Method Article

ربط الجينات المحددة الحامض النووي التغييرات مع التعبير والترانسكربتي آخر من نجمي KCNJ10 (Kir4.1)

DOI:

10.3791/52406

⸱

September 26th, 2015

 , 
1Department of Cell Developmental and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مثيلة الحمض النووي قادرة على الحفاظ على مستويات مستقرة من التعبير الجيني بالإضافة إلى السماح بتغييرات ديناميكية في التعبير الجيني استجابة لمجموعة متنوعة من المحفزات. نحن نفصل التقنيات التي تسمح بدراسة التغيرات الخاصة بالجينات في مثيلة الحمض النووي وتأثير هذه التغييرات على التعبير الجيني.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
تعمل مثيلة

DNA على تنظيم التعبير الجيني من خلال الارتباط التساهمي لمجموعة الميثيل على موضع C5 للسيتوزين في ثنائي النوكليوتيد السيتوزين والجوانين. في حين أن مثيلة الحمض النووي توفر تغييرات طويلة الأمد ومستقرة في التعبير الجيني ، فإن أنماط ومستويات مثيلة الحمض النووي عرضة أيضا للتغيير بناء على مجموعة متنوعة من الإشارات والمنبهات. على هذا النحو ، تعمل مثيلة الحمض النووي كمنظم قوي وديناميكي للتعبير الجيني. كشفت دراسة علم التخلق العصبي عن مجموعة متنوعة من الحالات الفسيولوجية والمرضية المرتبطة بالتغيرات العالمية والخاصة بالجينات في مثيلة الحمض النووي. على وجه التحديد ، توجد ارتباطات مذهلة بين التغيرات في التعبير الجيني ومثيلة الحمض النووي في الاضطرابات العصبية والنفسية والتنكسية العصبية ، أثناء اللدونة المشبكية ، وبعد إصابة الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، مع استمرار مجال علم التخلق العصبي في توسيع فهمه لدور مثيلة الحمض النووي في فسيولوجيا الجهاز العصبي المركزي ، فإن تحديد العلاقات السببية فيما يتعلق بالتغيرات في التعبير الجيني ومثيلة الحمض النووي أمر ضروري. علاوة على ذلك ، فيما يتعلق بالمجال الأكبر لعلم الأعصاب ، فإن وجود اختلافات واسعة في المنطقة والخلية يتطلب تقنيات تعالج هذه الاختلافات عند دراسة النسخ والبروتين والإبيجينوم. نصف هنا فرز FACS للخلايا النجمية القشرية التي تسمح بالفحص اللاحق لكل من نسخ الحمض النووي الريبي ومثيلة الحمض النووي. علاوة على ذلك ، نقوم بتفصيل تقنية لفحص مثيلة الحمض النووي ، وتحليل الذوبان عالي الدقة الحساس للمثيلة (MS-HRMA) بالإضافة إلى مقايسة محفز لوسيفيراز. من خلال استخدام هذه التقنيات المدمجة ، لا يمكن للمرء استكشاف التغيرات المترابطة بين مثيلة الحمض النووي والتعبير الجيني فحسب ، بل أيضا تقييم ما إذا كانت التغييرات في حالة مثيلة الحمض النووي لمنطقة جينية معينة كافية للتأثير على نشاط النسخ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

