الهدف من هذه التقنية هو تمكين الباحثين من إجراء تشريح وتلطيخ مناعي وتركيب أقراص عين العذراء من ذبابة الفاكهة السوداء في أي عمر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ذبابة الفاكهة هو نظام قوي يمكن استخدامه لدراسة العديد من العمليات البيولوجية المختلفة. يحتوي على ما يقرب من 800 وحدة عينية منفصلة ، تسمى ommatidia1. يحتوي كل أوماتيدييوم على ثمانية مستقبلات ضوئية عصبية تتطور من خلايا غير متمايزة بعد مرور الأخدود المورفوجيني في الطور اليرقيالثالث 2. بعد التمايز المتسلسل للمستقبلات الضوئية ، تتطور الخلايا غير العصبية ، بما في ذلك الخلايا المخروطية والخلايا الصبغية ، جنبا إلى جنب مع الخلايا ذات الشعر الخشن الحسيةالميكانيكية 3. تحدث عمليات التمايز النهائية ، بما في ذلك الترتيب المنظم لجميع أنواع الخلايا القطنية ، وموت الخلايا المبرمج لأنواع الخلايا غير المتمايزة وتعبير رودوبسين ، من خلال المرحلة العذراء4-7. تركز هذه التقنية على معالجة قرص عين العذراء ، وتوفير نظرة ثاقبة وتعليمات حول كيفية تشريح قرص العين أثناء مرحلة العذراء ، والتي يصعب بطبيعتها إجراء أكثر من قرص العين الطور الثالث الذي يتم تشريحه بشكل شائع. توفر هذه التقنية أيضا تفاصيل حول التلوين المناعي للسماح بتصور البروتينات المختلفة ومكونات الخلايا الأخرى.
المقدمة
مجالات البيولوجيا التطورية والخلايا قد تأثرت إلى حد كبير من قبل كائن نموذج: ذبابة الفاكهة السوداء البطن. ضمن هذا النموذج، وقد ساهمت الدراسات القرص العين على قدر كبير من المعرفة فيما يتعلق الإشارات، بيولوجيا الخلية وغيرها من المناطق. وقد درس الراحل ثالث اليرقات القرص الطور العين وعلى نطاق واسع هو نموذج قوي للاستفادة، كما أنه يعطي لمحة عن سلسلة من الفترات التنموية، مع كل جزيئاته الإشارات الفريدة الخاصة والعمليات، كما تقدم ثلم المخلق عبر القرص العين 8. ومع ذلك، هناك حاجة إلى توسيع فهمنا للعمليات التنموية في مرحلة العذراء للتنمية. في حين كانت هناك دراسات على القرص عين العذراء 3-7 والمعرفة لدينا لا تقترب من اتساع نطاق العمل الذي تم القيام بها على القرص الثالث الطور العين. ويرجع ذلك، في جزء منه، إلى صعوبة أكبر في تشريح العين القرص العذراء. لذا، عرضا للالأسلوب السليم للتشريح يمكن أن يتوسع كثيرا من البحوث في هذا المجال.
في حين أن هناك مراحل في تطوير القرص عين العذراء التي يتم تشريح بسهولة، وخاصة حول فترة منتصف العذراء، وفترات زمنية أخرى هي أكثر تحديا لتشريح. هذا البروتوكول يمثل طريقة واحدة لتشريح أقراص عين العذراء التي يمكن استخدامها عالميا لجميع الأطر العذراء الوقت التنموية. هذا البروتوكول يمكن استخدامها كبديل للبروتوكول آخر 9 يبين طريقة أسهل وأسرع لتشريح أقراص العين من النقاط الزمنية midpupal. تم تصوير هذا البروتوكول أصلا وضعت لتدريب طلاب المرحلة الجامعية المتقدمة في جامعة كاليفورنيا الجامعية اتحاد البحوث في علم الجينوم الوظيفي (URCFG) 10،11 في تقنية العذراء تشريح العين. كانوا قادرين على الاستفادة من هذا الفيديو وطريقة لتعلم هذه التقنية الصعبة العديد من الطلاب الجامعيين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
هذا الإجراء هو إجراء 2 يوم.
