مقالة منهجية

ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

DOI:

10.3791/52260

⸱

يناير 12, 2015

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, College of Medicine, 2Laboratory of Cochlear Development, NIDCD, NIH

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم طريقة تصف عزل واستزراع استنخاذ القوقعة الصناعية من الأذن الداخلية للفأر الجنينية. نوضح أيضا طريقة لنقل الجينات إلى مستخلصات القوقعة الصناعية عبر التثقيب الكهربائي ذو الموجة المربعة. تمكن ثقافة الزرع في المختبر إلى جانب تقنية نقل الجينات الباحثين من دراسة تأثيرات تغيير التعبير الجيني أثناء التطوير.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكتشف خلايا الشعر السمعية الموجودة داخل عضو الفأر في كورتي المعلومات الصوتية وتنقلها إلى الجهاز العصبي المركزي. تتم محاذاة خلايا الشعر الحسية الميكانيكية في صف واحد من خلايا الشعر الداخلية وثلاثة صفوف من خلايا الشعر الخارجية التي تمتد على طول المحور القاعدي إلى القمي للقوقعة. توفر تقنية زراعة الزرع الموضحة هنا طريقة فعالة لعزل وصيانة استخلاص القوقعة الصناعية من الأذن الداخلية للفأر الجنينية. أيضا ، فإن التشكل والخصائص الجزيئية لخلايا الشعر الحسية والخلايا الداعمة غير الحسية داخل مزارع القوقعة الصناعية تشبه تلك التي لوحظت في الجسم الحي ويمكن دراستها في بيئتها الخلوية الجوهرية. يمكن أن تعمل نباتات القوقعة الصناعية كأدوات تجريبية مهمة لتحديد وتوصيف المسارات الجزيئية والوراثية التي تشارك في المواصفات والنقوش الخلوية. على الرغم من أن نماذج الفئران المعدلة وراثيا توفر نهجا فعالا لدراسات التعبير الجيني ، إلا أن عددا كبيرا من طفرات الفئران تموت أثناء التطور الجنيني مما يعيق تحليل وتفسير الأنماط الظاهرية التنموية. يمكن استزراع عضو كورتي من الفئران الطافرة التي تموت قبل الولادة بحيث يمكن تحليل تطورها في المختبر واستجاباتها لعوامل مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، نصف تقنية للتغذية الكهربائية لنباتات القوقعة الصناعية الجنينية خارج الجسم الحي والتي يمكن استخدامها لتقليل تنظيم أو الإفراط في التعبير عن جين (جينات) معينة وتحليل وظيفتها الداخلية المحتملة واختبار ما إذا كان منتج جيني معين ضروريا أو كافيا في سياق معين للتأثير على تطور قوقعة الأذن للثدييات1-8.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون عضو الثدييات في كورتي من فسيفساء من أنواع الخلايا المتخصصة ، بما في ذلك نوعان من خلايا الشعر الحسية الميكانيكية بالإضافة إلى أربعة أنواع على الأقل من الخلايا الداعمة غير الحسية مما يجعله نظاما نموذجيا مثاليا لدراسة العمليات الخلوية الطبيعية مثل التكاثر ومواصفات المصير والتمايز والنمذجة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التطور الطبيعي لهذه الأنواع المختلفة من الخلايا ضروري لوظيفة السمع الطبيعية. وبالتالي ، من الأهمية بمكان فهم العوامل ، الجزيئية والخلوية ، التي تنظم تطورها. ومع ذلك ، فإن صغر حجم قوقعة الفأر بالإضافة إلى عدم إمكانية الوصول إليها يشكل تحديا خاصا لدراسات التعبير الجيني. علاوة على ذلك ، تحدث معظم مواصفات مصير الخلية وأحداث الزخرفة خلال الفترات الزمنية الجنينية وتكتمل في الغالب قبل الولادة. لذلك ، يعد تحديد وتوصيف أحداث الإشارات خلال الفترات الزمنية الجنينية أمرا ضروريا لاكتساب نظرة ثاقبة للأساس الجزيئي لتشكل القوقعة.

