مقالة منهجية

في وقت واحد تسجيل الكهربية والصغرى، والحقن وكلاء المثبطة في الدماغ القوارض

DOI:

10.3791/52271

⸱

يوليو 7, 2015

 ,  ,  , 
1École d'optométrie, Université de Montréal

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصنع ماصة زجاجية ذات وظائف مزدوجة: تثبيط هياكل الدماغ العميقة عن طريق الحقن المجهري للأدوية والمراقبة في الوقت الفعلي لآثارها من خلال التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية المتزامنة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا تصف طريقة لبناء واحدة في استخدام "injectrode" باستخدام الأجزاء التي يمكن الوصول تجاريا وبأسعار معقولة. وتم تطوير نظام التحقيق الذي يسمح لحقن المخدرات في حين تم تسجيل الإشارات الكهربية من السكان الخلايا العصبية المتضررة. وهذه الطريقة توفر بديلا بسيط واقتصادي للحلول التجارية. تم تعديل ماصة الزجاج عن طريق الجمع بين ذلك مع إبرة تحت الجلد وخيوط الفضة. يتم إرفاق injectrode إلى مضخة محقنة مكروية تجارية لتسليم المخدرات. هذه النتائج في الاسلوب الذي يوفر في الوقت الحقيقي الدوائية ردود الفعل من خلال وحدة متعددة إشارات الخلية التي تنشأ من موقع تسليم المخدرات. كدليل على المفهوم، سجلنا نشاط الخلايا العصبية من أكيمة متفوقة التي تسببها ومضات من الضوء في الفئران، بالتزامن مع تسليم المخدرات من خلال injectrode. وتسمح القدرة على تسجيل injectrode توصيف وظيفي للينجموقع ection صالح مراقبة دقيقة على توطين إيصال الدواء. تطبيق هذه الطريقة يتجاوز كثيرا ما يتجلى هنا، حيث أن اختيار مادة كيميائية تحميلها في injectrode واسعة، بما في ذلك تتبع علامات للتجارب التشريحية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتثبيط المناطق القشرية ونوى شبه القشرية مهم في دراسة العلاقات الوظيفية بين الهياكل الدماغ المختلفة 2-4. وقد استخدمت الأدبيات الحديثة الخسارة من وظيفة كيميائية أو تقنيات المبردة لدراسة دور هياكل الدماغ 2،5. فيما يتعلق إبر دقيقة جدا الدوائية، يمكن أن تدار كميات صغيرة من المخدرات إلى منطقة الدماغ بمعدل تسيطر عليها مع التقليل من الأضرار الجانبية إلى 6،7 الأنسجة المحيطة بها. هذه التقنية يمكن استخدامها لتقديم منبهات محددة، منبهات عكسية أو الخصوم لدراسة تأثير أهداف الدوائية المختلفة على نشاط الخلايا العصبية. ويمكن أيضا أن هذه الآثار دراستها عن طريق قياس التغيرات في الاستجابات العصبية من أماكن بعيدة، مما يسمح للباحثين لدراسة العلاقات بين مختلف الهياكل القشرية وتحت القشرية.

هنا، علينا أن نظهر تجميع جهاز، وinjectrode، قادرة على بوعشر تسجيل الإشارات الكهربية وتقديم كميات صغيرة من المخدرات في الموقع المستهدف. علينا أن نظهر قدرات هذا النظام عن طريق حقن GABA، مثبط مشترك من نشاط الخلايا العصبية في الفئران أكيمة متفوقة. هذه المنطقة حساسة للالتحفيز البصري، مما أتاح لنا استخدام أثار بصريا النشاط المتعددة الوحدات لتأكيد injectrode الترجمة. وجرى تقييم حالة العكس من التعطيل من خلال استرداد نشاط الخلايا العصبية العادية بعد انتهاء الحقن GABA.

القدرة على مراقبة نشاط وحدة متعددة من موقع الحقن يسمح لضبط معدلات الحقن والكميات اللازمة لتحقيق الاستجابة الدوائية المرجوة. ومن هنا، فإن الاستفادة من هذه التقنية هو إمكانية الحد من تلف الأنسجة التي تسببها تروية دقيقة، حيث يتم حقن كميات أصغر فعالة. وينص البروتوكول المقترح وسيلة فعالة من حيث التكلفة لتوليد لزم الامر الأجهزة المتاحY لإجراء التجارب حيث هو المطلوب تسليم المخدرات وتسجيل نشاط الخلايا العصبية المحلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لتوجيهات المجلس الكندي لحماية الحيوانات واستعراض مجلس أخلاقيات جامعة مونتريال: ملاحظة.

