TIRFM والحساسة للدرجة الحموضة GFP-تحقيقات في تقييم ناقل عصبي الحويصلة حيوية في خلايا SH-SY5Y العصبية: التصوير خلية وتحليل البيانات

انتقال متشابك الكيميائية بين الخلايا العصبية هو آلية رئيسية للاتصال في الجهاز العصبي. وهي تعتمد على إطلاق النواقل العصبية من خلال دورة ديناميكية من الانصهار الحويصلة واسترجاعها في الموقع قبل المشبكي. وقد تم تحديد العديد من البروتينات المشاركة في ديناميات الحويصلة. ومع ذلك، لا تزال المساهمة المحددة لهذه الظاهرة إلى توضيح ^1.

فهمنا يقتصر جزئيا بحقيقة أن المقايسات الأكثر استخداما لإكسو / الإلتقام ليست دائما الأنسب. العديد من الدراسات المتعلقة الانصهار الحويصلة وديناميكية تعتمد على تقنيات الكهربية. توفر هذه التقنية على قرار الزمني الأمثل وممتازة للتحقيق الانصهار الأولي من الحويصلات إلى غشاء البلازما ولكن غير قادرة على الكشف عن العديد من الأحداث الجزيئية الكامنة التي تدعم وظيفة قبل المشبكي. الإلكترون المجهري، على الجانب الآخر، يوفر أرقى morphologicaل وصف لكل خطوة واحدة، ولكن الجانب الديناميكي لهذا الحدث لا يمكن القبض، لأن العينات يجب أن تكون ثابتة لكي يتم تحليلها.

ظهور تقنيات التسجيل البصري الجديدة ^2،3، في تركيبة مع التقدم في الفلورسنت تطوير تحقيقات الجزيئية ^4-6، وتمكن التصور من العمليات exocytic في الخلايا الحية، وبالتالي توفير مستويات جديدة من المعلومات حول بنية متشابك وظيفة.

الدراسات الأولية استغلال الأصباغ التي تعتمد على النشاط styryl (FM1-43 والأصباغ العضوية ذات الصلة) ^7،8. دولة من بين الفن وتقنيات التصوير توظف المتغيرات الحساسة الرقم الهيدروجيني للالبروتين الأخضر نيون (GFP) (pHluorin) المربوطة إلى الحويصلات اللمعية البروتينات ^9. يتم تبديل هذه التحقيقات عادة قبالة عندما تكون موجودة في الحويصلات بسبب انخفاض درجة الحموضة اللمعية. بعد الاندماج مع غشاء البلازما، يتعرض الداخلية الحويصلة إلى الفضاء خارج الخلية محايد، ودرجة الحموضة يزيد فجأة، ويخفف من وتبريد تعتمد على بروتون من pHluorin ويظهر إشارة الفلورسنت بسرعة. كما تغير في pHluorin أسرع من الحدث الانصهار، من خلال رصد زيادات مضان، الانصهار الحويصلة مع غشاء يمكن قياسها وتحليلها. لأن endocytosed سطح جزيئات الموسومة pHluorin، إشارة مضان يعود بعد ذلك إلى المستوى القاعدي، وبالتالي فإن نفس التركيبة يمكن أن تستخدم أيضا لمراقبة الحويصلة إعادة تدوير ^9.

في حين أن الموسومة حويصلة درجة الحموضة استشعار يضمن التصور فقط من تلك الحويصلات التي تلتحم حقا مع غشاء البلازما، مطلوب التصوير في القرار المكانية والزمانية عالية لوصف بالتفصيل الخطوات المتبعة في إكسو / العمليات التقامي. هذه التقنية البصرية التي توفر الدقة المكانية والزمانية الضروري هو مجموع المجهري التأمل الداخلي مضان (TIRFM)، وهو تطبيق مضان المجهري ^10.

العديد من الخصائص تجعل TIRFM أسلوب الاختيار لرصد الحويصلات ديناميات. على النقيض من ذلك الكمال وإشارة إلى الضوضاء نسبة عالية تسمح للكشف عن الإشارات منخفضة جدا مستمدة من الحويصلات واحدة. الحصول على الصور يعتمد على الشرائح الالكترونية في كل إطار يوفر القرار الزماني اللازم لاكتشاف عمليات ديناميكية للغاية. وأخيرا، فإن التعرض الحد الأدنى من الخلايا لضوء في أي طائرة أخرى في العينة يقلل بشدة الضيائية وتمكن تسجيل طويل دائم الوقت الفاصل ^12.