هنا ، نوضح طريقة لزراعة القوقعة السليمة في المختبر من الأذنين الداخلية للفأر الجنينية. الأساس المنطقي وراء استخدام هذه التقنية هو أن القوقعة المستزرعة تحافظ على خصائصها الجزيئية والمورفولوجية وبالتالي توفر نموذجا قيما للتحقيق في الجينات المرشحة المحتملة واستكشاف الآليات التي ينطوي عليها تكوين القوقعة. على الرغم من أنه يمكن استخدام الفئران المعدلة وراثيا لدراسات التعبير الجيني ، إلا أنه غالبا ما تكون هناك حاجة إلى نظام في المختبر لمراقبة وظائف جينية معينة. علاوة على ذلك ، يمكن إنشاء مزارع القوقعة الصناعية من أجنة الفئران المعدلة وراثيا بحيث يمكن دراسة تطورها في المختبر واستجابتها لمختلف العوامل القابلة للذوبان والخصوم. على الرغم من استخدام الأجنة في اليوم 13 (E13) في هذا البروتوكول ، إلا أن الثقافات من E12 أو E14 إلى الأذنين الداخلية المبكرة بعد الولادة يمكن أن تعطي نتائج مماثلة.

نقدم أيضا تقنية نقل الجينات في مستخلصات القوقعة الصناعية الجنينية المستنبتة باستخدام التثقيب الكهربائي بالموجة المربعة. بعد عزل مستخلصات القوقعة الصناعية ، يمكن استخدام التثقيب الكهربائي للتعبير عن بلازميدات الحمض النووي للجينات (الجينات) ذات الأهمية في الخلايا الفردية داخل قناة القوقعة. تعمل هذه التقنية كنهج تكميلي للدراسات التي تستخدم الفئران المعدلة وراثيا لاكتساب نظرة ثاقبة على المسارات الجزيئية الكامنة وراء النمط الظاهري الخلوي. باستخدام طريقة نقل الجينات هذه ، يتم نقل مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الظهارية داخل القوقعة الجنينية ، مما يتيح تحليلات فقدان واكتساب الوظيفة على مستوى الخلية الواحدة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا إجراء دراسات الفيزيولوجيا الكهربية في مزارع القوقعة الصناعية8. هذه الطريقة للتثقيب الكهربائي في المختبر بسيطة ومباشرة نسبيا ، جنبا إلى جنب مع الحد الأدنى من الضرر الذي يلحق بالأنسجة ، وقد أدت إلى توسع سريع في هذه التقنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: جميع البروتوكولات باستخدام الحيوانات الحية ويجب مراجعتها والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية الحيوان (IACUC) ويجب أن تتبع وافقت رسميا الطرق لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. يجب أن يتم تنفيذ كافة تشريح باستخدام تقنية معقمة على مقاعد البدلاء نظيفة تدفق الصفحي. قفازات وقناع، إذا رغبت في ذلك، يجب أن ترتديه أثناء هذا الإجراء.