يوم 1 (2 ساعة + تشريح الوقت)
1. العذراء القرص تشريح العين
- حدد خادرة للتشريح.
ملاحظة: عمر خادرة أن تشريح ستحدده الاحتياجات التجريبية. ومع ذلك، إذا فحص مورفولوجيا الخلية، وهذا كثيرا ما يتم في 42 ساعة بعد تشكيل puparium (APF) عند 25 درجة مئوية، وهو عمر الشرانق يظهر في شريط الفيديو. جمع الشرانق الأبيض (APF اعتبر 0 ساعة) مع الفرشاة المبللة وترتيبها حسب التسلسل الزمني (على أساس جمع الوقت) في جديدة قارورة ذبابة المواد الغذائية حافظت على 25 درجة مئوية. تشريح الشرانق العمر في نفس هذا الترتيب الزمني للحفاظ على فروق التوقيت بين الشرانق في أقرب وقت ممكن. - نقل خادرة إلى قطرة من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4، انظر المواد للصفة) على لوحة سيليكون تشريح.
- عقد الجزء العلوي من حالة العذراء مع ملقط وبيرس وفتح لOWER جزء من حالة العذراء مع زوج من ملقط حادة. إزالة خادرة من الحال في حفرة تشكلت حديثا.
- اجراء خفض قطري مع مقص، منتصف الصدر، في خادرة. إزالة الحطام أو نقل رئيس خادرة إلى انخفاض جديد من برنامج تلفزيوني. نظيف باستخدام ماصة أنبوب منفاخ (انظر المواد والشكل 1 لمزيد من التفاصيل) وإضافة برنامج تلفزيوني إضافية حسب الحاجة. تأكد لتجنب الجفاف.
- قبضة آمن الجزء العلوي من رأسه إهاب العذراء مع زوج من ملقط. باستخدام غيض من أنبوب منفاخ، ودفع بلطف على حالة العذراء لبثق المخ والأنسجة الأخرى، بما في ذلك أقراص العين، للخروج من حالة العذراء. تأكد من تجنب الاستيلاء على أي نوع من الأنسجة داخل بشرة.
- باستخدام أنبوب منفاخ مليئة PBS، ضربة بلطف أنسجة الجسم الدهون وغيرها من الحطام للخروج من حالة الرأس لفصل بوضوح والتعرف على أقراص الدماغ والعين.
ملاحظة: سيتم الحفاظ على الدماغ تعلق على حالة رئيس العذراء يسمح الباحث لانه يستخدمحالة الإعلان بأنه "مقبض" للتلاعب في المستقبل من الأنسجة دون الإضرار أقراص العين أو الدماغ. ومع ذلك، فإنه من الشائع لإزاحة أقراص الدماغ والعين من الرأس وهذه الحالة ليست ضارة لإجراء الشامل والنتائج. وعادة ما يستغرق عدة محاولات للنفخ ودفع لاستخراج بنجاح الأقراص العين والدماغ من داخل حالة رئيس العذراء وبحيث تكون منفصلة عن الأنسجة المحيطة بوضوح. وأنظف وأكثر واحد منفصل يمكن الحصول على أقراص العين من الأنسجة المحيطة بها سوف تساعد على منع الأنسجة الغريبة من تحديد إلى أقراص العين. - بعد التشريح، ونقل على الفور إلى الأنسجة طبق زجاج 3 جيدا على الجليد مع 0.5 مل من محلول فيكس (انظر المواد). تطفو على الأنسجة على السطح من الحل فيكس لبضع دقائق (عادة الوقت الذي يستغرقه لتشريح المجموعة التالية من أقراص العين).