يبقى تحليل البيانات الجانب الأكثر تحديا وحاسم من هذه التقنية. إن أبسط طريقة لمراقبة الانصهار الحويصلة هي لقياس تراكم البروتينات مراسل فلوري على سطح الخلية، على مر الزمن ^13. كما يزيد من الانصهار، صافي الزيادة إشارة مضان كذلك. ومع ذلك، وهذه الطريقة قد يقلل من شأن هذه العملية، لا سيما في الخلايا الكبيرة وفي ظروف الراحة،لأن العمليات الإلتقام وphotobleaching من تعويض الزيادة في كثافة مضان بسبب حويصلة إيماس. طريقة بديلة هو اتباع كل الانصهار حدث واحد ^14. هذا الأسلوب الأخير هو حساس جدا ويمكن أن تكشف عن تفاصيل مهمة حول آليات الاندماج. ومع ذلك، فإنه يتطلب اختيار اليدوية الأحداث واحدة، لأن إجراءات مؤتمتة بالكامل لمتابعة الحويصلات وللتسجيل تذبذب إشاراتها الفلورسنت لا تتوفر دائما. مراقبة ديناميات الحويصلة تتطلب خلايا أخذ العينات في وتيرة عالية. وهذا يولد كمية كبيرة من البيانات التي بالكاد يمكن تحليلها يدويا.

على اقتراح من هذه الورقة هو تحسين تقنية التصوير TIRFM لرصد القاعدية وحفز الإفراج العصبي في خط الخلية العصبية SH-5YSY، ووصف، خطوة بخطوة، وهو إجراء المتقدمة في المختبر لتحليل البيانات، على حد سواء عند مستويات كلها خلية واحدة حويصلة.

1. الثقافة الخلية وترنسفكأيشن

1. زراعة الخلايا SH-SY5Y
   ملاحظة: وقد أجريت التجارب باستخدام العصبية البشرية SH- SY5Y (آي تي سي سي # CRL-2266) ^15. خلايا SH-SY5Y تنمو على شكل مزيج من مجموعات العائمة والخلايا الملتصقة. اتبع الإرشادات الواردة في البروتوكول (كثافة الخلايا، ونسبة تقسيم، الخ.) لديك الخلايا التي تنمو ترتبط بقوة مع غطاء زجاجي، وهو أمر حاسم بالنسبة TIRFM.
   1. قبل البدء، في ظل مجلس الوزراء تدفق الصفحي السلامة الأحيائية، وجعل حجم مناسب من الفوسفات العقيمة حل العازلة المالحة (PBS) ومستنبت.
      1. جعل 50 مل من برنامج تلفزيوني مع تركيزات 150 مم كلوريد الصوديوم، و 24 ملي العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4. تصفية الحل.
      2. جعل 50 مل من المتوسط ​​خلية من Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) مع ارتفاع نسبة الجلوكوز، و 10٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني (FBS) والبنسلين (100 U / مل)، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)، L-الجلوتامين ( 2 مم)، والبيروفات الصوديوم (1 ملم). تصفية الحل.
   2. إزالة كاملة المتوسطة النمو وغسل الخلايا مع 3 مل من برنامج تلفزيوني.
   3. احتضان الخلايا مع 2 مل من 0.05٪ التربسين ethylenediaminetetraacetic-حمض (EDTA) (لمدة 6 سم طبق بتري) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ وفصل الخلايا باستخدام ماصة.
   4. تعطيل التربسين بإضافة 2 مل من DMEM، وجمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
   5. إزالة طاف، إضافة 1 مل من DMEM لبيليه وماصة الحل صعودا وهبوطا بما فيه الكفاية لتفريق الخلايا في تعليق خلية واحدة.
