نحن هنا وصف تقنية لدراسة تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة قرن آمون باستخدام تقنية عضوي النمط ثقافة شريحة. هذا الأسلوب يسمح للفي المختبر التلاعب في تكوين الخلايا العصبية الكبار ويسمح التطبيق المباشر من وكلاء الدوائية إلى الحصين مثقف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الثقافات شريحة عضوي النمط لدراسات ما بعد الولادة تكوين الخلايا العصبية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نحن هنا وصف تقنية لدراسة تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة قرن آمون في الدماغ القوارض باستخدام تقنية عضوي النمط ثقافة شريحة. يحافظ هذا الأسلوب التشكل الطبوغرافية المميزة للقرن آمون في حين يسمح التطبيق المباشر من وكلاء الدوائية إلى تطوير التلفيف المسنن قرن آمون. بالإضافة إلى ذلك، الثقافات شريحة يمكن الحفاظ لمدة تصل إلى 4 أسابيع، وبالتالي، يسمح احد لدراسة عملية نضوج الخلايا العصبية الحبيبية حديثي الولادة. الثقافات شريحة تسمح للتلاعب الدوائي الفعال للشرائح قرن آمون مع استبعاد المتغيرات المعقدة مثل عدم اليقين المتعلقة الموقع التشريحي العميق للحصين وكذلك حاجز الدم في الدماغ. لهذه الأسباب، سعينا لتحسين الثقافات شريحة عضوي النمط خصيصا لبحوث الخلايا العصبية بعد الولادة.
المقدمة
يمثل تكوين الخلايا العصبية للبالغين في الحصين الثديي مثالا رائعا على قدرة الدماغ الفطرية على القدرة على التكيف واللدونة. تتولد الخلايا الحبيبية المسننة (DGCs) من مجموعة متجددة من الخلايا السلفية العصبية في التلفيف المسنن للحصين ، وهي واحدة من منطقتين مشخصتين جيدا حاليا في دماغ الثدييات ، ويعتقد أنهما مهمان بشكل خاص للتعلم والذاكرة. الحصين هو جزء من الجهاز الحوفي وله موقع عميق داخل دماغ الثدييات ، مما يجعله هدفا صعبا للتلاعب الدوائي الدقيق. بالإضافة إلى ذلك ، تم تورط تكوين الخلايا العصبية الشاذة في حالات مثل الصرع والفصام ومرض الزهايمر ، مما أثار الاهتمام بفهم تأثير العوامل الدوائية المختلفة أثناء نضوج الخلايا العصبية حديثي الولادة وبقائها. التمييز بين تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة والبالغين غير واضح وقد أظهرت الدراسات السابقة أن العديد من سمات تطور الخلايا العصبية في الجسم الحي في فترة ما بعد الولادة المبكرة والبلوغ متشابهة25. هنا نؤكد على تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة ونقترح تطبيقات محتملة لتكوين الخلايا العصبية للبالغين.
توفر مزارع الشرائح العضوية طريقة فعالة في المختبر لدراسة الخصائص الفسيولوجية المختلفة للحصين الثديي. يمكن تلخيص قيمة مزارع الشرائح المحضرة من أدمغة القوارض في ثلاث صفات رئيسية: 1) البروتوكول مباشر ويتطلب مواد متاحة بسهولة. 2) تسمح الثقافات الشريحة بإجراء دراسات دوائية تقضي على المتغيرات المعقدة مثل الموقع التشريحي العميق للحصين وتتحايل على الحاجز الدمويالدماغي 1 ؛ و 3) يتم الحفاظ على الهيكل المميز جيدا للحصين والدائرة ثلاثيةالتشابك 2. استخدم الباحثون السابقون ثقافة الحصين العضوية لدراسة التطور المشبكي وعلم وظائف الأعضاء3،4 ، وتكوين الخلايا الدبقية5-7 ، وتلف الدماغ الإقفاري8،9 ، والحماية العصبية والإصلاح العصبي10-12 وكذلك الصرع13-15. يمكن أن توفر مزارع الشرائح أيضا نظاما نموذجيا مفيدا يسمح بمراقبة تطور الخلايا جنبا إلى جنب مع وضع العلامات على الخلايا ببروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) أو العلامات الحيوية الأخرى.