1. تشريح الأذن الداخلية الجنينية الماوس

  1. الإعداد للهيئة في الثقافات يزدرع كورتي:
    1. تعقيم تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة عن طريق تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة وتطهير السطح مع الايثانول 70٪ قبل استخدامها. وبالإضافة إلى ذلك، وتعقيم جميع الأدوات تشريح بما في ذلك أدوات تشريح الجميلة وأطباق Sylgard المغلفة للجنين عن طريق تشريح الأوتوكلاف أو عن طريق نقع في الايثانول 70٪ لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. تخلصي الايثانول 70٪ والسماح للأطباق وأدوات في الهواء الجاف في الصفحي نظيفة تدفق جزءا لا يتجزأ منن مقاعد البدلاء قبل استخدامها.
    2. تحضير محلول الملح المتوازن معقم هانك (HBSS) / (4- (2-هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic) (HEPES) خليط من خلال إضافة 10٪ من 10X HBSS و 0.5٪ HEPES وضبط درجة الحموضة إلى ما يقرب من 7.2 وفلتر تعقيم الحل النهائي وتخزينها في 4 ° C. تنفيذ جميع التشريح في برود حل HBSS / HEPES للحفاظ على أفضل الأنسجة في جميع أنحاء الداخلي.
    3. أطباق أسفل الزجاج معطف مع مصفوفة الغشاء القاعدي عن طريق إضافة 5 مل من البرد (4 ° C) العقيمة Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) إلى قسامة 300 ميكرولتر من المصفوفة الغشاء القاعدي في العقيمة 15 مل أنبوب البولي بروبلين. خلط قبل vortexing محتويات وإضافة 150 ميكرولتر من الغشاء القاعدي مصفوفة DMEM خليط من وسط كل صحن الثقافة بحيث يغطي ثقافة كاملة الحالية بشكل جيد في وسط الطبق. تغطية الأطباق وتخزينها في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
    4. صب 4-5 مل المبردة HBSS إلى عشرري أطباق بتري معقمة البوليسترين وترك مغلقة في غطاء محرك السيارة.
    5. إعداد مستنبت في أنبوب معقم 15 مل البولي بروبلين بإضافة 9 مل من DMEM، و 100 ميكرولتر من المكملات N2، 10 غرام / مل سيبرو و 1 مل من FBS.
  2. عزل الأجنة:
    ملاحظة: في هذا الإجراء لزراعة قوقعة إإكسبلنتس من الفئران الجنينية، الأذن الداخلية الحصاد من يوم الجنينية (E) 13 العظام الزمنية مع اليوم بعد الإخصاب التي تعتبر E1 9. ويمكن أيضا أن تستخدم بروتوكول مع الماوس الجنينية الأذن الداخلية ابتداء من E12 E18 ل.
    1. الموت ببطء ماوس توقيت الحوامل مع CO 2 والتضحية الحيوانية خلع عنق الرحم أو البروتوكولات المعتمدة المناسبة. تنفيذ euthanization بعيدا عن تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة للحفاظ على عقم في غرفة زراعة الأنسجة.
    2. ضع الماوس الموت الرحيم على منشفة ورقية مع البطن مواجهة وتطهير البطن مع الايثانول 70٪.
    3. فتح تجويف البطن عن طريق الجلد الاستيلاءمع ملقط المنحنية مع يد واحدة وقطع البشرة والعضلات على طول خط الوسط مع مقص باستخدام جهة أخرى. جعل اثنين من التخفيضات عمودي على كلا الجانبين، وسحب الرحم بعناية من قبل رافعين قرون الرحم الثنائية مع ملقط وسلخه من تحت النسيج الضام باستخدام مقص.
    4. وضع سلسلة الجنينية في طبق بتري تحتوي على حل المبردة تشريح (HBSS / HEPES خليط) ونقلها إلى الصفحي تدفق مقاعد البدلاء النظيفة.
    5. إزالة الأجنة بعناية من المشيمة ووضعها في واحدة من أطباق بتري معقمة تحتوي على حل تشريح. إذا كان هذا الحل يتحول الدموي، نقلها إلى طبق بتري جديد.
      ملاحظة: عند هذه النقطة والأجنة يمكن نظموا باستخدام دليل انطلاق تايلر.
    6. قطع رأس الأجنة عن طريق معسر في منطقة الرقبة مع زوج من ملقط نظيفة أو المقص ووضع رؤساء في طبق بيتري الطازجة التي تحتوي على حل تشريح المبردة.
  3. تشريح الأذن الداخلية:
    1. مكان سرئيس الجنين شمال شرق في طبق sylgard العقيمة التي تحتوي على تشريح البارد
    2. الحل. العمل تحت المجهر تشريح في التكبير من ~ 1.6X، لشل حركة رأس الجنين عن طريق وضع دبابيس Minutien حول أو أقرب إلى منطقة العين (الشكل 1A).
    3. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط معقم إزالة بعناية الجلد وفتح الجمجمة على الجانب الظهري على طول خط الوسط (الشكل 1B). إزالة الدماغ من يمكن التعرف على تجويف الجمجمة والأذن الداخلية التي تقع داخل العظام الزمنية في هذه المرحلة (الشكل 1C، D). بطانة الأوعية الدموية، التي عادة ما تكون موجودة في جميع أنحاء الأذن الداخلية، ويمكن استخدامها كمعلم لتحديد الأذن الداخلية في هذه المرحلة (الشكل 1D).
    4. تشريح الأذن الداخلية من العظام الزمنية عن طريق وضع ملقط تحت الأنسجة وعزل الأذن الداخلية من قاعدة الجمجمة ونقل إلى طبق جديد يحتوي الحل تشريح الباردة (الشكل 1E، F).

2. جيل من الجهاز الثقافات كورتي يزدرع

ملاحظة: في هذه المرحلة من التنمية، والأنسجة الغضروفية هي ويمكن تشريح بسهولة باستخدام ملقط.