   6. تقسيمها 1: 4 في 6 سم القطر طبق بتري جديدة تحتوي على 3 مل من المتوسط ​​كاملة. الحفاظ على الخلايا في الثقافة في 6 سم القطر أطباق بتري، عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة. الثقافة الفرعية مرة واحدة في الأسبوع أو عندما قد غطت 80-90٪ من مساحة السطح.
2. SH-SY5Y الطلاء خلية للتصوير
   1. للتجارب TIRFM، لوحةالخلايا على أغطية الزجاج. يغطي توظيف الزجاج مع 0.17 ± 0.005 مم سماكة ومعامل الانكسار 1.5255 ± 0.00015. قبل البدء، وإعداد coverslips الزجاج على النحو التالي:
      1. يغطي زجاج نظيف مع 90٪ من الإيثانول، O / N.
      2. شطف لهم جيدا في الماء المقطر (ثلاثة تغييرات من الماء المقطر). يغطي الزجاج الجاف في فرن التجفيف.
      3. مكان يغطي في أطباق بتري الزجاج وتعقيم في فرن محمى على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
   2. قبل يوم واحد ترنسفكأيشن، ووضع كل ساترة في 3.5 سم طبق بتري، إضافة 1 مل من مستنبت واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
   3. يعرض للتريبسين الخلايا كما هو موضح في الخطوات 1.1.3 - 1.1.5، تعليق بيليه خلية في 1 مل من المتوسط ​​الكامل والاعتماد. حساب حجم الصحيح من تعليق خلية لإضافة إلى كل طبق بيتري لانتاج 3 × 10 ⁵ خلايا / جيد. مطلوب هذه الكثافة لنمو الخلايا الأمثل وترنسفكأيشن كفاءة. احتضان عند 37 ° Cفي 5٪ CO ₂ حاضنة O / N.
3. SH-SY5Ytransfection التي كتبها polyethylenimine (PEI)
   ملاحظة: لتصور ديناميات حويصلات متشابك، وقد استخدم ناقلات pCB6 تحتوي على synapto-pHluorin. تم إنشاء synapto-pHluorin من قبل في إطار اندماج البديل الحساسة الرقم الهيدروجيني للالبروتين الفلوري الأخضر (GFP) ¹⁶ والبروتين الغشاء الحويصلي synaptobrevin 2. بناء واستخدمت على نطاق واسع للتحقيق خصائص حويصلة متشابك داخل الخلايا العصبية ^9.
   1. قبل البدء ترنسفكأيشن، وجعل 10 مل من الحلول التالية. حافظ على الحلول القصوى كما ك 1 الشهر.
      1. جعل 150 مم كلوريد الصوديوم الحل. ضبط لدرجة الحموضة 5.5 مع 0.01 N حمض الهيدروكلوريك.
      2. جعل حل PEI بنسبة 10٪ polyethylenimine (PEI، و 25 كيلو دالتون الخطي) في 150 ملي كلوريد الصوديوم الحل. الرقم الهيدروجيني للمحلول ترتفع إلى 8.8. ضبط درجة الحموضة إلى 7.8 مع 0.01 N حمض الهيدروكلوريك.
   2. 24 ساعة بعد والطلاء، وإزالة المتوسطة وتحديث مع 1.5 مل منمتوسطة كاملة. إبقاء الخلايا عند 37 درجة مئوية، في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
   3. تحت مجلس الوزراء تدفق الصفحي السلامة الأحيائية، في أنبوب 1.5 مل microfuge، إضافة 3 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى 25 ميكرولتر من 150 مم كلوريد الصوديوم الحل و 100 ميكرولتر من PEI الحل في 3.5 سم طبق بتري.
   4. دوامة لمدة 10 ثانية، ثم احتضان الخليط DNA / PEI لمدة 30 دقيقة في RT.
   5. إضافة بعناية الخليط DNA / PEI إلى طبق بتري تحتوي على coverslips مع الخلايا ويهز بلطف لتوزيع بالتساوي الكاشف في طبق بتري.
   6. بعد 4 ساعات تغيير المتوسطة واحتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة. إجراء تجارب التصوير 24 - 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