تم أيضا استخدام مزارع الشرائح سابقا لدراسة تكوين الخلايا العصبية في الحصين بعدالولادة 16-19 ، ولكن أحد العوامل المهمة في غالبية هذه الدراسات هو التنكس المميز جيدا الذي ينتج عن استخراج الأنسجة من البالغة بعد حوالي أسبوعين في المختبر20،21. لهذا السبب ، يتم تحضير مزارع الشرائح عادة من الفئران المبكرة بعد الولادة (P5-P10) أو صغار الفئران ، والتي تستخدم قابلية الحياة المحسنة لأنسجة المخ المبكرة بعد الولادة لزراعة22. في حين أظهرت الدراسات السابقة أن الحصين المبكر بعد الولادة والبالغين يختلفان فيما يتعلق بفسيولوجيا التشابك والتعبير عن أنواع فرعية معينة من الخلايا العصبية23،24 ، هناك حفظ كبير للبرنامج التنموي المصمم للرقصات التي تمضي فيها الخلايا الحبيبية المسننة حديثي الولادة أثناء النضج25. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت الدراسات الحديثة إلى أن الخصائص الفسيولوجية ل DGCs حديثي الولادة في الثقافة تشبه إلى حد بعيد الخلايا العصبية غير الناضجة في تحضير شريحة الحصينالحادة 16.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تتفق جميع الإجراءات الحيوانية على صحة ورفاهية الحيوان المبادئ التوجيهية من قسم الطب المقارن في جامعة تورونتو.
1. إعداد شرائح الحصين
- تعقيم الأدوات التالية باستخدام الأوتوكلاف جافة في 125 ° C: مقبض مشرط (# 3) (2)، ملقط نمط قياسي، كبير (1)، مشرح مقص صغير (الزاوية إلى جنب) (1)، مايكرو ملعقة (ملعقة وشقة نهايات ملعقة) (1)، مايكرو-ملاعق (مدورة واعتقلت طرفي مدبب) (2)، ودفع غرامة الرسام (1)، مصقول النار ماصة باستير (2)، والساحات شاش، 2 × 2 بوصة (5).
- عندما عقيمة، وطرح الصكوك في وعاء معقم والحفاظ مغطاة حتى الاستخدام. مباشرة قبل التشريح، وتزج الأدوات في حل الايثانول 70٪.
- إعداد لوحة الثقافة 6-جيدا مع إدراج الثقافة قبل البدء في إجراء تشريح عن طريق إضافة 1 مل من مستنبت / جيدا وتخزينها لوحة في الحاضنة عند 35 ° C لالثانية 5٪ CO 2.
2. ترتيب أدوات تشريح في غطاء محرك السيارة العقيمة تدفق رقائقي
- رش غطاء تدفق الصفحي مع 70٪ من الإيثانول وإزالة أدوات تشريح تعقيمها من الكحول. السماح الصكوك لتجف في حين يستريح على طبق بتري معقمة لتجنب الاتصال بين الكحول وأنسجة المخ تشريح.
- إيداع 5-7 مل من محلول معقم تشريح الجليد الباردة في أطباق بتري معقمة 2 الكبيرة. واحدة طبق البرد وتنظيف الرأس (القذرة)، والآخر للتبريد والشطف وحصد من الدماغ (نظيفة). وضع ورقة فلتر تعقيمها في واحدة من الأغطية طبق بتري لتشريح خارج الدماغ.
- وضع، ورق الترشيح صغيرة تعقيمها في واحدة من بتري غطاء صحن صغير لتشريح خارج الحصين. إيداع 3-5 مل من محلول معقم تشريح الجليد الباردة في 2 صغيرة، أطباق بتري معقمة. واحدة طبق عقد الحصين مغروف، واحدة سوف تعقد خلال أقسام فصل أقسام الحصينتحت المجهر تشريح.
- إعداد المروحية الأنسجة عن طريق تسجيل قطعة من ورق الترشيح تعقيم إلى مرحلة القطع وتصاعد شفرة حلاقة معقمة. الرطب ورقة الترشيح مع حل تشريح تعقيمها.
- رش نظيفة كيس الحيوي مع الكحول ووضعه في تدفق الصفحي مقاعد البدلاء النظيفة.