علم التخلق هو دراسة التعديلات الكيميائية التي يمكن أن تؤثر على نشاط النسخ للجينوم. بشكل أساسي ، بدون تغيير في تسلسل الحمض النووي ، فإن التعديلات اللاجينية مثل مثيلة الحمض النووي ، وأستيلاسیون الهيستون ، وميثيلة الهيستون كافية لتغيير أنماط التعبير الجيني بشكل عكسي 1. مثيلة الحمض النووي ، وهي منظم قوي للتعبير الجيني ، هي التعديل اللاجيني الأكثر تميزا. مثيلة الحمض النووي هي الارتباط التساهمي لمجموعات الميثيل على موضع C5 للسيتوزين ، وعادة ما يكون السيتوزين لثنائي النوكليوتيد السيتوزين والجوانين ، المعروف أيضا باسم موقع CpG. تعرف المناطق التي تحتوي على كثافة عالية من مواقع CpG باسم جزر CpG (CGIs). غالبا ما ترتبط CGIs بمواقع بدء النسخ (TSS) ومروجي الجينات 1-3. وبالتالي ، في حين أن التغييرات في مثيلة الحمض النووي في CGIs لا تصاحب دائما التغيرات في التعبير الخلوي أو الوظيفة ، فإن التغييرات في مثيلة الحمض النووي في CGIs يمكن أن تمارس تنظيما قويا على نشاط النسخ 2.

< p class = 'jove_content'> تاريخيا ، لوحظ أن مثيلة الحمض النووي ضرورية في التطور الجنيني والطباعة والتطور ، مع حدوث تغييرات طفيفة في مستويات مثيلة الحمض النووي في خلايا ما بعد الانقسام (باستثناء التغيرات في الجينات المرتبطة بالسرطان) 4،5. ومع ذلك ، فقد سلط مجال علم التخلق العصبي الضوء على دور مهم غير تنموي لمثيلة الحمض النووي. على وجه التحديد ، أعاد علم التخلق المعرفي تعريف مثيلة الحمض النووي كآلية بلاستيكية للغاية لا تتجزأ من التوسط في كل من التنشيط النسخي وقمع الجينات الضرورية لعملية التعلم والذاكرة 6. بصرف النظر عن علم التخلق المعرفي ، تميز الدراسات التي تضع نمذجة الإصابة الإقفارية وألم الاعتلال العصبي مثيلة الحمض النووي كآلية قابلة للتغيير تستجيب بسرعة لمجموعة متنوعة من إهانات الجهاز العصبي المركزي 7-9. فيما يتعلق بالخلايا النجمية ، تشير عدة خطوط من الأدلة إلى أن مثيلة الحمض النووي تلعب دورا مهما في تكوين الخلايا الدبقية الفلكية. وجد فان وآخرون أن KO الشرطي ل DNMT1 في الخلايا السلفية العصبية (NPCs) أدى إلى تطور مبكر للخلايا النجمية المتوافقة مع الحالة العالمية لنقص الميثيل 10. بالإضافة إلى ذلك ، خلص Perisic et al. إلى أن المستويات التفاضلية لمثيلة الحمض النووي لمحفز GLT-1 توسط المستويات التفاضلية للتعبير عن ناقل الغلوتامات في القشرة والمخيخ ، مع التأكيد على دور في مثيلة الحمض النووي في إنشاء أنماط محددة لمنطقة الدماغ للتعبير الجيني النجمي 11. بشكل عام ، تؤكد العديد من الدراسات على الطبيعة الديناميكية والمتقلبة لمثيلة الحمض النووي في الجهاز العصبي المركزي حيث ثبت أن البيئة والأدوية والإصابة تغير مثيلة الحمض النووي وغالبا ما يكون التعبير الجيني 4،9. تشير هذه الدراسات العصبية اللاجينية معا إلى مثيلة الحمض النووي كهدف علاجي مجدي مع إمكانية التخفيف من مجموعة متنوعة من أمراض الجهاز العصبي المركزي.