التصوير 2. خلية من انعكاس إجمالي الداخلية المجهر مضان (TIRFM)

1. التصوير انشاء
   1. أداء TIRF التصوير مع مجموعة المتابعة هو موضح في الشكل 1. وهي تتألف من بمحركات مقلوبالمجهر (الشكل 1، أقحم A)، مصدر الليزر (الشكل 1، أقحم B) وTIRF-المنزلق (الشكل 1، أقحم C). وصول TIRFM الإضاءة من خلال الفتحة العددية عالية (NA 1.45 ألفا خطة-Fluar) النفط 100X، الهدف الغمر.
   2. لTIRFM الإضاءة، وتوظيف متعدد الخطوط (458/488/514 نانومتر) 100 ميغاواط الأرجون ليزر ايون. باستخدام الألياف أحادية الوضع، ويعرض ضوء الليزر الاستقطاب خطيا إلى مسار الشعاع، عبر شريط التمرير TIRF. إدراج شريط التمرير TIRF في الطائرة الحجاب الحاجز الحقل مضيئة من مسار الشعاع ينعكس الضوء.
      1. للإضاءة في حقل واسع، قم بتوصيل المجهر إلى التقليدية مصباح الزئبق قصيرة قوس HBO الضوء الأبيض. A-منظور الحفاظ على الاستقطاب المزدوج في شريط التمرير يضمن الجمع في وقت واحد TIRF الإضاءة والضوء الأبيض.
   3. تصفية ضوء الليزر مع مرشح الإثارة (عرض الفرقة 488/10 نانومتر) التي شنت على عجلة التصفية، التي أدخلت على مسار الليزر. توظيفسرعة عالية، مصراع الكاميرا، التي تسيطر عليها البرنامج للسماح للسيطرة السريعة للإضاءة ليزر. لتحليل pHluorin، جبل عصابة تمر 525/50 نانومتر تصفية الانبعاثات. التقاط الصور الرقمية (512 × 512 بكسل) على كاميرا CCD سريعة يبرد مع صورة ProPlus البرمجيات.
2. تحقيق TIRF الإضاءة (الشكل 2)
   1. بدوره على أشعة الليزر، والكمبيوتر، والكاميرا، وعجلة التصفية، والتحكم مصراع الكاميرا، ثم، وانتظر 20 دقيقة قبل البدء في التجربة كما تحتاج إلى أشعة الليزر في عملية الاحماء والاستقرار.
   2. قبل التصوير، وجعل حجم مناسب من الحلول التالية.
      1. جعل 50 مل من كريبس (KRH) حل في 125 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1.2 ملي MgSO4، 1.2 ملي KH ₂ PO _4، 25 مم 4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين-1-ethanesulfonic حمض (HEPES) (مخزنة ل درجة الحموضة 7.4)، 2 مم CaCl _2، و 6 ملي الجلوكوز.
      2. جعل 10 مل من بوكل-KRH الحل (7.4 درجة الحموضة) في 80 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي بوكل، 1.2 ملي MgSO4، 1.2 ملي KH ₂ PO ₄و 25 ملي HEPES (مخزنة لدرجة الحموضة 7.4)، 2 مم CaCl _2، و 6 ملي الجلوكوز.
   3. إزالة الغطاء الزجاجي مع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل وأدخله في غرفة التصوير المناسبة. تجميع الغرفة وإضافة 500 ميكرولتر من حل KRH في وسط الزجاج.
   4. إضافة زيت على الهدف. ضع غرفة التصوير على مسرح المجهر ووضع الهدف تحت ساترة الزجاج. ضع غطاء آمن على العينة.
   5. في وضع epifluorescence، والتركيز على ساترة (السطح العلوي) واختيار الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل وضعت في وسط الغرفة. حدد الخلايا التي يمكن تسجيلها بشكل واضح استخدام وقت التعرض أقل من 80 ميللي ثانية إشارة الفلورسنت.
   6. تحت السيطرة البرمجيات، والتحول إلى TIRF الإضاءة في طريقة العيش.
   7. لتعيين التكوين TIRF، والتحقق من موقف من الحزم التي تنبثق من هذا الهدف، على غلاف العينة (الشكل 2B). عندما يتم وضع شعاع في وسط رانه عدسة الهدف (الشكل 2A، يسار)، بقعة مرئيا في وسط غطاء عينة TIRF (الشكل 2B، يسار) وتصويرها الخلية في وضع epifluorescence (عدة طائرات التركيز، وارتفاع مضان الخلفية؛ الشكل 2C، يسار) .
   8. للوصول إلى زاوية حرجة، نقل بقعة مركزة في اتجاه Y (إلى الأمام أو الخلف، الشكل 2B، وسط) باستخدام المسمار تعديل زاوية على شريط التمرير TIRF (الشكل 1C). عندما يتقاطع شعاع على متن الطائرة العينة في زاوية أكبر من الزاوية الحرجة (الشكل 2A، يمين)، وبقعة يختفي و، رقيقة، خط ركزت على التوالي هو واضح في منتصف غطاء العينة (الشكل 2B، والحق).
   9. لضبط زاوية TIRF استخدام نموذج الخلية (الشكل 2C). مشاهدة صورة مضان على الفيديو، في هذه المرحلة، وهي صورة تشبه epifluorescence لا تزال واضحة. بلطف، حرك المسمار حتى TIRF يخدعويتحقق dition: واحد فقط طائرة البصرية للخلية هي في التركيز (أي غشاء البلازما في اتصال مع غطاء الانزلاق)، وهو ما يؤدي في صورة مسطحة مع التباين العالي (الشكل 2C، يمين).
3. التصوير عينة
   1. تعيين على قناة واحدة التجربة مرور الزمن. لتقليل photobleaching من، والتقاط الصورة باستخدام منخفضة وقت التعرض ومكاسب عالية. مرات التعرض المناسبة ما بين 40 - 80 ميللي ثانية. الحصول على صور في 1 - 2 هرتز تردد أخذ العينات. قد تكون حركية حويصلة أخذ العينات مقدرة أفضل على التردد العالي (10 هرتز). في الوقت العادي من المراقبة هو عادة 2 دقيقة.
   2. إضافة 500 ميكرولتر من الحل وسجل خلايا KRH في وضع TIRFM. هذا هو الشرط يستريح. توفير الوقت صور متسلسلة.
   3. التركيز على نفس الخلية وسجل تحت نفس ظروف يستريح (قوة الليزر، والتعرض الوقت، رقم الإطار). بعد خمس الإطارات، إضافة 500 ميكرولتر من حل بوكل-KRH والحفاظ على بوكل في الغرفة.هذا هو الشرط حفز. توفير الوقت صور متسلسلة.

3. تحليل الصورة ومعالجة البيانات

ملاحظة: لتحليل الصور، وقد وضعت وحدات الماكرو في المختبر، استنادا إلى المهام الحالية للبرنامج تحليل الصور. تتوفر وحدات الماكرو مماثلة عبر الإنترنت (URL المقدمة في جدول المواد والمعدات).

