يمثل التحليل في المختبر لإعادة تركيب تبديل الفصل في الفئران أمرا صعبا بسبب جزيئات IgE المحبة للخلايا المرتبطة بمستقبلات Fc على سطح الخلايا البائية. نصف طريقة للكشف عن IgE باستخدام الانقسام بوساطة التربسين ل IgE المرتبط بالسطح قبل التثبيت والنفاذية لتلوين التألق السيتوبلازمي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
كشف صحيح فريق الخبراء الحكومي الدولي، معربا عن ماوس B خلايا سلالته
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
B اللمفاويات المناعي السلسلة الثقيلة (IGH) إعادة التركيب تبديل فئة (CSR) هو عملية حيث أعرب في البداية الغلوبولين المناعي بالتبديل إلى isotypes IGH أخرى، مثل ايغا، فريق الخبراء الحكومي الدولي ومفتش. قياس IGH CSR في المختبر هو الطريقة الرئيسية لدراسة عدد من العمليات البيولوجية التي تتراوح بين إعادة التركيب وإصلاح الحمض النووي لجوانب علم المناعة الجزيئية والخلوية. في المختبر CSR فحص ينطوي على تدفق cytometric سطح قياس التعبير IG على خلايا B تفعيلها. في حين قياس ايغا ومفتش فرعية واضح ومباشر، وقياس إيج بواسطة هذه الطريقة هو إشكالية بسبب ذوبان فريق الخبراء الحكومي الدولي ملزم لFcεRII / أعرب CD23 على سطح خلايا B تفعيلها. نحن هنا وصف الإجراء فريدة من نوعها لقياس دقيق لإيج المنتجة للخلايا فأر B التي خضعت المسؤولية الاجتماعية للشركات في الثقافة. وتستند هذه الطريقة على بوساطة التربسين الانقسام المجمعات إيج-CD23 على سطوح الخلايا، مما يسمح للكشف عن إيج المنتجة للخلايا B النسب التي كتبها قبرصيتلطيخ toplasmic. يقدم هذا الإجراء حلا ملائما لتحليل تدفق cytometric من المسؤولية الاجتماعية للشركات لفريق الخبراء الحكومي الدولي.
المقدمة
خلال المناعي السلسلة الثقيلة (IGH) إعادة التركيب تبديل فئة (CSR) في الفئران والبشر، وIGH μ يتم حذف الإكسونات المنطقة ثابتة (Cμ) والاستعاضة عن واحدة من عدة مجموعات من المصب الإكسونات المنطقة ثابتة (C H ق) (على سبيل المثال Cγ، Cε، وCα)، مما أدى إلى التحول من إنتاج الغلوبولين المناعي لإنتاج الطبقات الإيج أخرى (على سبيل المثال مفتش، فريق الخبراء الحكومي الدولي، أو ايغا). يحدث CSR داخل التبديل (S) المناطق، والتي هي 1-10 متواليات كيلوبايت تقع 5 'إلى كل مجموعة من C H ق 1. انزيم تفعيل الناتج عن سيتيدين نازعة أمين (AID) يبدأ CSR عبر النشاط سيتيدين نزع الأمين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: جميع التجارب الموصوفة هنا كانت وفقا للمبادئ التوجيهية لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) والتي وافقت عليها مستشفى البحوث الحيوانية للطفولة (ARCH)، بوسطن، ماساشوستس.
1. إعداد الكواشف
- 1،000x IL-4 المخزون: تمييع IL-4 خلوى إلى 20 ميكروغرام / مل في H 2 O أو 0.1٪ ألبومين المصل البقري (BSA). الاستغناء في 200 مكل إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -20 ° C.