ملاحظة: إذا لم يكن هذا أول قرص العين ليتم تشريح في هذه الجولة من تشريح، completelذ غمر القرص العين السابق في حل فيكس. إن القيام بإجراءات تلطيخ الخاصة (على سبيل المثال، أنواع الاكسجين التفاعلية، الجسيمات الحالة، الخ) يجب أن يتم ذلك قبل التثبيت. من أجل القيام بذلك، تخزين أقراص تشريح العين في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة قبل الاستمرار مع بروتوكول تلطيخ المناسب. - بعد تشريح وغمر جميع أقراص يجري تشريح العين، تحريك الطبق الزجاجي 3 بالإضافة إلى الروك والروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
2. المناعية
- إزالة بعناية الحل فيكس وإضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني مع 0.3٪ تريتون X-100 (0.3٪ PBT، انظر المواد) وغسل الأنسجة على الكرسي الهزاز لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات أكثر ليصبح المجموع 4 يغسل (10 دقيقة لكل منهما).
ملاحظة: إزالة بعناية من الحل من البئر يمكن إجراء تشريح تحت المجهر لمنع تلف الأنسجة أو الخسارة. يمكن أن يستنشق الحل بعناية مع الماصة. نحن نفضل-tippe غرامةد، يمكن التخلص منها نقل الماصة التي تمت زيارتها فتح بالارض لتقليل فرصة الشفط الأنسجة. - في نهاية غسل 4، وإزالة غسل وإضافة 0.5 مل من محلول كتلة (انظر المواد) إلى البئر واحتضان لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: يمكن تمديد هذا الإطار الزمني وفقا لاحتياجاتك. - في نهاية الوقت كتلة 30 دقيقة، الماصة 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة الحل الابتدائية (مخففة في حل بلوك) إلى العدد المناسب من الآبار في لوحة microwell.
ملاحظة: سيكون أحد بئر من لوحة microwell تستوعب حوالي 4 أزواج من أقراص العين التي تعلق على حالة العذراء أو 8 أزواج منعزلة من أقراص العين مع العقول المرفقة. الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذا البروتوكول لبيانات تمثيلية هي مكافحة فسفوتيروزين (1: 500 تمييع) ومضادة للقطع (1: 200 تمييع). - نقل الأنسجة تشريح في الآبار لوحة microwell مليئة الجسم المضاد الحل الأساسي من الطبق الزجاجي 3 أيضا.
- مكانلوحة microwell على منشفة ورقية مبللة (لمنع الجفاف) في علبة فارغة طرف الماصة (أو حاوية أخرى مماثلة) وتخزينها في 4 درجات مئوية خلال الليل.
يوم 2 (4 + ساعة الوقت التركيب)
- نقل الأنسجة من لوحة microwell إلى 3 جيدا طبق زجاج جديد مع 0.3٪ PBT (≈0.5 مل)، وغسل الأنسجة لمدة 10 دقيقة على الروك. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات أكثر ليصبح المجموع 4 يغسل (10 دقيقة لكل منهما)
- إزالة غسل الماضي وإضافة 0.5 مل من محلول بلوك إلى البئر. منع لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: يمكن تمديد هذا الإطار الزمني وفقا لاحتياجاتك. - إزالة كتلة الحل وإضافة 0.5 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية (مصنوعة من الأجسام المضادة fluorescently المسمى المناسبة لالضد الخاص الابتدائي والطول الموجي الفلورسنت، مخففة في حل بلوك) إلى البئر وحماية طبق زجاج 3 جيدا من الضوء مع غطاء أو الألومنيوم احباط واحتضان لمدة لا تقل عن 2 ساعة في غرفةدرجة الحرارة.
ملاحظة: جميع الخطوات اللاحقة ينبغي حماية بالمثل من التعرض للضوء. هذه الحضانة يمكن تمديدها ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية، في الإعداد مماثل للحضانة الأجسام المضادة الأولية، ولكن يمكن أيضا أن يؤديها في طبق زجاج 3 جيدا مغطاة فيلم المختبر، أو لوحة microwell إذا كان المطلوب المحافظة على الأجسام المضادة. - في نهاية الحضانة الضد، وإزالة الأجسام المضادة الثانوية الحل وإضافة 0.5 مل من 0.3٪ PBT إلى البئر وتغسل على الروك لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة ليصبح المجموع 4 يغسل (10 دقيقة لكل منهما).
ملاحظة: إذا كان المطلوب تلوين دابي، قبل البدء في غسل الأولى، إضافة 0.5 ميكرولتر من محلول المخزون دابي (انظر المواد) إلى 500 ميكرولتر من PBT التي سيتم استخدامها لغسل الأولى (1: 1،000 التخفيف).