1. كثافة مضان الكمي
   1. استخدام "تسلسل كثافة مضان" ماكرو للكثافة مضان الكمي في المنطقة ذات الاهتمام (ROI) من الصورة، على مدار الفيلم.
   2. فتح الصور مرة ومتسلسلة. انتقل إلى القائمة الكلية واختر 'تسلسل كثافة مضان. في نافذة "تحليل" يبدو "تحديد العائد على الاستثمار".
   3. اختيار واحد من أدوات التحديد في القائمة لإنشاء ROI. ضع 3 رويس في مناطق من غشاء الخلية من دون نقاط (ROI الخلفية). توظيف ثيالصورة "ROI الخلفية" لتقييم photobleaching من وإلى تعيين الحد الأدنى لتحليل الحدث الانصهار (الشكل 3A).
2. photobleaching من التصحيح وتحديد العتبة (الشكل 3B)
   1. لتقييم photobleaching من فتح مضان الصفوف كثافة "رويس الخلفية"، (الشكل 3BA). تطبيع قيم الكثافة مضان في كل إطار لقيمة كثافة الأولية (F0) (F / F0) (الشكل 3BB). متوسط ​​القيم.
   2. تسليط الضوء على متوسط ​​البيانات وإنشاء خط المؤامرة باستخدام الخيارات القائمة الرسم البياني.
   3. من القائمة تحليل البيانات، حدد "خط الاتجاه" لفتح الحوار تحليل المؤامرة. حدد نوع الانحدار. تعيين الانحدار "أسي". ثم حدد "معادلة العرض على الرسم البياني". في نافذة الرسم البياني، تظهر المعادلة الأسية ويتم تعيين القيم المعلمة تلقائيا، (الشكل 3Bc
   4. تطبيق تصحيح الأسي لقيم الكثافة في كل إطار على النحو التالي:
      الجبهة الوطنية (تصحيح) = الجبهة الوطنية / إكسب (-n * أ)
      الجبهة الوطنية = التجريبية كثافة مضان تقاس في إطار ن. ن = عدد الإطارات. و= عامل التبييض (ثابتة التعبير عن معدل فقدان كثافة بسبب photobleaching من.   الرقم 3BD).
   5. لضبط عتبة، فتح "ROI الخلفية" تطبيع وتصحيح، وحساب متوسط ​​إشارة مضان والانحراف المعياري لها (SD). متوسط ​​قيمة بالإضافة إلى 3 SD تمثل عتبة (الشكل 3BE). استخدام هذه العتبة لتحليل البيانات.
3. اختيار الأحداث الانصهار باستخدام إجراء شبه
   1. فتح الصور مرة ومتسلسل مع برنامج تحليل الصور. تطبيق عامل تصفية جاوس إلى تسلسل الصور النشط.
   2. تحليل الصور باستخدام أداة "عد الأشياء" أو ماكرو الذي يسمح للاختياركائن الذين لديهم متوسط ​​كثافة مضان ضمن مجموعة محددة بكسل. تعيين كثافة تتراوح يدويا، وذلك باستخدام وظيفة العتبة (انتقل إلى القائمة شريط، تعيين مقياس → عتبة لتسليط الضوء على مجال الاهتمام). عتبة كافية هي 30٪ خلال إشارة الخلفية الفلورسنت المحلية.
   3. تطبيق ماكرو "مرشحات الأجسام" لتحديد الأجسام الوحيدة التي تستوفي المعايير التالية:
      1. تطبيق الخيار نطاقات (دقيقة والحد الأقصى ضمنا) لالجانب. تقارير الجانب النسبة بين المحور الرئيسي والمحور البسيط ما يعادل القطع الناقص إلى الكائن. الجانب هو دائما ≥1. القيم الكافية هي دقيقة = 1، الحد الأقصى = 3.
      2. تطبيق نطاقات لقطر. قطر تقارير متوسط ​​طول أقطار قياسها على فترات درجة اثنين من الانضمام نقطتين الخطوط العريضة والتي تمر عبر النقطه الوسطى للكائن. تعيين نطاق بالبكسل (أو في ميكرون، إذا كان استخدام نظام معايرة).
      3. تعريف نطاق الأمثل في preliminتجارب آري: تحديد يدويا البقع من الفائدة ومن ثم قياس قطرها باستخدام وظيفة الملف الشخصي المؤامرة.
   4. حدد "عرض الكائنات": سوف تظهر الكائنات المحددة فرضه على الصورة TIRFM (الشكل 4B).
   5. تدرج في التحليل فقط تلك البقع التي تظهر قصيرة (1-3 إطارات) زيادة عابرة في كثافة مضان، تليها مباشرة خسارة ملحوظة من إشارة (بقع عابرة). توظيف اختيار دائرية لإنشاء ROI قطرها حوالي بقعة واحدة شعاعيا حول اختيار حويصلة / البقع (رويس التجريبي). تنفيذ هذه الخطوة يدويا.
   6. مع رويس مختارة، وحساب متوسط ​​كثافة مضان من كل ROI على مدار الفيلم.
4. تحليل البيانات (الشكل 3C-D)
   1. تصدير بالطبع وقت التغييرات مضان يقاس في كل "ROI التجريبية" إلى جدول بيانات. (الشكل 3DA). تطبيع قيمة كثافة في كل إطار لشدة الأولية مضان (F / F0)، (الشكل 3DB).
   2. تطبيق تصحيح الأسي لقيم الكثافة في كل إطار كما ذكرت في الخطوة 3.2.4 (الشكل 3DC).
   3. لحساب عدد من الأحداث الانصهار (رقم ذروة)، ومرة ​​يحدث كل الانصهار (العرض ذروة) واتساع ذروة الفلورية (ارتفاع الذروة وAUC) تطبيق وظائف منطقية باستخدام جدول بيانات أو الرياضيات الحزم. وذكر مثالا على تحليل الحدث الانصهار باستخدام الصيغ المنطقية في الشكل 3Dd و3DE.
   4. نفترض زيادة كثافة مضان تتجاوز عتبة (شدة متوسط ​​مضان الخلفية ± 3SD)، والانصهار الحويصلة إلى غشاء البلازما وذروة الناتج كما حدث الانصهار.
   5. حساب العرض الذروة كما الفرق بين الماضي وقيمة X الأولى من كل الذروة. تتضاعف هذه القيمة ل1 / (تردد أخذ العينات). النظر في هذه القيمةهذه هي المرة الانصهار الحويصلة والتصاق في غشاء البلازما قبل حويصلة إعادة تحمض وإعادة التدوير (الشكل 3Dd).
   6. حساب AUC خلية كاملة باعتبارها مجموع القيم على العتبة. تنظر هذه القيمة كما صافي التغيير الفلورسنت خلال مدة التسجيل بسبب عفوية (يستريح) أو أثار (حفز) النشاط متشابك.
   7. حساب ارتفاع الذروة بالفرق بين القيمة ذ القصوى من كل الذروة والعتبة. تنظر هذه القيمة كما يدل على نوع الانصهار (واحد في وقت واحد مقابل الانصهار متسلسل / أو عابر مقابل الانصهار الكامل).

