التكاثر الشبيه بالبريون لمجاميع البروتين على أنه متورط في العديد من الأمراض التنكسية العصبية. الهدف من هذا البروتوكول هو وصف كيفية استخدام الديدان الخيطية C. ايليجانس كنظام نموذجي لمراقبة انتشار البروتين والتحقيق في الظواهر الشبيهة بالبريون.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحقيق في نشر وسمية البروتينات مثل بريون باستخدام Metazoan نموذج حي
في هذه المقالة
ملخص
ظهر مؤخرا
الملخص
Prions هي جزيئات بروتينية غير تقليدية ذاتية الانتشار ، خالية من أي حمض نووي مشفر. تعمل هذه البذور البروتينية كقوالب لتحويل وتكرار شكلها الإسوي الخلوي الحميد. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن العديد من مجاميع البروتين يمكن أن تعمل كقوالب ذاتية التكاثر وتفسد طي البروتينات المتشابهة. على الرغم من أن المجاميع يمكن أن تكون وظيفية في ظل ظروف معينة ، إلا أن هذه العملية غالبا ما تؤدي إلى تعطيل توازن البروتين الخلوي (البروتين) ، مما يؤدي في النهاية إلى أمراض مدمرة مثل مرض الزهايمر (AD) أو مرض باركنسون (PD) أو التصلب الجانبي الضموري (ALS) أو اعتلال الدماغ الإسفنجي المعدي (TSEs). لا تزال الآليات الدقيقة لتكاثر البريون وانتشار مجاميع البروتين من خلية إلى خلية تخضع لبحث مكثف. لتعزيز هذه المعرفة ، تم مؤخرا إنشاء نموذج ميتازوان جديد في Caenorhabditis elegans ، للتعبير عن مجال البريون لبروتين بريون الخميرة العصارية الخلوية Sup35. يوفر نموذج البريون هذا العديد من المزايا ، حيث يسمح بالمراقبة المباشرة لمجال البريون الموسوم بالفلورسنت في الحية وسهولة الأساليب الجينية. موصوفة هنا هي طرق لدراسة السلوك الشبيه بالبريون لمجاميع البروتين وتحديد معدلات السمية التي يسببها البريون باستخدام C. ايليجانس.
المقدمة
وترتبط العديد من الأمراض العصبية، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD)، ومرض باركنسون (PD)، الضموري العضلي التصلب الجانبي (ALS)، والاعتلال الإسفنجي المعدية (TSEs)، مع البروتينات المعرضة للتجميع، وبالتالي تعرف باسم البروتين misfolding اضطرابات (تطوير إدارة الأداء ). TSEs أو أمراض بريون تشكل فئة فريدة من تطوير إدارة الأداء في أنها يمكن أن تكون معدية في كل من البشر والحيوانات 1. على المستوى الجزيئي، والبريونات تكرار من خلال تجنيد وتحويل أحادى α-الحلزون الغنية المشفرة المضيف بي ار بي الخلوي (بي ار بي C) في المرضية ورقة β الغنية بي ار بي الشوري التشكل 2،3. وقد تم تحديد المجاميع البروتين نشر النفس ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. رصد العابر للنشر من البروتينات مثل بريون بواسطة فيفو في الوقت الفاصل بين التصوير
ملاحظة: تنمو C. ايليجانس البرية من نوع (WT) (N2) وخطوط المعدلة وراثيا وفقا للأساليب القياسية ومراقبة بعناية درجة حرارة زراعة 47.
- توليد خطوط المعدلة وراثيا من C. ايليجانس معربا عن البروتين مثل بريون، الموسومة ب أحادى البروتين الفلوري الأحمر (mRFP). مشاهدة هذا الفيديو الذي يوضح كيفية استخدام حقن مكروي 48. لمزيد من التفاصيل والأساليب التي تصف ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
مراقبة بيخلوي نشر من البروتينات مثل بريون من قبل في الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير
المعدلة وراثيا C. خطوط ايليجانس معربا عن المجال بريون بشكل خاص مناسبة تماما لتحليل جوانب معينة من مثل بريون البروتينات، على سبيل المثال، نقل خلية الى خلية خلية وغير سمية مستقلة. شفافية الحيوانات تمكن من تتبع الموسومة fluorescently البروتينات من داخل الكائن الحي في كل مرحلة م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الأساليب المذكورة هنا تساعد على توضيح نشر والخلية معقدة المستقلة وغير المستقلة سمية الخلايا من البروتينات مثل بريون. اكتشفنا مؤخرا أن يؤخذ على عصاري خلوي مجال بريون المعرضة للتجميع ما يصل إلى الحويصلات بغشاء في عملية الالتهام الذاتي ذات الصلة. مجموعة فرعية معينة من هذه الحويصلات تنقل المجال بريون داخل وبين الخلايا والأنسجة 40. المفتاح لمراقبة حركتهم في الحيوان يعيش هو أن البروتين يجب أن يكون ذات الكلمات الدلالية مع mRFP، فقط لأن البروتينات mRFP الموسومة كانت واضحة في هذ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
نشكر سيندي فوازين ويوكو شيباتا على المناقشة المفيدة والتعليقات النقدية على المخطوطة. نحن نقدر مختبر تحليل الإنتاجية العالية (HTAL) ومرفق التصوير البيولوجي (BIF) في جامعة نورث وسترن لمساعدتهم. تم تمويل هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (NIGMS ، NIA ، NINDS) ، مؤسسة إليسون الطبية ، ومؤسسة Daniel F. و Ada L. Rice (إلى R.I.M.). C.I.N.-K. بدعم من Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726 / 1-1).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| معايير حجم الكرة النانوية 100 نانومتر | ThermoScientific | 3100A | |
| Levamisole | Sigma | L-9756 | |
| IPTG | Sigma | 15502-10G | |
| Ahringer RNAi | مكتبة المصدر BioScience LifeSciences | http://www.lifesciences.sourcebioscience .com / clone-products / non-mammalian / c-elegans / c-elegans-rnai-library / | |
| معدات | |||
| Sorvall Legend XTR جهاز طرد مركزي مبرد ، 120VAC | ThermoScientific 75004521 | http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC / EW-17707-60 | |
| 96 دبوس النسخ المتماثل | Scionomix | http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/ | |
| HiGro عالية السعة ، احتضان شاكر | موزع كاشف ديجيلاب | http://www.digilabglobal.com/higro | |
| Multidrop Combi | محطة العمل الآلية Titertrek | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm | |
| Biomek FX AP96 | بيكمان كولتر | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm | |
| Innova44 شاكر | نيو برونزويك | http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04 & الإجراء = المنتجات و contentid = 1 & catalognode=83389 | |
| M205 FA | Leica | http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/ | |
| ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD | Hamamatsu | http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html | |
| الغزل AF مجهر متحد البؤر | كاميرا Leica | http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/ | |
| Falcon 4M60 | Teledyne Dalsa | http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/ | |
| MetaMorph للبرامج | |||
| & برامج تحليل الصور | الجزيئية | http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html | |
| Hamamatsu SimplePCI برنامج تحليل الصور | Meyer Instruments | http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm | |
| ImageJ | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| المكون الإضافي wrMTrck ل ImageJ | http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html | ||
| C. elegans< / em> سلالات | |||
| N2 (WT) | مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570 | |
| AM815 rmIs323 [myo-3p :: sup35 (r2e2) :: rfp] | Morimoto | متاح من مختبرنا ؛ | |
| انظر الجدول 1 للحصول على مصدر لأجهزة الاستشعار القابلة للطي وسلالات |
المراجع
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