3. تركيب
- في نهاية غسل الماضي، تركيب أقراص antennal / العين على شريحة باستخدام 70٪ الجلسرين أو برنامج تلفزيوني كوسيلة لإزالة رعين والأنسجة الأخرى غير المرغوب فيها في بركة على جانب واحد من الشريحة.
- تحرك بحذر الأنسجة باستخدام الضغط الهيدروليكي بين ملقط، أو بلطف شديد مع طرف الملقط، ويصطف على أقراص العين في عمود نحو وسط الشريحة.
- إزالة جميع الجلسرين دخيلة أو برنامج تلفزيوني من جميع أنحاء الأنسجة (باستخدام إجراءات فتل مختبر مسح أو ملقط لهذا العمل).
- ضع كمية صغيرة (≈10 ميكرولتر) من تصاعد المتوسطة على طول جانب واحد من العمود قرص العين ووضع ساترة على الأنسجة وذلك لنشر المتوسطة المتزايدة على أقراص العين.
- ترك الجلوس الشريحة من 1 إلى 2 دقيقة للسماح للأنسجة / متوسطة متزايدة لتنتشر بشكل كامل.
- يمسح أي وسيلة إضافية متصاعدة خارج من حول حواف ساترة وختم ذلك مع طلاء الأظافر واضحة.
- التقاط الصور الفلورسنت من أقراص العين باستخدام متحد البؤر المجهري.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كمثال لاستخدام هذا البروتوكول، توضح النتائج midpupal (42 ساعة APF عند 25 درجة مئوية) أقراص العين immunostained مع الأجسام المضادة المختلفة ترد في الشكل 2. باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد بقايا فسفوتيروزين، غشاء الخلايا يمكن أن يكون الملاحظ (الشكل 2A). وهذا يمكن أن تستخدم لتحديد الترتيب المنتظم للخلايا ommatidial في عين العذراء في أعقاب عمليات الزخرفة النهائية التي تحدث قبل مرحلة midpupal. يصور صورة ممثل آخر يمكن أن يتم تحديد نوى الخلايا المخروطية باستخدام الأج...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بينما يبدو أن العملية بسيطة وسهلة التنفيذ ، في الواقع ، تتطلب هذه التقنية قدرا كبيرا من الممارسة لإتقانها. بشكل روتيني ، نبدأ الطلاب بتعلم تشريح وتركيب أقراص العين الثالثة12 ، والتي يسهل التعامل معها. تساعد هذه الممارسة على تطوير وضع تشريح مناسب للذراعين واليدين والأصابع13 بحيث يكون التلاعب بالملقط تحت مجهر التشريح مستقرا وسهلا وذا خبرة. في جوهرها ، يجب أن تحقق فترة التدريب هدف جعل الملقط امتدادا طبيعيا للأصابع والإبهام ، مما يسمح بالحركات المنفصلة والدقيقة المطلوبة في التشريح.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نقدر ونود أن نشكر معهد هوارد هيوز الطبي على جائزة أستاذ HHMI إلى جامعة كولومبيا والتي جعلت هذا المشروع ممكنا. نشكر الكلية في جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس على توفير المرافق ودعم البنية التحتية التعليمية لهذا العمل. تم دعم العمل أيضا بتمويل من جامعة Midwestern وتبرع سخي من صندوق هدايا الإخلاص الخيري. نشكر جون فاندن بروكس على التعليقات على المخطوطة وكريستا بيرمان على مساعدتها الفنية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة 7.4) | 80 جم كلوريد الصوديوم ، 2 جم & nbsp ؛ KCl ، 14.4 جم Na2< / sub>HPO4 ، 2.4 جم KH2PO4 ، إحضار الحجم إلى 1 &# 956 ؛ ل ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 ، أو تعقيم الأوتوكلاف أو المرشح ، وقم بتخفيفه إلى 1x PBS مع تعقيم ddH2< / sub>O قبل الاستخدام. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | تحذير: مهيج! ارتد القفازات. |
| 0.3٪ PBT | 1.5 مل من Triton X-100 ، 500 مل 1X PBS. | ||
| 37٪ محلول الفورمالديهايد | فيشر F75P1GAL العلمي | تحذير: مادة مسرطنة للإنسان سامة ومحتملة! ارتداء القفازات. | |