1. جمعية ماصة تسجيل حقن

  1. سحب على الزجاج الشعرية حوالي 7 سم (1 مم القطر الخارجي) باستخدام مجتذب ماصة.
  2. كسر غيض من الشعرية والتحقق من فتحة تحت المجهر الضوئي. تأكد من أن القطر الداخلي بين 30 ميكرون إلى 40 ميكرون.
  3. اضافة الى وجود 7 سم سلك الفضة طويلة في الزجاج الشعرية مع ما يقرب من 1 سم جاحظ من نهاية غير مدبب من ماصة الزجاج.
  4. ثني خيوط الزائد متعامد على الزجاج الشعرية.
  5. تطبيق قطرة من مرونة لاصقة من البلاستيك على رمح من إبرة تحت الجلد 30 G.
  6. ادخال ابرة تحت الجلد 30 G في ماصة الزجاج وفقا لالخطط المعروضة في الشكل 1 .
  7. إضافة طبقة ثانية من الغراء لضمان ختم الصحيح من تقاطع بين ماصة الزجاج وإبرة تحت الجلد.
  8. ترك ماصة لتجف مع طرف تواجه التصاعدي لنحو 12 ساعة لضمان علاج مناسب من الغراء. تظهر النتيجة النهائية في الشكل 2.

ملاحظة: يتم هذا الإجراء على التجارب الحادة والتعقيم من طرف ماصة غير مطلوب.

2. إعداد الحيوان

  1. وضع الفئران في مربع التخدير.
  2. حمل التخدير باستخدام 4٪ الأيزوفلورين لمدة 5 إلى 10 دقيقة.
  3. وضع الحيوان على طاولة التجسيمي مع سادة التدفئة والتحقيق المستقيم للحفاظ على درجة حرارة الجسم إلى 37 درجة مئوية. استخدام مخروط الأنف للحفاظ على التخدير مع 2٪ الأيزوفلورين. تأمين رأس فأر باستخدام قضبان الأذن وحامل الأسنان.
  4. تطبيق العيون مرهم أو قطرة العين، والتي تشمل 1٪ الأتروبين قطرات للمساعدة في اتساع حدقة العين. لمنع جفاف، وتطبيق التشحيم قطرةق تقريبا كل 30 دقيقة.
  5. حلق الرأس وتنظيفه مع 10٪ بوفيدون اليود.
  6. لتخدير موضعي، حقن 0.5 مل من 2٪ ليدوكائين تحت فروة الرأس في 2-3 المواقع من خلال رفع البشرة وإدخال رأس الإبرة.
  7. تأكيد مستوى كاف من التخدير عن طريق إجراء قرصة أخمص قدميها، ومراعاة قلة الحركة. بالإضافة إلى ذلك، رصد معدل ضربات القلب لضمان وجوده ضمن القيم الطبيعية (300-400 نبضة / دقيقة).
  8. شق فروة الرأس في خط مستقيم على طول المتوسط ​​مع # شفرة 10 مشرط لفضح كل من الغرز الاكليلية والسهمي.
  9. الكشف عن لامبدا وBregma نقاط عن طريق دفع جانبا الأنسجة التي تغطي الجمجمة مع ملعقة الجراحية.
  10. مستوى الجمجمة بحيث Bregma وامدا مواقع على نفس الطائرة.
  11. لتعيين نقطة مرجعية، استخدام جهاز التجسيمي مع أنبوب زجاجي لنصرة تعيينها الحق فوق Bregma. وستكون هذه هي "صفر" لل-انتيرو الخلفي وميدتنسق القياسات الاتحاد العالمي للتعليم الأطراف.
  12. تعيين نقطة من الفائدة عن طريق تحريك التجسيمي جبل لالإحداثيات المطلوبة، لاحظ الإحداثيات التجسيمي ورسم مربع حول المنطقة المستهدفة الذي يصادف حيث سيتم إجراء حج القحف.
  13. استخدام الحفر الجراحية مع تدريبات تعقيمها على طول ساحة ملحوظ ببطء من دون ضغوط لإزالة ببطء المواد العظام. يجب الحرص على عدم حفر وقتا طويلا في نفس المنطقة، كما أنه سيتم إنتاج الحرارة ويسبب تقرحات على القشرة.
  14. عندما العظام ترسيم حج القحف قد تصبح رقيقة بما فيه الكفاية، وإزالة بعناية القسم الجمجمة مع ملاقط لفضح القشرة.
  15. ري في كثير من الأحيان القشرة يتعرض مع الاصطناعي السائل الشوكي الدماغي لمنع جفاف الأنسجة.
    ملاحظة: إزالة جافية غير ضرورية على الفئران كما غيض من injectrode هو قوي بما فيه الكفاية لاختراق.