نظرا لأن مجال علم التخلق يوسع فهمه لدور مثيلة الحمض النووي في النمو العصبي والمرض ، فإن التحدي المتمثل في تحريك مثيلة الحمض النووي نحو هدف علاجي لا يؤدي فقط دراسات مترابطة ، ولكن مسببة تحدد أهداف ومواقع جينية محددة. بالإضافة إلى ذلك ، يظل مسح التغيرات في مثيلة الحمض النووي الخاصة بمنطقة الدماغ ونوع الخلية تحديا مستمرا وجديرا بالوقت وفريدا من نوعه في مجال علم التخلق العصبي. يستخدم هذا البروتوكول مجموعة متنوعة من التقنيات بما في ذلك فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) للخلايا النجمية ، وتحليل الذوبان عالي الدقة الحساس للمثيلة (MS-HRM) ، ومقايسة لوسيفيراز المثيلة للتحقيق في حالة مثيلة الحمض النووي ل KCNJ10 ، وهو جين يشفر ل Kir4.1. Kir4.1 هي قناة بوتاسيوم خاصة بالدبقي توضح كلا من منطقة الدماغ وأنماط التعبير الخاصة بالخلايا في الجهاز العصبي المركزي 12-16. يزيد تعبير Kir4.1 من الانتقال من مناطق الجهاز العصبي المركزي المنقاري إلى المناطق الذيلية ، مع حدوث أعلى تعبير في الحبل الشوكي 15. على الرغم من أن القناة يتم التعبير عنها في الخلايا البطانية العصبية والخلايا قليلة التغصن والخلايا السلائف الخاصة بها ، إلا أن Kir4.1 يتم التعبير عنه في الغالب في الخلايا النجمية ويعتقد أنه ضروري للحفاظ على مستويات البوتاسيوم المتجانسة بالإضافة إلى دعم امتصاص الغلوتامات عن طريق ضبط إمكانات غشاء الراحة النجمية عند فرط الاستقطاب -80mV 12،16-19. الأهم من ذلك ، أن التعبير عن Kir4.1 غير ثابت أثناء التطوير واتباع أشكال متعددة من إصابة الجهاز العصبي المركزي 20-25. كنا نرغب في فحص التنظيم اللاجيني لهذه القناة ، وتحديدا في الخلايا النجمية أثناء التطور. تقدم التقنيات المستخدمة تحليلات موقع CpG خاصة بالجينات ومستهدفة توفر دليلا سببيا على دور مثيلة الحمض النووي في تنظيم التعبير الجيني KCNJ10. يمكن تطبيق هذه التقنيات على جينات أخرى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم التعامل مع جميع الحيوانات وفقا للمعاهد القومية للصحة المبادئ التوجيهية. وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان في جامعة ألاباما في برمنغهام استخدام الحيواني.

1. الحصول على الحمض النووي الريبي والحمض النووي المخصب من نجمي السكان الذين يستخدمون نيون المنشط خلية الفرز (FACS) من الخلايا النجمية من كامل أنسجة المخ