وقد صممت هذه الإجراءات التصوير TIRF وتحليل البيانات ووصف لدراسة الحويصلات ديناميكية في الأنظمة الخلوية. يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد آثار يشير الجزيئات والمخدرات على الأحداث الانصهار وديناميكية العصبي حويصلة 17. باستخدام بروتينات غشاء البلازما الموسومة GFP، وقد تم استخدام التحليل TIRFM لتوصيف الاتجار التأسيسي من الناقلين الغلوتامات الموسومة GFP في الدبقية والخلايا الظهارية 18،19.

للتحقق من صحة استراتيجية إجراء التصوير وتحليل البيانات المبلغ عنها، وتسجل الأحداث الانصهار تحت القاعدية وحفز الشروط (الاستقطاب الناجم البوتاسيوم)، في الخلايا العصبية SH-SY5Y transfected مع synapto-pHluorin. (فيديو 1، 2، على التوالي). يتم إجراء تحليلين مختلفة: خلايا كلها (الشكل 4) وتحليلات واحدة الحويصلة (الشكل 5).

تحليل خلية كاملة الشرق الأوسط وأفريقياسورس العدد الإجمالي للأحداث الانصهار في الخلية والتغيرات مضان صافي الناتج الناجم عن التحفيز. في الشكل (4)، وتسجل synapto-pHluorin الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل تحت يستريح وحفز الشروط (التحفيز بوكل)، وذلك باستخدام نفس البروتوكول التجريبي (التعرض الوقت، قوة الليزر، الخ). ويبين الشكل 4A أن synapto-pHluorin يتراكم في نقاط والفلورسنت متناثرة على غشاء الخلية. كما هو موضح في الأدب، إشارة الفلورسنت خافت هي أيضا موجودة في غشاء البلازما 9؛ هذه الإشارة هي مفيدة لتحديد الخلايا المراد تصويرها. في الشكل 4B، وفرضه البقع التي اختارها الإجراء التلقائي هو موضح في ورقة (القسم 3.3) إلى صورة TIRFM التي أعلن عنها في الشكل 4A. الشكل 4C يظهر تطبيع ملامح كثافة الفلورسنت من أماكن مختارة في ظل ظروف يستريح. هذه الملامح تكشف عن وجود قمم الفردية مشابهة من حيث كثافة الفلورسنتensity التي تخرج في أوقات مختلفة خلال تسجيل وربما تتوافق مع الحويصلات التي تلتحم أحيانا مع الغشاء. ويبين الشكل 4D آثار التحفيز بوكل. كما هو متوقع، الاستقطاب مع 25 ملي بوكل يثير استجابة سريعة وتظهر عدة نقاط والفلورسنت مشرقة جدا في غشاء الخلية (فيديو 2). هذه نقاط وتتوافق مع تجمع "نشره بسهولة" من الحويصلات المشبكية الحالية تحت غشاء البلازما. ويشير التحليل مدار الساعة من التغييرات الفلورسنت قياس في المراسلات من مواضع فردية وجود قمم، من كثافة مضان المتغيرة، التي تظهر فجأة بعد تطبيق التحفيز الإفرازية (الشكل 4D و4F). وذكرت نتائج التحليل خلية كاملة خلال فترة التسجيل في الشكل 4E-H. يسبب التحفيز بوكل زيادة سريعة ملحوظ في عدد الأحداث الانصهار (2.5 أضعاف على الأوضاع يستريح) (الشكل 4E-F) وفي الناتجة التغييرات كثافة مضان (9.3 أضعاف على الأوضاع يستريح) (الشكل 4G-H)، مما يدل على الإفراج العصبي الهائل.