3. الحصين تشريح
- رش الفئران الجرو P7 سبراغ داولي مع الايثانول 70٪ خارج تدفق الصفحي مقاعد البدلاء نظيفة وبسرعة قطع رأس الحيوان باستخدام مقص جراحي معقم كبيرة داخل مقاعد البدلاء تدفق الصفحي. السماح إسقاط رئيس في حل تشريح الجليد الباردة في واحدة من أطباق بتري.
- في طبق بيتري، وشطف قبالة الدم وسرعة نقل الرأس إلى ورق الترشيح تعقيم، الجانب البطني أسفل.
- باستخدام مشرط، وقطع على طول السطح الظهري في المستوى السهمي لفضح الجمجمة الأساسية. قطع طريق الجلد، ولكن ليس العظام الكامنة، التي هي لينة واختراقها بسهولة في الفئران رعمره. نقض هذا "القذرة" مشرط وعدم استخدام على أنسجة المخ.
- باستخدام مقص صغير مشرح (الزاوية إلى جنب) وملقط، وقطع مفتوحة الجمجمة على طول الدرز السهمي من الجمجمة إلى bregma، وهذه النقطة التشريحية على الجمجمة حيث تتقاطع خياطة الاكليلية عموديا من الدرز السهمي. استخدام ملقط لسحب اللوحات الجمجمة وحتى بعيدا عن خط الوسط من الجمجمة.
- ضع ملعقة صغيرة على الجانب السفلي من الدماغ، تحت جذع الدماغ، لرفع بلطف الدماغ من الجمجمة. رفع المخ لفضح الأعصاب البصرية والبصلة الشمية على سطح القاعدية من المخ. قطع هذه الهياكل مع مقص صغير لفصل كامل الدماغ من الجمجمة. إزالة ونقل الدماغ سليمة إلى الآخرين طبق بيتري كبيرة تحتوي على حل تشريح الجليد الباردة.
- باستخدام ملعقة صغيرة، ونقل الدماغ إلى غطاء صغير بيتري صحن يحتوي ورق الترشيح العقيمة. مع ماصة باستور العقيمة، وشطف الدماغ مع بضع قطرات من ديسsecting حل للحفاظ على الأنسجة رطبة.
- باستخدام "نظيفة" شفرة مشرط قطع نصفي الكرة الأرضية على حدة. نقل نصف الكرة المخية الأيسر إلى طبق بيتري كبيرة مع ملعقة صغيرة ووضع نصف الكرة الجانب الحنون عليها في حل تشريح الجليد الباردة لاستخدامها لاحقا.
- عرض الوجه الإنسي النصف الأيمن وتحديد القبو الحافة، عصابة بارزة من المادة البيضاء على طول الحافة وسطي من الحصين. باستخدام مشرط معقم، وجعل خفض السهمي من خلال القبو، ولكن الحرص لسم فقط 0.5 من طرف مشرط ستكون كافية لخفض القبو.
- باستخدام 2 ملاعق صغيرة، وإزالة الحصين الأول من النصف الأيمن عن طريق وضع اليد اليمنى-ملعقة على جذع الدماغ ورفع القشرة الفوقية مع ملعقة الأيسر. رفع بلطف القشرة للكشف عن البطين الجانبي والسطح الإنسي من الحصين. والخط المنحني الأبيض، والخمل، وينبغي أن يكون الآن مرئية.
- محاذاة انحناء ملعقة مع curvaالبنية من الخمل وبلطف اضغط على ملعقة تحت الخمل. حرك ملعقة اليسار وركوب على طول محور منقاري الذيلية ثم ارفع الملعقة في اتجاه والظهرية لإزالة الحصين.
- نقل الحصين إلى 2 طبق بيتري صغير الثانية مع الحل تشريح الجليد الباردة. كرر نفس الإجراء على نصف الكرة المخية الأيسر لإزالة الحصين الأيسر.
- باستخدام ملعقة صغيرة، ونقل بعناية الحصين إلى مرحلة المروحية الأنسجة. ترتيبها المجاورة وموازية لبعضها البعض وعمودي على محور النصل المروحية. استخدام الفرشاة لوضع الأنسجة وإضافة بضع قطرات من الحل تشريح على رأس الحصين.
- قطع الأنسجة في 400 ميكرون شرائح دون التوقف لإزالة شرائح الفردية (عادة أنها لن تنضم إلى شفرة). بعد أن تم قطع الحصين كله، استخدم الفرشاة بلطف لنقل المقاطع ل2 طبق بيتري صغير الثانية مع الحل تشريح.