  1. الشرق الأذن الداخلية بحيث الجانب البطني يكون مواجها لها (الشكل 2A) وتحقيق الاستقرار في الأذن الداخلية عن طريق إدراج بلطف على نهاية حادة من الدبابيس Minutien من خلال الجزء الدهليزي في الأذن الداخلية (الشكل 2B).
  2. قطع متناهية الصغر باستخدام ملقط فتح الغضروف المغطي عن طريق شق باستخدام واحدة من نهاية ملقط بالقرب من النافذة البيضاوي وبعناية إزالة الغضروف من القوقعة (الشكل 2C).
    ملاحظة: من المهم للتأكد من أن ملقط لا تدرج كثيرا في الغضروف كما الغضروف المغطي تنصهر في بعض الأحيان مع قناة القوقعية وفي هذه الحالة فإنه من المفيد استخدام ملقط مغلقة لاطلاق سراح الغضروف من قناة القوقعية الأساسي عن طريق كشط تحت الصورةurface من الغضروف. في هذه المرحلة من التنمية، ودوامة القوقعة هي فقط ثلاثة أرباع منعطفا في الطول.
  3. وبعد ذلك، فضح ظهارة الحسية عن طريق وضع ملقط في المنطقة المفضل للقناة القوقعية، إما القاعدة أو في ذروة جدا، وسحب بلطف من سطح القوقعة (الشكل 2D).
    ملاحظة: سقف القوقعة يجب إزالة تماما كما يمكن أن تحجب الظهارة الحسية التي تحول دون تحليل.
    ملاحظة: يجب أن يتم هذا الإجراء بلطف لأنه من السهل المسيل للدموع الظهارة الحسية.
  4. وكخطوة الماضية، وإزالة بعناية النسيج الضام الكامنة من الظهارة الحسية تتعرض بحيث قاعدة يزدرع قوقعة فارغة بشكل موحد.
  5. عزل القوقعة تشريح من الجزء الدهليزي في الأذن الداخلية باستخدام ملقط. هذا لا يمكن أن يؤديها قبل أو بعد الخطوة 2.4 (الشكل 2E).
  6. نقل الظهارة الحسية قوقعة تشريح في الاغشيه الطابق السفليشمال شرق الثقافة جيدا باستخدام 1.5 ملم بالمغرفة معقمة (الشكل 2F) المغلفة المصفوفة.
  7. الشرق ازدراع القوقعة مع سطح lumenal من ظهارة تواجه صعودا ونضح الغشاء القاعدي مصفوفة DMEM حل لشد بعناية النسيج واستبدالها مع 150 ميكرولتر من مستنبت الطازجة عن طريق إضافة بلطف إلى الطبق. ينبغي توخي الحذر للتأكد من أن كل يزدرع تلتزم بشكل جيد للساترة الزجاج المطلي وليس يعوم في مستنبت. ضمان غيض من ملقط وأشار يصل بينما الالصاق إلى البئر الزجاج لتجنب إتلاف يزدرع القوقعة.
  8. بلطف نقل الطبق الثقافة في العقيمة 150 مم طبق ثقافة ومكان في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع CO 2 5٪ للفترة من الوقت المطلوب، وعادة 3-6 أيام في المختبر (DIV). بعد 1 DIV، ودراسة الثقافات تحت المجهر تشريح للتأكد من أن يزدرع القوقعة التزمت كذلك إلى الطبق الثقافة.
  9. بعد فيcubation في المختبر لفترات من الوقت المطلوب، تتم معالجة الثقافات لالمناعية.
    ملاحظة: الثقافات يزدرع عادة ما يتم تحضين لمدة 6 DIV وهو ما يعادل المرحلة التنموية، P0. بعد مرور فترة الحضانة في المختبر والثقافات يمكن معالجتها لمزيد من التطبيقات المصب مثل المناعية (الشكل 3B)، RT-PCR، التهجين في الموقع، و / أو لطخة غربية في.

