كامل لجميع CO، و0 لا تعكس أي امتصاص CO.
في هذا العرض وتبين لنا كيفية جعل هذا قياس قدرة نشرها، وكيف أنها يمكن أن تستخدم لتوثيق التغيرات في ما يقرب من جميع نماذج المرض الماوس الرئة الموجودة، بما في ذلك انتفاخ الرئة والتليف، إصابة الرئة الحادة، والعدوى الفيروسية والفطرية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوان من قبل لجنة جامعة رعاية الحيوان واستخدام جونز هوبكنز.
1. إعداد الحيوانية
- تحضير الفئران C57BL 6/6 السيطرة لقياس DFCO، من خلال التخدير لهم الكيتامين وزيلازين على النحو المبين في الخطوة 2.3 أدناه.
- إعداد كل من الفئران الأخرى مع أمراض الرئة المختلفة هو مبين في الجدول رقم 1 عن طريق استخدام نفس الإجراء لعناصر التحكم. وتوجد تفاصيل محددة اللازمة لإنشاء كل من هذه النماذج في المراجع ذات الصلة. السيطرة على الفئران وتلك الموجودة في الأفواج مرضية أخرى كلها أسابيع 6-12 من العمر.
2. قياس انتشار عامل لأول أكسيد الكربون (DFCO)
- إنشاء وحدة اللوني الغاز المتوفرة مع الجهاز لقياس قمم النيتروجين، والأكسجين، النيون، وأول أكسيد الكربون. لهذا الاستخدام والتطبيق فقط النيون وCO البيانات.
ملاحظة: يستخدم هذا الصك الصورة الجزيئيةالعمود ieve مع الهيليوم كما الغاز الناقل، مع 12.00 ميكرون الفيلم، 320.00 ID ميكرون و 10 متر طول. العمود اللوني لديه حجم 0.8 مل، ولكن كنا 2 مل لضمان المقاصة كافية من أنابيب يربط مع العينة. - في بداية كل يوم التجريبية، قبل اتخاذ قياسات للعينات من الفئران، وأخذ عينة 2 مل مباشرة من كيس خليط الغاز التي تحتوي على ما يقرب من 0.5٪ ني، و 0.5٪ CO، والتوازن الهواء، واستخدام هذه العينة لمعايرة واللوني الغاز.
- تخدير الفئران مع الكيتامين (90 ملغ / كلغ) وزيلازين (15 ملغ / كلغ)، وتأكيد التخدير بسبب عدم وجود حركة لا ارادي. تطبيق مرهم البيطرية على العيون لمنع جفاف. يفغر الرغامى الفئران مع قنية كعب إبرة (18 G في البالغين أو 20 G في الفئران الصغار جدا).
ملاحظة: يتم الانتهاء من DFCO في أقل من 10 دقيقة بعد التخدير وقبل أي التهوية الميكانيكية أو غيرها من الإجراءات. - في الفئران أكبر من 6 أسابيع من العمر، واستخدام 3 مل حقنة رس سحب 0.8 مل من الغاز من حقيبة خليط الغاز. ربط حقنة لقنية القصبة الهوائية وبسرعة تضخيم الرئة. باستخدام المسرع، عد 9 ثانية، ثم سرعان ما سحب 0.8 مل (هواء الزفير).
- تمييع هذا سحب 0.8 مل هواء الزفير إلى 2 مل مع هواء الغرفة، والسماح لها راحة لمدة لا تقل عن 15 ثانية. ثم حقن العينة كلها في الكروماتوجرافي الغاز للتحليل.
- في حين تحليل هذه العينة DFCO الأولى، وتضخيم الرئة الماوس مع الثانية 0.8 مل من الكيس خليط الغاز، ومن ثم معالجة هذه العينة مطابقة للعينة الأولى. متوسط اثنين من القياسات DFCO.