3. التعبئة و تركيب نظام حقن

  1. ملء5-10 ميكرولتر محقنة مكروية بواسطة الشفط مع الزيوت المعدنية.
  2. شغل الإبرة تحت الجلد مع ماصة زجاجية ثابتة بمحلول مكون من 0.5٪ شيكاغو السماء الزرقاء (ديوان الخدمة المدنية) و 300 ميكرومتر-γ الغاما حمض (GABA) أو محلول 2٪ ليدوكائين مع 0.5٪ ديوان الخدمة المدنية 9. تمييع كل الحلول بمحلول ملحي.
    1. في حالة وجود مادة وفيرة، وملء باستخدام حقنة العادية واستخدام التقنيات الوقائية المعتادة لتجنب تشكيل فقاعات الهواء.
    2. في حالة المواد أكثر تكلفة، واستخدام الزيوت المعدنية لملء injectrode ويمكن بعد ذلك قدم وكيل الكيميائي بواسطة الطموح. كما الفرق بين كثافة الزيوت المعدنية والمياه مرتفع نسبيا، وهذا الجوهر هو مرشح جيد لحقن المحاليل المائية.
      ملاحظة: يمكن إضافة صبغة لتأكيد الفصل بين كل من السوائل.
  3. لملء ماصة الحقن، وملء حقنة 1 مل مع الحل بواسطة الشفط ثم حقن ببطء الحلفي ماصة الحقن.
  4. إيلاء اهتمام دقيق للكشف عن التسربات في المناطق المشار إليها في الشكل رقم 1 عن طريق المسح هذه المناطق نظيفة ومراقبة التسرب عن طريق زيادة ضخ المحلول ببطء مع الحقنة.
  5. إزالة حقنة 1 مل. عند القيام بذلك، تأكد للحفاظ على الضغط الخفيف على المكبس ذلك أن الفراغ لا يزيل الحل من ماصة الحقن.
  6. ملء محقنة مكروية مع الزيوت المعدنية بواسطة الطموح ونعلق عليه بقوة لحقن ماصة شغلها، ثم يمسح بعناية بعيدا أي حل الزائدة من injectrode تجميعها مع الشاش.
  7. تحقق من أن طرف لا يتم حظر عن طريق حقن كمية صغيرة جدا، يكفي أن نرى قطرة صغيرة في تشكيل غيض من ماصة الزجاج.
  8. تحميل injectrode على النظام MICROPUMP وتأكد من أنه ثابتة بشكل جيد.
  9. وضع بعناية غيض injectrode في إحداثيات الهدف وخفض تلميح إلى سطح القشرة.
  10. انخفاض ببطء injectrقصيدة باستخدام جهاز التجسيمي إلى هيكل الهدف (أكيمة متفوقة في هذه الحالة) باستخدام إحداثيات التشريحية المناسبة.
  11. تغطية قشرة يتعرض مع أجار الدافئ لمنع جفاف الأنسجة.