| حل الإصلاح | (≈ 4٪ الفورمالديهايد في PBS) 50 & مو ؛ ل من 37٪ الفورمالديهايد ، 450 مو ؛ ل 1x PBS ، اجعلها طازجة قبل الاستخدام | ||
| الأجسام المضادة والمقايسات | لمصل الماعز | Rockland B304 | Aliquot في أحجام 1 مل وتخزينها عند -80 & # 176 ؛ C |
| Block Solution | 10٪ NGS في PBT. ؛ يمكن صنع هذا وتخزينه عند 4 درجات ؛ C لبضعة أيام قبل الاستخدام. | ||
| حل مخزون DAPI | Life Technologies | D3571 | لنوى coutnerstaining. تحضير محلول 1 مجم / مل مع ddH 2 < / sub >O. |
| VectaShield تصاعد | مختبرات ناقلات متوسطة | H-1000 | تصاعد متوسط |
| الجلسرين | Sigma | G5516 | للتركيب. تحضير تخفيف 70٪ باستخدام ddH2< / sub>O. |
| معدات | |||
| خلاط الجوز | VWR | 82007-202 | تستخدم لصخور الأنسجة في 3 أطباق زجاجية |
| جيدة SylGard 182 مجموعة المطاط الصناعي المصنوعة من السيليكون | Krayden | NC9897184 | تستخدم لصنع طبق تشريح السيليكون |
| تشريح | السيليكونامزج مجموعة المطاط الصناعي Sylgard (أعلاه) وفقا للإرشادات برفق (لتجنب الفقاعات). يسكب المزيج في طبق بتري (أي حجم). اسمح ل SylGard بالشفاء بين عشية وضحاها في 37 درجة ؛ حاضنة C. | ||
| 3 أطباق زجاجية | جيدة Corning | 7220-85 | لم تعد مجموعة متنوعة من 3 آبار متوفرة ، وهذا هو منتج 9 آبار. |
| 72 بئر ميكروويل ميني صينية | Nunc | 438733 | |
| ملقط حاد (Dumont # 55) | أدوات العلوم الدقيقة | 11255-20 | |
| مقص صغير من نوع Vannas ، مستقيم ، شفرة 5 مم | Ted Pella | 1346 | |
| 100 مم شعيرات دموية زجاجية من البورسليكات | World Precision Instruments | 1B100-4 | اسحب باستخدام مجتذب إبرة لعمل طرف نقطة دقيقة يسمح بتيار صغير من PBS بالتدفق. |
| ماصات النقل التي يمكن التخلص منها ، طرف غرامة | سامكو العلمية | 231 | |
| الأنابيب المعطاة هي القطر الداخلي (ID) × القطر الخارجي (OD) × سمك الجدار بالبوصة | |||
| أنابيب PVC (1/8 × 3/16 × 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | استخدمها مع إبرة مسحوبة لتجميع أنبوب المنفاخ كما هو موضح في الشكل 2. |
| أنابيب سيليكون Tygon (3/32 × 5/32 × 1/32) | Gobain Performance Plastics | ABW00004 | |
| Tygon Silicone tubing (1/32 × 3/32 × 1/32) St | Gobain Performance | Plastics ABW00001 |
المراجع
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential adhesion mediated by Hibris and Roughest regulates morphogenesis and patterning in the Drosophila eye. Dev cell. 8 (6), 925-935 (2005).
- Grzeschik, N. A., Knust, E. IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin. Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454 (7203), 533-537 (2008).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40 (4), 851-858 (1985).
- Voas, M. G., Rebay, I. Signal integration during development: insights from the Drosophila eye. Dev Dyn. 229 (1), 162-175 (2004).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. J Vis Exp. , 4347(2012).
- Call, G. B., et al. Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes. Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3 (2), 59(2005).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. 37, 1936(2010).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