ملاحظة: للحصول على القياسات في الفئران الشابة مثل 2 أسابيع من العمر، واستخدام حجم 0.4 مل، منذ 0.8 مل كبير جدا وبلغ حجم التداول لجعل القياسات في الرئتين من الفئران الصغار جدا. فمن الأفضل استخدام حجم 0.8 مل بالنسبة للفئران التي يزيد عمرها عن 6 أسابيع، وأنه إذا كانت هناك حاجة حجم 0.4 مل لبعض الفئران، فإنه ينبغي أن تستخدم باستمرار لجميع الفئران في المجموعة التي تجري دراستها. - حساب DFCOك 1 - (CO 9 / CO ج) / (ني 9 / ني ج)، حيث تشير ج و 9 السفلية لتركيزات الغازات المعايرة حقن والغازات إزالتها بعد 9 ثانية عقد التنفس الوقت، على التوالي.
- تحليل ومقارنة الاختلافات مع ANOVA في اتجاه واحد وتقييم مستوى الدلالة مع تصحيح توكي للمقارنات متعددة في جميع الفئران الفوج. تنظر ف <0.05 قيمة كبيرة كما.
ملاحظة: وكانت جميع الفئران المستخدمة هنا جزء من الدراسات التجريبية التي تنطوي على عدة قياسات لاحقة للتهوية الرئة، والميكانيكا، وغسل الرئة، أو الأنسجة، والتي لا يتم الإبلاغ عن هنا. وبالإضافة إلى ذلك، منذ الأسلوب هو نفسه في جميع النماذج التجريبية كما حدث أعلاه في السيطرة على الفئران، يتم عرض فقط النتائج من مختلف النماذج المرضية. يتم تقديم مزيد من المعلومات عن هذه النماذج في الجدول التكميلي. - الموت ببطء الحيوانات anesthe العميقجرعة زائدة من التشنج تليها خلع عنق الرحم أو قطع الرأس. حيث تدعو الحاجة، وإزالة الخلايا و / أو أنسجة الرئة من الفئران الميتة للحصول على مزيد البيولوجية أو المعالجة نسيجية والتحليل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 1 القياسات DFCO من الفئران الكبار في مجموعات A، B، C، D، E، وF. كان هناك انخفاض كبير مع كل من عدوى الرشاشيات والإنفلونزا، وكذلك انخفاض كبير في متليف، نفاخي، وحادة نماذج إصابة الرئة. ويبين الشكل 2 التغيرات التنموية المجموعة G في DFCO بمرور الوقت مع عمر الفئران 2-6 أسابيع. كانت هناك زيادة طفيفة ولكنها هامة مع نمو الرئة خلال هذه الدورة الوقت. وكان أثر استخدام حجم التضخم أصغر أيضا واضح جدا في نقطة زمنية 6 أسابيع. كان هناك اتجاه للإناث لديه...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في العمل الحالي، حددنا مقياس جديد لقياس القدرة الغاز تبادل في الرئة الماوس. هذا المقياس هو مماثل لقدرات نشرها، وقياس السريري المشترك الذي يقيس الوظيفة الأساسية في الرئة، وهذا هو، قدرته على تبادل الغاز. القدرة نشرها هو الوحيد قياس وظيفية الرئة التي يمكن بسهولة وسرعة القيام به في كل من الفئران والبشر. للكشف عن أمراض الرئة في الفئران، وهو الهدف الرئيسي هو لقياس التغيرات في وظائف الرئة بين السيطرة والأفواج التجريبية. لتحقيق هذا الهدف، قمنا محددة والاستفادة من DFCO لإثبات قدرتها على qu...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
أي تضارب في المصالح، ولا شيء في الكشف عنها.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل بواسطة NIH HL-10342
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كروماتوجراف الغاز | Inficon | Micro GC موديل 3000A | Agilent يصنع نموذجا مشابها |
| 18 G Luer إبرة كعب | Becton Dickenson | العديد من البائعين المحتملين الآخرين حقنة | |
| بلاستيكية 3 مل | Becton Dickenson | العديد من البائعين المحتملين الآخرين | |
| أكياس عينة غاز البولي بروبلين | SKC | 1 أو 2 لتر تعمل بشكل جيد | ستعمل الأكياس الضيقة للغاز الأخرى بشكل جيد |
| خزان غاز ، 0.3٪ Ne ، 0.3٪ ثاني أكسيد الكربون ، توازن الهواء ؛ (مقاس ME) | Airgas، Inc | Z04 NI785ME3012 | هذا هو الخليط القياسي المستخدم ل DLCO في البشر |