4. حقن والتعطيل عكوس

  1. ضبط مضخة microinjection لحقن 400-800 NL في 40 نيكولا لانغ / دقيقة، ثم اضغط تشغيل لبدء الحقن. ملاحظة أن معدل ارتفاع تظهر لحد من خلال الحقن.
    ملاحظة: في الإعداد التجريبية، تعافى النشاط العصبي في غضون ساعة بعد انتهاء تسليم GABA. أي جهاز ميكانيكي معايرة يمكن استخدامها للضغط على حقنة microinjection من أجل إجراء الحقن.
  2. بعد الحصول على البيانات الكهربية، الموت ببطء باستخدام أسلوب معتمد من قبل الحيوان أخلاقيات المجتمع المحلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتضح بناء injectrode في الشكل 1. الأسلاك الفضية (C) تغذي ماصة الزجاج (D) مع جزء من عازمة الأسلاك وجاحظ الخروج من الافتتاح. وترد إبرة 30 G (B) ومختومة إلى افتتاح ماصة الزجاج مع الغراء. بعد أن تم شغلها ماصة مع مادة الحقن، ويتم إرفاق حقنة الزجاج الصغيرة (A) إلى الإبرة. فمن المهم أن هناك ختم جيدة حيث يربط حقنة صغيرة مع إبرة (E) وحيث سلك الفضة يبرز من ماصة الزجاج (F). يبين الشكل 2 صورة ما تبدو مثل injectrode بعد الانتهاء من التجمع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تصميم البروتوكول المقترح لمواجهة التحديات الناجمة عن أساليب التعطيل عكسها الحالية. على وجه التحديد، يهدف هذا المشروع إلى تحسين الطرق المستخدمة للإبر دقيقة جدا الكيميائية للمواد تحوير النشاط العصبي، وخاصة في هياكل الدماغ العميقة. وثمة تحد تقني الناشئة من هذا النوع من الإعداد هو الحاجة لكلا تحقيقات أن colocalized في نفس مساحة محدودة في الجسم الحي من أجل استخلاص التسجيلات دقيقة في موقع الحقن. ويمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق استخدام الأجهزة، مثل تلك التي قدمت هنا،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا ما نكشف عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مدعوم بمنح من CIHR (MOP231122) و NSERC (RGPIN-2014-06503). نود أن نشكر جينيفيف سير على مساعدتها في إعداد التجارب والإشراف على العمل المختبري. حصلت MAL على منحة دراسية من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (NSERC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مضخة الحقن (UltraMicroPump III)WPI#UMP3
وحدة التحكم في الحقن (وحدة تحكم Micro4)WPI#SYS-MICRO4
حقنة هاميلتونHamliton(80301) 701LT 10 & micro ؛ محاقن L SYRبين 5 و 10 مو ؛ ل تستخدم
لاصق بلاستيكي مرنLepage 393915شكل الجل أسهل في التطبيق على عمود 30 & nbsp ؛ إبرة G تحت الجلد تشكل ختما مقاوما للماء عندما تجف.
الماصات الزجاجيةWPI#TW100F-4جدار رقيق ، 1 & nbsp ؛ مم OD, 0.75  معرف مم مع ماصات خيوط تستخدم
720 مجتذب ماصة إبرةKopf720
سلك فضيAM، Inc.782500عارية 0.010 "

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martin, J. H., Ghez, C. Pharmacological inactivation in the analysis of the central control of movement. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 145-159 (1999).
  2. Ponce, C. R., Hunter, J. N., Pack, C. C., Lomber, S. G., Born, R. T. Contributions of indirect pathways to visual response properties in macaque middle temporal area MT. The Journal Of Neuroscience The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (10), 3894-3903 (2011).
  3. Lomber, S. The advantages and limitations of permanent or reversible deactivation techniques in the assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 109-117 (1999).
  4. Malpeli, J., Schiller, P. A method of reversible inactivation of small regions of brain tissue. Journal Of Neuroscience Methods. 1 (2), 143-151 (1979).
  5. Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: an adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 179-194 (1999).
  6. Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quiñones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. Journal Of Visualized Experiments. (46), (2010).
  7. Hupé, J., Chouvet, G., Bullier, J. Spatial and temporal parameters of cortical inactivation by GABA. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 129-143 (1999).
  8. Casanova, C., McKinley, P., Molotchnikofff, S. Responsiveness of Reorganized Primary Somatosensory (SI) Cortex after Local Inactivation of Normal SI Cortex in Chronic Spinal Cats. Somatosensory & Motor Research. 8 (1), 65-76 (1991).
  9. Malpeli, J. Reversible inactivation of subcortical sites by drug injection. Journal Of Neuroscience Methods. 86 (2), 119-128 (1999).
  10. Minville, K., Casanova, C. Spatial frequency processing in posteromedial lateral suprasylvian cortex does not depend on the projections from the striate-recipient zone of the cat’s lateral posterior-pulvinar complex. Neuroscience. 84 (3), 699-711 (1998).
  11. Diao, Y., Wang, Y., Xiao, Y. Representation of the binocular visual field in the superior colliculus of the albino rat. Experimental Brain Research. 52 (1), 67-72 (1983).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Electrophysiological RecordingMicro injectionsInjectrode ConstructionSuperior ColliculusGABA SolutionGlass PipetteHypodermic NeedleSilver WireMicrosyringe PumpMulti unit Activity

مقالات ذات صلة