تحليل واحدة أوقات الذروة يسمح توصيف الأحداث احد الانصهار (الشكل 5). ويبين الشكل 5A ومتتابعة صور لتمثيلية "ROI التجريبي" سجلت في ظل ظروف يستريح. على وجه الخصوص يسلط الضوء على synapto-pHluorin المسمى الحويصلة التي تدمج مع غشاء تحت منطقة TIRF. بعد إطارين، يختفي إشارة الفلورسنت، مشيرا المحتمل استرجاع الحويصلة وإعادة تحمض. الملف الشخصى مضان تطبيع المنطقة من الفائدة (الشكل 5B) يقيس زيادة في إشارة الفلورسنت في المراسلات من ظهور بقعة في المنطقة TIRF. على العكس، فإن مضان يعود إلى مستوى القاعدية بعد اختفاء بقعة (ذروة واحدةمتوسط ​​العرض 1.91 ± 0.32 ثانية؛ متوسط ​​ارتفاع الذروة 0.042 ± 0.005 كثافة مضان تطبيع). الشكل 5C و5D تظهر صور متسلسلة من "ROI التجريبي" سجلت تحت التحفيز بوكل والمقابلة الشخصية تطبيع كثافة مضان. لاحظ زيادة في حركة الحويصلات داخل وخارج منطقة TIRF بعد بوكل الاستقطاب.

ويتم اختيار 40 الأحداث الانصهار وتحليلها في الراحة وحفز الظروف. يتم قياس المعلمات التالية: متوسط ​​ذروة AUC، عرض الذروة والارتفاع. يحدد عرض ذروة وقت الانصهار الحويصلة، والتعلق والإلتقام قبل إعادة تحمض وإعادة التدوير، والشكل 5G. ارتفاع ذروة يقيس التغيرات كثافة مضان الناجمة عن الانصهار الحويصلة، الشكل 5F. التغييرات في هذه المعايير تدل على آليات إيماس مختلفة. تحليل واحدة أوقات الذروة يكشف عن أن بوكل الاستقطاب تعديلطريقة الانصهار الحويصلة إلى غشاء البلازما. في الواقع، وزيادة في متوسط ​​منطقة الذروة (3.8 ± 0.2 أضعاف على ظروف الراحة، P <0.01 عن طريق إقران اختبار t، الشكل 5E)، ارتفاع الذروة (2.75 ± 0.03 أضعاف، P <0.01 عن طريق إقران اختبار t، الشكل 5F) وعرض (2.6 ± 0.5 أضعاف، P <0.05 عن طريق إقران اختبار t. الشكل 5G) يتم الكشف في ظل ظروف حفز. عدة تفسيرات يمكن تصور لهذه النتائج. والاحتمال هو أن بوكل الاستقطاب يسبب انصهار في وقت واحد و / أو متتابعة من الحويصلات في منطقة مقيدة للخلايا. تفسير بديل هو أن الاستقطاب القوي تفضل الاندماج الكامل مقابل الانصهار عابر. في ظل ظروف القاعدية، وآلية السائدة هي التحام عابرة: أ أشكال المسام الانصهار، ودرجة الحموضة في الزيادات الحويصلة وتظهر إشارة الفلورسنت، ولكن المسام يغلق على الفور، مما يسمح السريع إعادة تحمض وإعادة التدوير. تحتشروط حفز، الحويصلة الصمامات تماما مع غشاء البلازما، وارتفاع الذروة وزيادة العرض كما الاستيلاء على مكونات غشاء الحويصلة، وإعادة تحمض وإعادة التدوير قد تتطلب فترة أطول. ونتيجة مماثلة قد تم الحصول عليها مؤخرا تحليل مثل متشابك microvesicle إيماس في الغدد الصماء β-خلايا 20.