- تحت الإعلانيةissecting المجهر، فصل بعناية شرائح العائمة باستخدام amicro-ملعقة والفرشاة.
- إزالة لوحة الثقافة معدة سلفا مع إدراج الثقافة من الحاضنة ومكان في غطاء تدفق الصفحي.
- باستخدام ماصة باستير مصقول النار، ورسم 4-5 شرائح في ماصة ونقل شرائح إلى السطح قمية من الغشاء إدراج الثقافة. التالي، وضبط وتحديد المواقع مع الفرشاة وترك مسافة بين المقاطع الفردية والحدود من إدراج الثقافة.
- باستخدام ماصة باستور العقيمة، وإزالة الحل تشريح الزائد من سطح قمية من الغشاء.
ملاحظة: في حين إزالة الحل تجنب رسم أقسام الأنسجة في ماصة. بدلا من ذلك، استخدم ماصة العادية (P200 أو P1000) مع نصائح ماصة معقمة لإزالة ببطء الحل. - وضع لوحة الثقافة مع المحتوية على مصل الثقافة المتوسطة وشرائح قرن آمون العودة الى الحاضنة في 35 ° C وCO 2 5٪.
ملاحظة: إذا المكالمات التجربةلتوليد الثقافات من الحيوانات متعددة، تنظيف شامل على مقاعد البدلاء نظيفة تدفق الصفحي بين تشريح. العودة إلى أدوات حل الكحول واستبدال جميع بيتري الأطباق، وأوراق الترشيح وشفرات الحلاقة المعقمة قبل تشريح الثاني.
4. التغذية والحفاظ على عضوي شرائح
- ثقافات الأعلاف في تدفق الصفحي معقمة مقاعد البدلاء النظيفة.
- أداء تغذية الأولى من أقسام مثقف 2 يوما بعد تشريح. نضح مستنبت القديمة باستخدام معقم ماصة الزجاج.
- استخدام معقمة 5 مل ماصة المصلية لإضافة 1 مل من جديد، عقيم، التي تحتوي على مصل المتوسطة إلى الآبار.
- استبدال بلطف إدراج الثقافة ورعاية لإزالة أي فقاعات الهواء التي قد تكون تشكلت تحت سطح الغشاء.
- بعد الرضاعة الأولى، تغيير المتوسطة كل يوم.
5. احتضان شرائح الأنسجة مع ثيميدين النظائر لتسمية الوليد الخلايا العصبية
- من أجل دراسةنضج وتكامل الخلايا الحبيبية المسنن في قرن آمون، احتضان شرائح عضوي النمط مع التناظرية ثيميدين، مثل Bromodeoxyuridine (BrdU) أو Chlorodeoxyuridine (CldU). هنا، ونحن نستخدم CldU بسبب الذوبان العالي، في المياه المالحة.
- بعد 3DIV، إضافة 1 ميكرولتر من 10 ملغ / مل CldU حل الأسهم في المياه المالحة إلى 1 مل من مستنبت لتركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل. إذا تم استخدام BrdU، تصحيح تركيز الاختلافات في الوزن الجزيئي. إضافة المتوسطة مع CldU إلى الآبار الثقافة واحتضان الأنسجة مع CldU التي تحتوي المتوسطة لمدة 2 ساعة على 35 درجة مئوية.
- بعد 2 ساعة من الحضانة عند 35 درجة مئوية، وإزالة المتوسطة CldU التي تحتوي على واستبدالها مع المتوسطة تغذية منتظمة لاستئناف الجدول الزمني للتغذية العادية (المذكورة أعلاه).
6. الأنسجة التثبيت والتخزين
- تحديد جدول زمني لتطبيق العلاجات وتحديد عينات الأنسجة قبل بدء التجارب الثقافة (الشكل 2B). <لى> وفي ما بعد تشريح أيام محددة سلفا، وإعداد التالية في غطاء الدخان المختبر: دورق 10-50 مل تحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)؛ على كوب فارغ لتجاهل مستنبت، ملقط الصغيرة؛ وماصة 1،000 مل مع نصائح التخلص منها.