| 25 TCID50 / فأر من فيروس الأنفلونزا A / PR8 المخفف في محلول ملحي مخزن بالفوسفات. | |||
| الإيلاستاز البنكرياس الخنزير | ، أوينسفيل ، ميزوري | 5.4 U | |
| Bleomycin | APP Pharmaceuticals ، Schaumburg ، IL | 0.25 U | |
| الإشريكية القولونية < / م > LPS | Sigma L2880 | 3 & mu ؛ جم / جم وزن الجسم O55: B5< | |
| i>Aspergillus fumigatus < / i> (عزل Af293) تم جمع كونيديا من المستعمرات الناضجة المزروعة على أجار سكر العنب البطاطس. |
المراجع
- Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide. J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).
- Miller, A., Warshaw, R., Nezamis, J. Diffusing capacity and forced vital capacity in 5,003 asbestos-exposed workers: Relationships to interstitial fibrosis (ILO profusion score) and pleural thickening. Am J Ind Med. 56 (12), 1383-1393 (2013).
- Enelow, R. I., et al. Structural and functional consequences of alveolar cell recognition by CD8(+) T lymphocytes in experimental lung disease. J Clin Invest. 102 (9), 1653-1661 (1998).
- Hartsfield, C. L., Lipke, D., Lai, Y. L., Cohen, D. A., Gillespie, M. N. Pulmonary mechanical and immunologic dysfunction in a murine model of AIDS. Am J Physiol. 272 (4 Pt 1), 699-706 (1997).
- Wegner, C. D., et al. Intercellular adhesion molecule-1 contributes to pulmonary oxygen toxicity in mice: role of leukocytes revised. Lung. 170 (5), 267-279 (1992).
- Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
- Sabo, J. P., Kimmel, E. C., Diamond, L. Effects of the Clara cell toxin, 4-ipomeanol, on pulmonary function in rats. J Appl Physiol. 54 (2), 337-344 (1983).
- Depledge, M. H. Respiration and lung function in the mouse, Mus musculus (with a note on mass exponents and respiratory variables). Respir Physiol. 60 (1), 83-94 (1985).
- Depledge, M. H., Collis, C. H., Barrett, A. A technique for measuring carbon monoxide uptake in mice. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 7 (4), 485-489 (1981).
- Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung. J Appl Physiol. 110 (5), 1455-1459 (2011).
- Chaudhary, N., Datta, K., Askin, F. B., Staab, J. F., Marr, K. A. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator regulates epithelial cell response to Aspergillus and resultant pulmonary inflammation. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 301-310 (2012).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90 (3), 1111-1117 (2001).
- Yildirim, A. O., et al. Palifermin induces alveolar maintenance programs in emphysematous mice. Am J Respir Crit Care Med. 181 (7), 705-717 (2010).
- Collins, S. L., Chan-Li, Y., Hallowell, R. W., Powell, J. D., Horton, M. R. Pulmonary vaccination as a novel treatment for lung fibrosis. PLoS One. 7 (2), e31299(2012).
- Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. J Clin Invest. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Martinez, F. J., et al. The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Intern Med. 142 (12 Pt 1), 963-967 (2005).
- Zhou, L., et al. Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR. Science. 266 (5191), 1705-1708 (1994).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