3. بوساطة Electroporation للنقل الجينات

  1. إنشاء ل electroporation:
    1. تعقيم واحدة 100 ملم صحن الزجاج Sylgard المغلفة من قبل التعقيم أو تمرغ في الايثانول 70٪ لمدة 20 دقيقة والسماح للهواء الجاف في مقاعد البدلاء النظيفة قبل استخدامها.
    2. إعداد DNA من متجه التعبير عن خيار استخدام maxi- أو ميدي الإعدادية مجموعات المناسبة. ناقلات التعبير المستخدمة في هذا البروتوكول هي pIRES2-Atoh1.EGFP وpCLIG-NeuroD1.EGFP. يجب أن يكون تركيز النهائي من الحمض النووي لا يقل عن 1 ميكروغرام / ميكرولتر في الحمض النووي معقم /خالية من ريبونوكلياز المياه.
  2. Electroporating الحمض النووي في إإكسبلنتس قوقعة الجنينية:
    1. إضافة 10 ميكرولتر من محلول الحمض النووي البلازميد إلى 100 ملم Sylgard المغلفة طبق الطازجة ونقل يزدرع القوقعة تشريح بالكامل (تم الحصول عليها من الخطوة 2.5) في حل DNA.
    2. مع سطح lumenal من ظهارة مواجهة، إمالة القوقعة قليلا بحيث انها عمودي على الطائرة من الطبق.
    3. ضع المجاذيف الكهربائي على جانبي القوقعة مع مجداف سلبي (الكاثود) نحو الظهارة الحسية ومجداف الإيجابي (الأنود) يقع بالقرب من قاعدة القوقعة.
      ملاحظة: بما أن اتهم DNA سلبا، فإنه يهاجر من السلبية إلى القطب الموجب وعن طريق وضع نهاية القطب السالب لجنة التحقيق المتاخمة للظهارة حسية. فإن DNA يذهب معظمها من خلال سطح الظهارة الحسية.
    4. باستخدام electroporator، وتقديم 9-10 نبضات من 24 فولت، 30 ميللي ثانية مدة النبضة مع التبديل دواسة القدم على رانه electroporator، ثم قم بإضافة 100 ميكرولتر من المتوسط ​​الدافئة الثقافة إلى القوقعة electroporated.
    5. كرر الخطوات من 3.2.1-4 لجميع إإكسبلنتس قوقعة وDNA من جميع الجينات في المصالح ونقل القوقعة electroporated في طبق المغلفة مصفوفة الغشاء القاعدي للتصفيح (الخطوة 2.7). ثقافة كل القوقعي electroporated في 37 ° C، 5٪ CO 2 حاضنة مرطب لفترات من الوقت المطلوب الذي سيتم بعد ذلك المجهزة للمناعية.
      ملاحظة: القوقعة من القمامة كاملة من CD1 الماوس (حوالي 8-12 الجراء) يمكن عزل، microdissected، electroporated ومطلي في <4 ساعة.

4. تحليل الثقافات القوقعة يزدرع

ملاحظة: عادة ما يتم تحضين الثقافات لمدة 6 DIV وهو ما يعادل المرحلة التنموية، P0. بعد مرور فترة الحضانة في المختبر، يتم إصلاح الثقافات ومعالجتها للمناعية.

  1. بعد طول المرجوة من المؤتمر الوطني العراقيubation، وإزالة مستنبت وبسرعة شطف يزدرع القوقعة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، واحتضان في 4٪ بارافورمالدهيد (المعد في PBS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. غسل مثبت من قبل PBS إضافة وشطف في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة.
  3. Permeabilize باستخدام PBS-T (PBS + 0.5٪ توين) لمدة 30 دقيقة قبل حجب مع تحتوي على 10٪ مصل الماعز PBS-T.
  4. احتضان في حل الأجسام المضادة الأولية التي تحتوي على الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني-T مع 1٪ مصل الماعز بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  5. غسل القوقعة ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة باستخدام PBS-T 15 دقيقة لكل منهما قبل أن يضيف الأجسام المضادة الثانوية اليكسا-مترافق المناسبة.
  6. منذ يزدرع القوقعة هو مثقف على الزجاج ساترة يمكن التعامل معها بشكل فردي عن طريق عزل ساترة من الطبق وتصاعد على شريحة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق نقع الطبق الثقافة في OS30 مذيب لا يقل عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. باستخدام شفرة حلاقة معقمة، فصل ساترة من دإيش وجبل على شريحة وتصور تحت المجهر الفلورسنت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف طريقة لعزل القوقعة من الأذنين الداخلية الجنينية والتشريح الدقيق لفضح الظهارة الحسية. بمجرد تشريحها ، يمكن طلاءها وزراعتها كقناة قوقعة صناعية سليمة (الشكل 3) وتحليلها بواسطة الكيمياء المناعية. توفر المشتآت المستخرجة للقوقعة الصناعية المزروعة اختبارا مفيدا لفحص تأثير مجموعة متنوعة من العوامل القابلة للذوبان والأدوية الدوائية على نمو القوقعة. بعد تشريح نباتات القوقعة الصناعية ، يمكن استخدام تقنية التثقيب الكهربائي لتحريف الجينات ذات الأهمية وفحص تأثيرها على تكوين القوقعة الصناعية. توضح النتائج المقدمة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كل الخلايا داخل التيه الغشائي في الأذن الداخلية الماوس بما في ذلك الحسية، وnonsensory وتستمد جميع الخلايا العصبية دوامة من العقدة المستمدة placodally-الكيسة السمعية يقع بالقرب من الدماغ المؤخر من الأديم الظاهر، حول E8 10-14. في E11، المنطقة البطنية من الكيسة السمعية تمتد لتشكيل القناة القوقعة ومع استمرار التنمية، مجموعة من الخلايا الظهارية داخل القوقعة، وكذلك في مناطق أخرى من الكيسة السمعية، وتصبح محددة بشكل بقع prosensory من شأنها أن تعطي لاحقا إلى ظهور أنواع مختلفة من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نتوجه بخالص الشكر للدكتور برادلي شولت للتعليقات على هذا البروتوكول. تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة R00 (5R00DC010220). تم تنفيذ هذا المشروع في مساحة مختبرية تم تجديدها بدعم من Grant C06RR014516.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
HBSSGibco14065-056
HEPESGibco15630-080
Dulbecco s معدل متوسطجيبكو12430-054
مصل الأبقار الجنينجيبكو10082
N-2 الملحق (100x)Gibco17502-048
Ciprofloxacin hydrochlorideCellgro61-277-RF
طبق زجاجي 60 ممKimble Chase23062-6015 / 23064-6015
طبق زجاجي 100 ممKimble Chase23064-10015 / 23062-10015
دبابيس Minutienأدوات العلوم الدقيقة26002-15
Dumont # 5 ملقطأدوات العلوم الدقيقة11251-10
مولد النبضProtech International IncCUY21Vivo-SQ
أطباق ثقافة القاع الزجاجيMatTekP35G-0-10-C
مصفوفة MatrigelBD Biosciences356237
طبق استزراع ، 60 × 15 ممBecton Dickinson353037
أطباق زراعة الأنسجةGreiner Bio-one639160
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتGibco10010-023
OS-30Dow Corning4021768
FluoromountSouthern Biotech0100-01
أنابيب مخروطية ، 15 ملGreiner Bio-one188261
Myosin 6Proteus Biosciences Inc25-6791
Myosin 7aProteus Biosciences Inc25-6790
TuJ1SigmaT2200