- إزالة لوحة الثقافة (ق) من غرفة الحضانة ونقل إلى غطاء الدخان. إمالة الفردية إدراج لوحة جيدا مع ملقط. المقبل، واستخدام ماصة لإزالة مستنبت ونقل إلى دورق التخلص منها. إمالة لوحة الثقافة في زاوية للمساعدة على ضمان أن تتم إزالة جميع مستنبت.
- إنهاء إزالة المتوسطة لوحة الثقافة في وقت واحد. عندما تمت إزالة المتوسطة، إضافة 1 مل من 4٪ PFA إلى كل ثقافة جيدا وختم لوحة جيدا مع parafilm. تكرار لكثير من لوحات لوحات الثقافة اللازمة ونقل إلى الثلاجة عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- بعد 24 ساعة، وإعداد التالية في غطاء الدخان: 10-50 مل دورق يحتوي على 0.1٪ أزيد الصوديوم في برنامج تلفزيوني. فارغةدورق لتجاهل PFA (اتبع احتياطات السلامة عند التخلص من المواد السامة)؛ ملقط الصغيرة؛ و 1،000 مل ماصة مع نصائح التخلص منها.
- اتبع الإجراء المذكورة في 6.4 لإضافة PFA، ولكن إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني مع أزيد الصوديوم بدلا من ذلك. مرة واحدة نقله تماما، لوحات ختم تماما للاستخدام في المستقبل من خلال التفاف حواف في بارافيلم وتخزينها في الثلاجة على 4 درجات مئوية.
7. باجتزاء الأنسجة لالمناعية
- أداء الأنسجة باجتزاء باستخدام vibratome. السلسلة التالية من الخطوات تساعد على تعظيم العائد من أقسام الأنسجة التي يمكن استخدامها من الثقافات عضوي النمط.
ملاحظة: مباشرة بعد تشريح الحصين والطلاء من شرائح، والأنسجة لديها سمك حوالي 400 ميكرون. ومع ذلك، وبعد 2-3 أسابيع في غرفة الحضانة، وسوف تبدأ شرائح الأنسجة لشد، مما أدى إلى سمك الباب الأخير من 150-300 ميكرون. - اعداد العناصر التالية لقسم الأنسجة مثقف: أ # 11 مشرط بLADE والتعامل معها، وكوب طبق بتري تحتوي على الجليد PBS الباردة، وملقط تشريح الصغرى، ونظيفة مرحلة قطع vibratome لتركيب الأنسجة.
- استخدام مشرط لقطع بعناية على طول محيط الغشاء إدراج دائري بحيث يمكن فصل من السكن إدراج البلاستيك. ترك مساحة واسعة بين شريحة مثقف ومشرط.
- نقل الغشاء إدراج فصل إلى طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني. بعد الشطف في برنامج تلفزيوني، واستخدام ملقط لنقل الغشاء إلى مرحلة vibratome المتزايدة.
- وبعد ذلك، استخدام مشرط لإزالة غشاء الزائد المحيطة شرائح مثقف وقطع المواد الزائدة لخلق حواف نظيفة. هذه الخطوة ستضمن الغشاء مسطحة ويمكن أن تنضم بسهولة إلى سطح القطع.
- وضع 1-2 قطرات من مادة لاصقة على المسرح قطع vibratome وانتشارها في طبقة حتى باستخدام إبرة 22 G. نشر لاصقة في شكل مستطيل مع الحافة بالتوازي طويلا لنصل قطع من vibratome. تنفيذ هذه الخطوةبسرعة، لمنع لاصق من التجفيف.
- استخدام ملقط لنقل الغشاء قلص تحتوي على شرائح الحصين إلى مرحلة القطع وبلطف وضع غشاء على الغراء والتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء.
- كما يجف superglue، ونقل المرحلة vibratome مع غشاء لاصق العودة الى PBS تحتوي على طبق بتري. إعداد شفرة vibratome و48 لوحة جيدا أزيد تحتوي على الصوديوم لتخزين أقسام الأنسجة.
- استخدام vibratome لتوليد 30 ميكرومتر أقسام الأنسجة شريحة عضوي النمط ونقل إلى 48 لوحة جيدا تحتوي على أزيد الصوديوم للتخزين وتلطيخ المناعى لاحق.