تعيين الرقم المجهر 1. TIRF تصل. عرض تخطيطي وصورة (أقحم) من نظام المجهر TIRF. وانشاء تضم محوري المراقب Z1 بمحركات مجهر مقلوب (A)، ومتعدد خط 100 ميغاواط الأرجون ليزر ايون (B)، وعلى بعد المنزلق TIRF (C). وتظهر ضوء الليزر (الخط الأخضر) والضوء الأبيض (الخط الأصفر). يتم تصوير الخلايا باستخدام الهدف الغمر 100 × النفط. يتم التقاط الصور الرقمية على RetigaSRV تبريد كاميرا CCD السريع. المرجعوحدة LECTOR، انبعاث (488/10 نانومتر) والإثارة (تمرير الفرقة 525/50 نانومتر) مرشحات، وتلسكوب الموازاة (L1) والتركيز وأشار (L2) العدسة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. الحصول على التكوين TIRFM. (A) الكرتون تخطيطي يوضح الهدف، غطاء للانزلاق، والعينة والموقف من شعاع الليزر (الخط الأزرق). اليسار، شعاع الإثارة يسافر مباشرة من خلال واجهة تغطية الانزلاق عينة . العينة هو متحمس كما هو الحال في وضع epifluorescence مركز، وأشكال الإثارة شعاع مع العينة أقل زاوية الحادث من زاوية حرجة، وعلى ضوء ينير العينة في زاوية متغيرة. الحق، شعاع الإثارة يشكل incidزاوية الأنف والحنجرة أكبر من الزاوية الحرجة، يتم الانتهاء من الضوء المنعكس مرة أخرى في عدسة موضوعية، وينتشر حقل زائل في العينة. (B) كارتون تبين غطاء عينة والموقف من شعاع الإثارة (الدائرة الزرقاء)، التي تنبثق من هذا الهدف، خلال فترة الانتقال من epifluorescence (يسار) نحو TIRF الإضاءة (يمين). (C) epifluorescence (يسار) وTIRFM (يمين) وصور من synapto-pHluorin مضان في خلية SH-SY5Y الحية. شريط مقياس: 10 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. معالجة البيانات وتحليلها. (A) صورة TIRFM من synapto-pHluorin مضان في الحي SH-SY5Y الخلية. الساحة الخضراء يشير إلى وجود تمثيلية "ROI الخلفية". مقياس شريط 10 ميكرون. (ب) سير العمل المقترحة لROI الخلفية. من أعلى إلى أسفل:.... على مدار الساعة من التغيرات كثافة مضان قياس العائد على الاستثمار في الخلفية؛ ب تطبيع التغييرات مضان إلى القيمة مضان الأولية (F / F0)؛ ج تطبيق الانحدار المتسارع، د التصحيح ل photobleaching، ه. تقييم عتبة (مربع رمادي شفاف). (C) TIRFM صورة synapto-pHluorin مضان في خلية SH-SY5Y الحية. مربع أبيض يشير إلى وجود تمثيلية "ROI التجريبي". مقياس شريط 10 ميكرون. (D) سير العمل المقترحة لROI التجريبية. من أعلى إلى أسفل: أ مدار الساعة من التغيرات كثافة مضان، ب تطبيع البيانات إلى قيمة مضان الأولية (F / F0)؛ ج. التصحيح؛ دي تطبيق وظائف منطقية للكشف عن عدد الذروة، AUC والعرض والارتفاع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. تحليل خلية كاملة. (A) صورة TIRFM من synapto-pHluorin مضان في خلية SH-SY5Y الحية. وتسجل الخلايا تحت يستريح وحفز (25 ملي بوكل التطبيق) الشروط (عينات في 1 هرتز). شريط مقياس: 10 ميكرون. وتظهر (ب) المناطق التي تم تحديدها من قبل الإجراء التلقائي فرضه (اللون الأخضر) على الصورة TIRFM. (C) تطبيع ملامح كثافة مضان (F / F0) من البقع التي اختارها الإجراء التلقائي في خلية كاملة في ظل ظروف يستريح. (D) Normalizإد ملامح كثافة مضان (F / F0) من أماكن مختارة في ظل ظروف حفز. شريط على آثار تشير إلى تطبيق بوكل. (EH) عدد من الأحداث والتغيرات كثافة مضان سجلت في الخلية بأكملها تحت يستريح (الأزرق)، وحفز (الحمراء) الظروف. (E) المدرج الإحصائي تبين العدد الإجمالي للأحداث الانصهار سجلت في الخلية. (F) التوزيع الزمني للأحداث الانصهار. (G) المدرج الإحصائي تمثل التغيرات في pHluorin كثافة مضان التي تحدث في الخلية بأكملها (AUC مجموع). (H) منحنيات تبين pHluorin تغييرات كثافة مضان التراكمية بوصفها وظيفة من الزمن. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

(A) خلايا SH-SY5Y معربا عن synapto-pHluorin في 1 هرتز، في ظل ظروف يستريح. TIRFM تمثيلي صور متسلسلة (كل 2 ثانية) لROI تظهر synapto-pHluorin وصفت حويصلة. ROI = 40 × 35 بكسل. (B) لمحة مضان تطبيع (F / F0) من العائد على الاستثمار هو مبين في A. النجمة السوداء تشير إلى حدث الانصهار، يظهر خط العتبة. يتم تسجيل (C) والخلية نفسها تحت ظروف حفز (25 ملي بوكل)، وتظهر TIRFM تمثيلي صور متسلسلة من العائد على الاستثمار. يشار تطبيق بوكل من قبل النجمة الصفراء. (D) وصورة مضان تطبيع في المنطقة هو مبين في C يسلط الضوء على الوصول (في) واختفاء (الخروج) من الحويصلات. النجمة السوداء تشير الأحداث الانصهار، يظهر خط العتبة. (EG) خصائص الأحداث احدة حويصلة سجلت تحت يستريح (الشريط الأزرق) وحفز ( شريط الحمراء) الظروف. ن = 40 الأحداث الانصهار. (E) يسار، يشار إلى منطقة ذروة (AUC) من الضوء الأزرق؛ والحق، رسوم بيانية متوسط ​​المناطق الذروة. ** ف <0.01. (F) اليسار، ارتفاع الذروة (ح) يشار بواسطة سهم برأسين، مركز، رسوم بيانية من متوسط ​​ارتفاع الذروة. ** ف <0.01؛ والحق، ويحدد ارتفاع ذروة آلية الانصهار. نجم في الكرتون تشير synapto-pHluorin. (G) اليسار، يشار إلى العرض ذروة بواسطة سهم برأسين، مركز، رسوم بيانية للمتوسط ​​عرض الذروة. * P <0.05؛ والحق، ويحدد العرض ذروة وقت حويصلة إيماس، التعلق والإلتقام. لون نجوم الأخضر عندما مضان synapto-pHluorin مرئيا والرمادي عند تشغيل-إيقاف ذلك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

يتم تسجيل الفيديو 2. خلايا SH-SY5Y معربا عن synapto-pHluorin في ظل ظروف حفز (عينات في 1 هرتز). وأشار بوكل الارواء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.