- 1،000x مكافحة CD40: الحصول من الشركة المصنعة في 1.0 ملغ ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وقد تم تنفيذ هذا الإجراء بنجاح لدراسة CSR إلى إيج في خلايا فأر B. لإثبات كفاءة في قياس المسؤولية الاجتماعية للشركات، ونحن حفز الماوس خلايا B الطحال مع مكافحة CD40 وIL-4 كما هو موضح سابقا (11). بعد خمسة أيام من التحفيز، تم جمع الخلايا ومعالجتها باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه وملطخة fluorescently المسمى الغلوبولين المناعي، IgG1، فريق الخبراء الحكومي الدولي، وB220 (CD45R) الأجسام المضادة. بوابات على الخلايا الليمفاوية التفجير (الشكل 1)، عدد سكانها واضح ل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
سوف تحفيز الماوس الطحال خلايا B في الثقافة مع مكافحة CD40 وIL-4 محاكاة T نوع المساعد 2 (T H 2) التفاعلات، وتشجيع التحول فئة لIgG1 وفريق الخبراء الحكومي الدولي 5. خلايا B يمكن تفعيلها عن المسؤولية الاجتماعية للشركات في سياق من إجمالي splenocytes 12 أو خلايا B الطحال تنقيته الى 11. كما لوحظ في بروتوكول (الخطوة 2.3)، B تخصيب الخلية هو اختياري، وغير بناء على تقدير المجرب لتحديد ما إذا كان سيكون مفيدا. الفصل المغناطيسي الإيجابي للخلايا B باست.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي إفصاح.
شكر وتقدير
ويدعم DRW من المنح NIH AI089972 وAI113217، وفريق الدراسات المناعة المخاطية، وحاصل على جائزة الوظيفي للعلماء الطب من صندوق ويلكوم بوروز.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| استنساخ المضاد للفأر IgE FITC | BD PHARMINGEN | 553415 | R35-72 |
| الفئران المضادة للفأر IgG1 PE | BD Pharmingen | 550083 | استنساخ A85-1 |
| الميثانول | BDH | BDH1135-4LP | يحافظ على -20 درجة ؛ سي |
| فالكون سيل مصفاة 40 & ميكرو; م نايلون | كورنينج | 352340 | |
| مصفاة خلية الصقر 70 ومايكرو ؛ m نايلون | كورنينج | 352350 | |
| مضاد هو / مو CD45R (B220) PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-4052-82 | استنساخ RA3-6B2 |
| مضاد للماوس / الفئران CD40 | eBioscience | 16-0402-85 | استنساخ HM40-3 |
| RPMI متوسط 1640 | جيبكو | 11875-093 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| MEM-NEAA (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (10x) | Lifetechnologies (Corning) | 46-013-CM | |
| MACS CD45R (B220) microbeads | Miltenyi Biotec | 130-049-501 | |
| عمود تنقية MACS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| IL-4 | PeproTech | 214-14 | إعادة التكوين في الماء أو محلول فورمالين BSA بنسبة 0.1 |
| ٪ ، مخزن محايد ، 10٪ | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| محلول التربسين-EDTA (10x) | Sigma Aldrich | T4174-100 مل | 5.0 جرام تربسين ، 2.0 جرام EDTA &# 8226 ؛ 4 Na لكل لتر من 0.9٪ كلوريد الصوديوم |
| بنسلين ستربتومايسين | سيجما ألدريتش | P0781-100 مل | 10،000 U بنسلين ؛ 10 مجم / مل ستربتومايسين (100x) |
| L-Glutamine 200 ملي | سيجما ألدريتش | G7513 | |
| 2-ميركابتو إيثانول (99٪) | Sigma Aldrich | M6250-100 مل | |
| عازلة تحلل الخلايا الحمراء | Sigma Aldrich | R7757 | |
| الفئران المضادة للفأر IgM RPE / Cy7 | SouthernBiotech | 1140-17 | استنساخ 1B4B1 |
| HyClone مصل عجل الجنين | الحراري | SH30910.03 | |
| تحفيز | البائية تتكون وسائط تحفيز الخلايا البائية من RPMI مع مصل ربلة الساق الجنينية (15٪) ، 20 ملي هيبس ، 1x MEM-NEAA ، 2.0 ملي ل-جلوتامين ، ؛ 1x بنسلين ستربتومايسين (البنسلين: 100 وحدة / مل ، الستربتومايسين: 100 وميكرو ؛ جم / مل) ، بيتا ميركابتو إيثانول (7 وميكرو ؛ لتر / لتر) ، IL-4 (20 نانوغرام / مل) ، ومضاد ل CD40 (1 & micro ؛ جم / مل) |
المراجع
- Chaudhuri, J., et al. Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism. Advances in immunology. 94, 157-214 (2007).
- Gould, H. J., Sutton, B. J. IgE in allergy and asthma today. Nature reviews. Immunology. 8, 205....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