  1. الحيوان رزين مع CO 2 لمدة 1 دقيقة ثم قطع رأس بسرعة. تشريح القشور كما هو موضح في البوكيرك وآخرون، 26؛ ليس من الضروري لإزالة السحايا.
    ملاحظة: تم إنشاؤها الفئران المعدلة وراثيا معربا عن EGFP تحت S100β (علامة نجمية) المروج التي كتبها إيتاكورا وآخرون 27 وتستخدم لFACS فرز الخلايا النجمية.
  2. إعداد جناسة الدماغ كله باستخدام عدة التفكك غراء في ظل ظروف غير معقمة وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. للحرارة تفعيل غراء عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 10 دقيقة. ملاحظة:وتقدم الحل غراء من قبل الشركة المصنعة ويحتوي L-السيستين وEDTA (انظر الجدول المواد).
    1. قطع أو DREMEL ثقب في الجزء العلوي من أنبوب 50 مل مخروطي الشكل للسماح أنابيب تحمل 95٪ O 2: CO 2 5٪ ليكون الطعام في أنبوب مخروطي مغلق (الشكل 1A). وضع القشور تشريح في طبق ثقافة 10MM تحتوي على وسائل الاعلام تفارق (MEM تستكمل مع الجلوكوز 20MM والبنسلين / الستربتومايسين (500 U / مل)، ومعايرتها إلى 95٪ O 2: 5٪ CO 2)، واستخدام شفرة حلاقة نظيفة لتخطر على الأنسجة في 1 × 1 مم 2 قطعة.
  3. نقل الأنسجة باستخدام 10 مل pipetman اليدوي إلى 50 مل أنبوب مخروطي يحتوي الحل غراء. تسمح الأنسجة لتستقر في قاع نقل ماصة قبل التفريغ لتقليل كمية من وسائل الاعلام تفارق ترحيلها. إبقاء الحل غراء معايرتها إلى 95٪ O 2: 5٪ CO 2 عن طريق تبادل الغازات السطح لمدة الحضانة. لا فقاعة غراء solutiعلى. احتضان الأنسجة لمدة 20 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
  4. وبعد الحضانة في حل غراء، الأنسجة يسحن 10 مرات مع ماصة 10 مل نقل بسرعة بطيئة. الطرد المركزي تعليق خلية غائم في 1000 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    1. تتوازن الدناز / الزلال حل المانع (المقدمة من قبل الشركة المصنعة) عن طريق تبادل الغازات السطحية واعادة تعليق الخلايا مكعبات في 3 مل من محلول الدناز / الزلال المانع. إعداد التجاري التدرج الكثافة متقطعة باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  5. تدور متقطع التدرج الكثافة في 1000 x ج لمدة 6 دقائق. عزل الخلايا فصلها من أسفل أنبوب عن طريق مص بيليه السفلي باستخدام ماصة.
  6. اعادة تعليق الخلايا فصلها في 2-3 مل من DPBS مع 0.02٪ ألبومين المصل البقري و 1 ملغ / مل الدناز أو HEPES فضل مخزنة سائل الإعلام والثقافة. تمر عبر 40 ميكرون تصفية قبل FACS (الشكل 2A). تبقي الخلايا على الجليد حتى الفرز.
    1. أداء FACS 28.
    2. خلايا بيليه في 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: الخلايا النجمية مكور يمكن استخدامها على الفور أو الاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي.
  7. استخراج الحمض النووي الريبي والحمض النووي باستخدام طريقة عزل المفضلة 29 30. تقييم RNA وتركيز الحمض النووي والجودة عبر الطيف وbioanalyzer 31.
    ملاحظة: الاستفادة فقط RNA ذات جودة عالية وDNA في الخطوات اللاحقة، 260/280 = 2،0-2،2 و1،8-1،9، على التوالي. تحليل Bioanalyzer ضروري لتقييم لتدهور RNA أو DNA تجزئة. RNA أو DNA يمكن أن تستخدم مباشرة أو تخزينها في -80 ° C أو -20 درجة مئوية، على التوالي لدراسات لاحقة.

2. تقييم الحامض النووي الحالة من الجينات باستخدام مثلأيشن تراعي عالية الدقة التحليل تذوب (MS-HRMA)

  1. أدخل تسلسل الجينات في المصالح في فضل برنامج رسم الخرائط مثيلة على الانترنت لتحديد أي الجزر الدليل السياسي الشامل في الجيناتالفائدة 32.
    1. الاشعال تصميم ضد بيسلفيت تحويلها تسلسل DNA 33 و تضخيم باستخدام البلمرة DNA المفضل وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. تحقق تضخيم حجم المنتج عن طريق تشغيل 1٪ هلام DNA الاغاروز في 100 V لمدة 45 دقيقة. متجر الاشعال في تركيز الأسهم من 20 ميكرومتر في -20 ° C.
  2. بيسلفيت تحويل 500-1،000 نانوغرام من الحمض النووي من كل عينة DNA والميثيلي والمعايير تتراوح بين 0-100٪ من الأنواع الحيوانية نفسها 34. عينات أزل لتوفير تركيز 20 نانوغرام / ميكرولتر. تحقق من تركيز الحمض النووي تحويل بيسلفيت عبر طيفي 31.
  3. إعداد 20 ميكرولتر ردود الفعل لتضخيم MS-HRM باستخدام البلمرة DNA المفضل والاشعال في 5 ميكرومتر تركيز وفقا للجدول 1 و 2. تشغيل جميع العينات، بما في ذلك المعايير DNA ومميثل FACS، في ثلاث نسخ.
  4. اعتمادا على برامج التحليل، تعيين قبل وبعد بدء ووقف المعلماتحول التحولات في منحنى ذوبان. مجموعة قبل ذوبان بداية والمعلمات توقف قبل تذوب حتى الفرق بين الاثنين هو 0،2-0،5 درجة مئوية. بدء تعيين ما بعد ذوبان وبعد ذوبان وقف بالمثل. استخراج البيانات الفرق في درجة الحرارة الذروة لكل عينة.
  5. باستخدام المعايير في المئة مميثل (ص القيمة) والذي يقابل متوسط ​​الاختلافات في درجة الحرارة ذروتها (خ القيمة) توليد معادلة الانحدار الخطي (الشكل 3A-B، الجدول 3-4). استخدام هذا معادلة الانحدار الخطي لتقدير حالة مثيلة من العينات المجهولة 35.