- الرجوع إلى ما قبل القائمة بروتوكولات لالمناعى تلطيخ 26،29.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تحديد ما إذا كان الثقافات عضوي النمط سيكون مناسبة لبحث تكوين الخلايا العصبية الكبار المطلوبة من استيفاء معيارين رئيسيين: 1) أن شرائح الحفاظ على السمات المورفولوجية المميزة لشرائح قرن آمون بعد 10-21 يوما في المختبر (DIV)، و 2) أن DGCS حديثي الولادة يمكن كميا باستخدام تقنيات المناعى القياسية استخداما في البحوث تكوين الخلايا العصبية الكبار. وفيما يتعلق المعيار الأول، الشكل 1A 1B وتسليط الضوء على مورفولوجيا الحصين الحفاظ عليها. السمات المميزة مثل التلفيف المس...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وبعد CldU (أو BrdU) الإدارة، وجدول زمني لتطبيق كلاء الدوائية ويمكن اختيار لاستهداف DGCS حديثي الولادة خلال معينة النوافذ التنموية. على سبيل المثال، وكيل افتراضية يمكن تطبيقها خلال الأسبوع الثاني الحقن بعد CldU، والذي يقترح ليتزامن مع عمر الخلايا العصبية غير الناضجة التي هي في مرحلة التطوير حيث يتم إزالة إستقطاب GABA. يمكن أن الدراسات المستقبلية باستخدام هذا البروتوكول التكيف مع وكيل الدوائية ونافذة من التعرض ل"خياط" النهج على سؤال تجريبي محددة من الفائدة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منحة بحثية MOP 119271 إلى JMW من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية. ويود أصحاب البلاغ أن يشكروا السيدة ياو فانغ تان على مساعدتها التقنية الممتازة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 5-chloro-2'-deoxyuridine (CldU) | MP Biomedicals | 105478 | المسرطنة الخطرة |
| ، قطر 30 مم ، 0.4 وميكرو ؛ م حجم المسام | الحرارية العلمية | يوفر طلاء دلتا 140660 | Nuclon على هذه الإدخالات التصاق أفضل للأنسجة ويحسن جودة الشريحة. |
| أنابيب الطرد المركزي المخروطية (معقمة) | فيشر ساينتفيك | 14-432-22 | |
| مقص التشريح (بزاوية إلى الجانب) | أدوات العلوم الدقيقة | 14082-09 | |
| الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) | Gibco | 11095 ؛ سائل | يخزن عند 4 درجات ؛ C |
| Eclipse Ni-U مجهر الفلورسنت | نيكون | ||
| الغراء للأنسجة | Krazy Glue | KG585 | استخدم الحد الأدنى من الغراء لتحقيق الالتصاق لأن أي نسيج معرض للغراء سيكون غير صالح للاستخدام ل IHC. |
| هانك محلول ملح متوازن (HBSS) (500 مل) | جيبكو | 14025-092 | يخزن في درجة حرارة 4 درجات ؛ سيروم الحصان C |
| معطل بالحرارة (500 مل) | جيبكو | 16050-122 | اصنع 50 مل من الكميات وخزنها في درجة حرارة -20 درجة ؛ C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| ماصات زجاجية معدلة (تمت إزالة الجزء السفلي من ماصة باستور وتنعيمها بلهب بنسن) | |||
| طبق بتري (100 مم × 15 مم) و (60 مم × 15 مم) | مشرط FB0875712 و FB0875713A | من ماركة فيشر | |
| # 11 | أدوات العلوم الدقيقة | 10011-00 | |
| مقبض مشرط # 3 | غرامة أدوات العلوم | 10003-12 | |
| الماصات المصلية | شركة سورفا الطبية للبلاستيك | P8050 | |
| ملقط النمط | القياسي أدوات العلوم | الدقيقة 11000-12 | |
| فلتر فراغ معقم | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| مقص جراحي | أدوات العلوم الدقيقة | 14054-13 | |
| وحدة تصفية مدفوعة بالحقنة | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| مروحية الأنسجة مع مرحلة متحركة | Stoelting & نب سب. | 51425 | |
| الرسم ذات الطرف الناعم |
المراجع
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
- Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
- Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
- Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
- Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
- Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
- Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
- Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
- Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271(2012).
- Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
- Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
- Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
- Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Molecular And Cellular Neurosciences. 26 (2), 241-250 (2004).
- Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
- Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
- Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
- Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
- Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
- Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
- Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409(2006).
- McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
- Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
- Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
- Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
- Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
- Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
- Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
- Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
- Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
- Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