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. Organotypic development of the organ of Corti in culture. J Neurocytol. 4 (5), 543-572 (1975).
  2. Zheng, J. L., Gao, W. Q. Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears. Nat Neurosci. 3 (6), 580-586 (2000).
  3. Zheng, J. L., Shou, J., Guillemot, F., Kageyama, R., Gao, W. Q. Hes1 is a negative regulator of inner ear hair cell differentiation. Development. 127 (21), 4551-4560 (2000).
  4. Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea. Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).
  5. Jones, J. M., Montcouquiol, M., Dabdoub, A., Woods, C., Kelley, M. W. Inhibitors of differentiation and DNA binding (Ids) regulate Math1 and hair cell formation during the development of the organ of Corti. J Neurosci. 26 (2), 550-558 (2006).
  6. Dabdoub, A., et al. Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (47), 18396-18401 (2008).
  7. Doetzlhofer, A., Basch, M. L., Ohyama, T., Gessler, M., Groves, A. K., Segil, N. Hey2 regulation by FGF provides a Notch-independent mechanism of maintaining pillar cell fate in the organ of Corti. Dev Cell. 16 (1), 58-69 (2009).
  8. Puligilla, C., Dabdoub, A., Brenowitz, S. D., Kelley, M. W. Sox2 induces neuronal formation in the developing cochlea. J Neurosci. 20 (2), 714-722 (2010).
  9. Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Academic Press. San Diego. (1995).
  10. Sher, A. E. The embryonic and postnatal development of the inner ear of the mouse. Acta Otolaryngol Suppl. 285, 1-77 (1971).
  11. Torres, M., Giraldez, F. The development of the vertebrate inner ear. Mech Dev. 71 (1-2), 5-21 (1998).
  12. Brown, S. T., Martin, K., Groves, A. K. Molecular basis of inner ear induction. Curr Top Dev Biol. 57, 115-119 (2003).
  13. Puligilla, C., Kelley, M. W. Building the world’s best hearing aid; regulation of cell fate in the cochlea. Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 368-373 (2009).
  14. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a008409(2012).
  15. Holt, J. R. Viral-mediated gene transfer to study the molecular physiology of the mammalian inner ear. Audiol Neurootol. 7 (3), 157-160 (2002).
  16. Stone, I. M., Lurie, D. I., Kelley, M. W., Poulsen, D. J. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to hair cells and support cells of the murine cochlea. Mol Ther. 11 (6), 843-848 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة