مع هذه الدراسة، ونحن نقدم نموذجا الإجهاد موحد لشبكية العين الأبقار superfused معزولة للاختبار العلاجي قبل السريرية في المستقبل. تم تقييم تأثير إما نقص الأكسجة (النقي N 2) أو الإجهاد الغلوتامات (250 ميكرومتر الغلوتامات) على وظيفة الشبكية التي يمثلها أ وسعة ب الموجة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الغلوتامات ونقص الأكسجة نموذجا الإجهاد لمعزولة perfused لالفقارية الشبكية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وكانت العصبية حقل قوي من التحقيق في الأبحاث لطب العيون في العقود الماضية، ويؤثر على أمراض مثل الزرق، وانسداد الأوعية الدموية في شبكية العين، انفصال الشبكية، واعتلال الشبكية السكري. وكان الهدف من هذه الدراسة إلى تقديم نموذج موحد لاختبار الإجهاد العلاجي قبل السريرية في المستقبل.
تم إعداد شبكية العين الأبقار ومع perfused حل الأكسجين المشبعة المعيار، وتم تسجيل ERG. بعد تسجيل مستقرة ب-الأمواج، نقص الأكسجة (N النقي 2) أو الإجهاد الغلوتامات (250 ميكرون الغلوتامات) تم بذلها لمدة 45 دقيقة. للتحقيق في الآثار المترتبة على وظيفة مبصرة وحدها، أضيف 1 ملم اسبارتاتي للحصول على موجات. تم رصد أرج استرداد لمدة 75 دقيقة.
لنقص الأكسجين، لوحظ وجود انخفاض في الموجة سعة 87.0٪ (P <0.01) بعد وقت المعرض من 45 دقيقة (انخفاض بنسبة 36.5٪ بعد نهاية تبييض ع = 0.03). بالإضافة إلى ذلك، decr الأوليسهولة في سعة ب-موجة وسجلت 87.23٪، التي وصلت إلى دلالة إحصائية (P <0.01، بانخفاض قدره 25.5٪ في نهاية الغسل، ص = 0.03).
ل 250 ميكرون الغلوتامات، تخفيض 7.8٪ الأولي من سعة في الموجة (P> 0.05)، يليه انخفاض قدرها 1.9٪ (P> 0.05). والحد من 83.7٪ من سعة الموجة ب (P <0.01) لوحظ. بعد فشل 75 دقيقة كان انخفاض 2.3٪ (ع = 0.62). في هذه الدراسة، يتم تقديم نموذج موحد الإجهاد التي قد تكون مفيدة لتحديد آثار اعصاب محتملة في المستقبل.
المقدمة
وكانت العصبية حقل قوي من التحقيق في الأبحاث لطب العيون في العقود الماضية. شبكية العين هي شبكة الخلايا العصبية الحساسة للغاية التي تعتمد بشكل كبير على الأوكسجين وتتأثر بشدة عملية التمثيل الغذائي للخلايا المحيطة بها. أمراض العين الرئيسية المتعلقة تلف الخلايا العصبية هي انسداد الأوعية الدموية في شبكية العين، والزرق، وانفصال الشبكية.
في شبكية العين انسداد الشريان، كمثال لشبكية العين انسداد الأوعية الدموية، ويؤدي إلى فقدان مفاجئ للرؤية بسبب نقص الأكسجين في شبكية العين الداخلية 1. وغالبا ما تترافق مع أمراض الأوعية الدموية العامة (2) ويؤدي إلى فقدان البصر المستمرة 1، مع 8٪ فقط من المرضى يتعافى حدة البصر بشكل ملحوظ 1. وعلى الرغم من انحلال الفيبرين الشرياني وقد اقترح كخيار العلاج، لا يمكن أن تظهر فائدة في تجربة سريرية عشوائية 3.
الزرق وانفصال الشبكيةعلى حد سواء وزيادة في تركيز الصوديوم 4-6. واجه الغلوتامات في ظل الظروف الفسيولوجية باعتبارها مثير الارسال في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي كله، وشبكية العين 7،8 الداخلي. تم العثور على مستويات مرتفعة الغلوتامات ليس فقط في الزرق وانفصال الشبكية 5،6 ولكن أيضا في اعتلال الشبكية السكري التكاثري 9. زيادة في الغلوتامات ربما يؤدي إلى التحفيز الزائدة، وبالتالي تلف الخلايا العصبية 10. في معظم حالات انفصال الشبكية، وفي بعض الحالات من التكاثري جراحة اعتلال الشبكية السكري على الشبكية (الجزء المسطح استئصال الزجاجية) ضرورية. خلال الجزء المسطح استئصال الزجاجية التلاعب الميكانيكية، والضوء الساطع من الألياف البصرية أو إجهاد القص التي كتبها معدلات تدفق عالية من حلول الري المبذولة خلال عمليات طويلة تمارس إجهادا إضافيا على شبكية العين 11،12.
جميع الأمراض المذكورة تشترك في أن علم الأمراض المترجمة إلى ريتينوحده، وتشكل المجتمع بأمراض في العيون مع التحدي لايجاد سبل لحماية شبكية العين كنظام العصبي الحسي.
في مخطط كهربية الشبكية (أرج) هو الطريقة المعيارية لتقييم وظيفة في الجسم الحي مستقبلة للضوء (أ-موجة) وظيفة من وظائف شبكية العين الداخلية (ب الموجة). يتم قياس أرج كل أقطاب الفضة التي أدخلت على القرنية ويتم تحفيز العينين عن طريق زيادة مستوى الضوء للكشف عن عيوب في قضبان أو الأقماع أو في شبكية العين الداخلية. يمكن الكشف عن عيوب مختلفة في شبكية العين بسبب التغيرات في السعة (قوة الاستجابة) أو الكمون (للاستجابة الفاصل الزمني إلى) من أرج. أرج البروتوكول وقياس أساليب مختلفة (نمط أرج، متعددة البؤر-ERG أو حقل مشرق أرج) تسمح بالمزيد من التمايز من العيوب. تم إدخال تقنية شبكية العين معزولة في الآونة الأخيرة، مما يجعل من الممكن لتقييم الآثار على شبكية العين دون تدخلات من مثل حيوان الدراسةردود الفعل العامة 13،14.
وكان الغرض من هذه الدراسة لتقييم وتقديم نموذج الإجهاد محددة وموحدة لنقص الأكسجة والإجهاد الغلوتامات على شبكية العين معزولة superfused. وبالتالي، فإننا نأمل أن وضع الأسس للدراسات المستقبلية على آثار اعصاب من بعض وكلاء أو حلول الري داخل العين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الأبقار عيون
- الحصول على عيون البقر مباشرة بعد ذبح الحيوان.
- نقل وجهة نظر محمية في "Sickel-حل" وسيلة خاص يحتوي على 120 ملي كلوريد الصوديوم، 2 ملي بوكل، 0.1 ملي MgCl 2، 0.15 ملي CaCl 2، 1.5 ملي ناه 2 PO 4، 13.5 ملي نا 2 هبو 4 و 5 ملي الجلوكوز في RT.
- أداء إعداد الشبكية في ظل ظروف الظلام تكييفها مع ضوء أحمر خافت.
- إزالة الجزء الأمامي من العين. إجراء شق كاليفورنيا. الاستوائي 4 مم الخلفي لحوف. بعد ذلك إزالة القرنية، القزحية والجسم الهدبي والعدسة في قطعة واحدة. الحفاظ على شبكية العين في Sickel-حل.
- ميكانيكيا تخفيف المرفقات زجاجي على سطح الشبكية وإزالة الجسم الزجاجي من كأس العين مفتوحة.
- بعد ذلك تقسيم العين إلى أربعة أجزاء ولكمة من الجولة مناطق من كاليفورنيا. 7 مم باستخدام منقب.
- فصل بلطف شبكية العينمن الظهارة الصبغية ووضعه على جهاز تسجيل داخل علبة محمية من الضوء. يتكون جهاز التسجيل من معيل البلاستيك مع شبكة في الوسط، وضع شبكية العين على شبكة ومن ثم اصلاحها مع حلقة بلاستيكية مباشرة على الأقطاب الكهربائية.
ملاحظة: إن معيل البلاستيك لديها قناتين للسماح لتدفق مستمر من المتوسط.
2. تسجيل في مخطط كهربية الشبكية (أرج)
- من أجل تسجيل مخطط كهربية الشبكية، واستخدام قطبين الفضة / الفضة كلوريد على جانبي شبكية العين ويروي شبكية العين في سرعة ثابتة نضح من كاليفورنيا. 1 مل / دقيقة ودرجة حرارة ثابتة من 37 درجة مئوية. استخدام "Sickel-حل" مشبع بالأكسجين.
- قبل البدء في القياس، التكيف مع الظلام شبكية العين (حمايته من الضوء خلال جميع القياسات) واستخدام فترات التحفيز من خمس دقائق. استخدام 1 هرتز واحد أبيض فلاش زينون لتحفيز مع كثافة المقرر أن 6.3 MLX على سطح الشبكية.
- استخدام معايرة مرشحات الكثافة محايدة وحافزا خفيفة من 10 μsec التي يسيطر عليها جهاز توقيت من أجل الحصول على الاستجابات المثلى.
- لقياس ومعالجة البيانات، تصفية أرج وتضخيمها (100 هرتز تمريرة عالية التصفية، 50 هرتز مرشح الشق، 100،000 س التضخيم) باستخدام العشب RPS312RM مكبر للصوت. محاولة لتصفية الترددات المزعجة المحتملة التي قد تعكر صفو الإشارة. من أجل معالجة البيانات، واستخدام لوحة اكتساب التناظرية إلى الرقمية البيانات على جهاز كمبيوتر سطح المكتب (PC متوافق).
- بعد فترة التكيف السوداء تحت نضح المستمر، وقياس سعة من الإشارة الكهربائية حتى يتم تسجيل مستقرة سعة ب الموجة.
تعتبر مدى التردد مستقرة إذا خمسة قياسات واحدة تصل قيمة المتوسط وتنحرف أقل من 10٪: ملاحظة. ويرد مثال جيد على قياسات واحدة في الشكل 1. - لبدء الاختبار، ويحل محل الأكسجين النقي من قبل أي من النيتروجين النقي (عدد من التجارب واحدة، ن = 5) لاختبار لنقص الأكسجةأو 250 ميكرون الغلوتامات (ن = 5).
- تسجيل الاستجابات الكهربائية كل 5 دقائق لمدة 45 دقيقة.
- بعد فترة الاختبار، ويروي شبكية العين مع المتوسط القياسي مشبع بالأكسجين لمدة 75 دقيقة وإلقاء نظرة على التغييرات من السعة ب الموجة. وهذه هي المرحلة من الاخفاق. قياس السعة ب-موجة من الحوض الصغير من على الموجة إلى ذروة ب الموجة.
- لدراسة تأثير نقص الأكسجين أو الغلوتامات على إمكانية مستقبلة للضوء في ظل ظروف ظلامية، قمع ب الموجة بإضافة 1 ملم إلى المحلول المغذي.
- بعد أن سجل إمكانات مبصرة مستقرة لمدة 30 دقيقة، تنفيذ الإجراء كما كان من قبل، ويعرض شبكية العين 45 دقيقة إلى حلول الري المختلفة مع 1 ملم اسبارتاتي. استخدام نفس الفترة تبييض (خطوة 2.8) كما ذكر في وقت سابق.
تحليل 3. البيانات
- من أجل تقييم البيانات إحصائيا، وضمان التوزيع الطبيعي لجميع البيانات، على سبيل المثال باستخدام كولموغوروف سميرنوف-اختبار 15.
- حساب الحد من أ ب الموجة سعة في النسب المئوية بعد مرحلة التعرض بالمقارنة مع قياس الأخير قبل المعرض. قارن الحد من ERG-سعة بعد 45 دقيقة - في نهاية فترة المعرض - إلى ERG قياس قبل التطبيق.
- مقارنة موجة أ- وب- في نهاية مرحلة من الاخفاق إلى السعة المقابلة قبل المعرض لدراسة انتعاش محتمل.
- للتحليل الإحصائي، استخدام البرنامج أحزاب اللقاء المشترك البرامج الإحصائية SPSS أو البرامج. حساب البيانات في جميع أنحاء كما يعني ± الانحراف المعياري. تقدير أهمية من قبل الاختبار الإحصائي المناسب.
ملاحظة: هذه الاختبارات قد تكون مختلفة اعتمادا على نطاق تجريبي. في هذا الإعداد، استخدم تقرن اختبار t الطالب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد 1 ساعة من نضح من الاستعدادات الشبكية مع المشبعة بالأكسجين حل القياسية (الشكل 1A و B) أظهرت ERG-سعة الاستقرار والتباين أقل من سعة بين القياسات واحدة. درجة الحموضة، والضغط الاسموزي، ودرجة الحرارة، وص 2 (باستثناء اختبار نقص الأكسجة) وظلت ثابتة لجميع الاختبارات.
لعزل إشارة مستقبلة للضوء من شبكية العين إشارة الداخلية، وأضيف 1 ملم اسبارتاتي إلى حل القياسي لقمع ب الموجة (الشكل 1A). خل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه الدراسة، تم العثور على تأثير كبير على السعة ب-موجة بعد 45 دقيقة من نقص الأكسجة. لا يزال هذا انخفاض كبير بعد مرحلة الغسل. ويمكن ملاحظة تأثير مماثل على إمكانية مبصرة.
معتمدة النتائج وفقا لبيانات أخرى نشرت 16 وتعطينا الفرصة لدراسة الآثار المحتملة اعصاب بعد نقص الأكسجين.
بعد 45 دقيقة المعرض من 250 ميكرومتر الغلوتامات، لم نجد لها تأ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
هذه الورقة مخصصة لزوجتي الحبيبة مارين وكارل الصغير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 120 ملي كلوريد الصوديوم ؛ | ميرك فارما ، ألمانيا | 1،064،041،000 | |
| 2 ملي مولار KCl, | ميرك فارما ، ألمانيا | 1،050،010،250 | |
| 0.1 ملي مولار MgCl2 ، ؛ | ميرك فارما ، ألمانيا | 58،330،250 | |
| 0.15 ملي متر CaCl2 | ميرك فارما ، ألمانيا | 111 TA106282 | |
| 1.5 ملي مولار NaH2PO4 / 13.5 ملي مولار Na2HPO4 ؛ | ميرك فارما ، ألمانيا | 1،065،860،500 | |
| 5 ملي جلوكوز | ميرك فارما ، ألمانيا | 40،741،000 |
المراجع
- Varma, D. D., Cugati, S., Lee, A. W., Chen, C. S. A review of central retinal artery occlusion: clinical presentation and management. Eye (Lond). 27, 688-697 (2013).
- Resch, M., Suveges, I., Nemeth, J. Hypertension-related eye disorders). Orv Hetil. 154, 1773-1780 (2013).
- Feltgen, N., et al. Multicenter study of the European Assessment Group for Lysis in the Eye (EAGLE) for the treatment of central retinal artery occlusion: design issues and implications. EAGLE Study report no. 1 : EAGLE Study report no. 1. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 244, 950-956 (2006).
- Dreyer, E. B., Zurakowski, D., Schumer, R. A., Podos, S. M., Lipton, S. A. Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma. Arch Ophthalmol. 114, 299-305 (1996).
- Bertram, K. M., et al. Amino-acid levels in subretinal and vitreous fluid of patients with retinal detachment. Eye (Lond). 22, 582-589 (2008).
- Diederen, R. M., et al. Increased glutamate levels in the vitreous of patients with retinal detachment). Exp Eye Res. 83, 45-50 (2006).
- Ientile, R., et al. Apoptosis and necrosis occurring in excitotoxic cell death in isolated chick embryo retina. J Neurochem. 79, 71-78 (2001).
- Mali, R. S., Cheng, M., Chintala, S. K. Plasminogen activators promote excitotoxicity-induced retinal damage. FASEB J. 19, 1280-1289 (2005).
- Ambati, J., et al. Elevated gamma-aminobutyric acid, glutamate, and vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Arch Ophthalmol. 115, 1161-1166 (1997).
- Vorwerk, C. K., et al. Depression of retinal glutamate transporter function leads to elevated intravitreal glutamate levels and ganglion cell death. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 3615-3621 (2000).
- Schultheiss, M., et al. Dulbecco's Modified Eagle Medium is neuroprotective when compared to standard vitrectomy irrigation solution. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 251, 1613-1619 (2013).
- Januschowski, K., et al. Comparing the effects of two different irrigation solutions on an isolated perfused vertebrate retina. Ophthalmic Res. 48, 59-66 (2012).
- Sickel, W. Respiratory and Electrical Responses to Light Simulation in the Retina of the Frog. Science. 148, 648-651 (1965).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain research. Brain research protocols. 16, 27-36 (2005).
- Henderson, A. R. Testing experimental data for univariate normality. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 366, 112-129 (2006).
- Alt, A., et al. The neuroprotective potential of Rho-kinase inhibition in promoting cell survival and reducing reactive gliosis in response to hypoxia in isolated bovine retina. Cell Physiol Biochem. 32, 218-234 (2013).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision research. 39, 2165-2177 (1999).
- Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments. Nat Methods. 6, 257-261 (2009).
- Dutescu, R. M., et al. Multifocal ERG recordings under visual control of the stimulated fundus in mice. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2582-2589 (2013).
- Perlman, I. Testing retinal toxicity of drugs in animal models using electrophysiological and morphological techniques. Doc Ophthalmol. 118, 3-28 (2009).
- Mukhopadhyay, A., Gupta, A., Mukherjee, S., Chaudhuri, K., Ray, K. Did myocilin evolve from two different primordial proteins. Mol Vis. 8, 271-279 (2002).
- Januschowski, K., et al. Evaluating retinal toxicity of a new heavy intraocular dye, using a model of perfused and isolated retinal cultures of bovine and human origin. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1013-1022 (2012).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res Brain Res Protoc. 16, 27-36 (2005).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