3. تقييم فرط ميثليته-آخر المروج عبر استخدام luciferase الفحص

  1. تحديد الجزر الدليل السياسي الشامل من الجين المستهدف (الخطوة 2.1). PCR تضخيم المناطق ذات الاهتمام 36 و استنساخ المنبع من luc2 اليراع مراسل luciferase المراسل الجينات لإنتاج البلازميدات الدليل السياسي الشامل الجزيرة-luc2 37.
  2. خطي 30 ميكروغرام من البلازميد الدليل السياسي الشامل الجزيرة-luc2 عبر تقييدانزيم الهضم 38. التحقق من مواقع لتقييد هضم وتجنب تخفيضات مزدوجة باستخدام برنامج القاطع المفضل 38. للحرارة وقف نشاط الإنزيمات في درجة الحرارة ومدة المناسبة التالية الهضم وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. فقدان الحد الادنى من الحمض النووي يحدث خلال خطوة الخطية.
  3. ميثيل البلازميدات خطي باستخدام الدليل السياسي الشامل methylase (M.Sssl) O / N عند 30 درجة مئوية أو ترك دون علاج بروتوكول المصنعة التالية باستثناء التعديلات التالية.
  4. أداء 50 ميكرولتر ردود الفعل.
  5. استخدام 5 وحدات من الدليل السياسي الشامل methylase إلى ميثيل 700 نانوغرام من البلازميد خطي.
  6. تشغيل ردود الفعل O / N ل13-19 ساعة.
  7. وبعد رد فعل methylase الدليل السياسي الشامل، نفذ تنظيف DNA باستخدام معيار، المتاحة تجاريا غشاء السيليكا جل تنظيف عدة وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. خسائر كبيرة في DNA تحدث بعد الدليل السياسي الشامل methylase رد فعل، وفقدان 30-60٪.
  8. تحقق مثيلة من البلازميدات عن طريق تقييد هبان II هضم.
  9. تأخذ 1 ميكروغرام من الحمض النووي ميثليته أو غير ميثليته وتقييد هضم مع هبان II لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. استخدام 5-10 وحدات من هبان II لكل DNA ميكروغرام. بعد هبان II الهضم، نفذ تنظيف DNA باستخدام المفضلة، غشاء المتاحة تجاريا السيليكا جل تنظيف عدة. تشغيل كل من الدليل السياسي الشامل البلازميدات مميثل وغير مثيلة على 1٪ هلام DNA الاغاروز في TAE أو TBE العازلة عند 100 V لمدة 45 دقيقة لتصور (الشكل 4B).
  10. البلازميدات تخضع كل من مميثل وغير ميثليته الهضم مزدوجة مع الانزيمات تقييد المناسبة لإطلاق سراح كامل طول لوك 2 (ناقلات) وجزيرة الدليل السياسي الشامل (إدراج) شظايا 38. أداء مزدوج الهضم O / N في درجة حرارة مناسبة والإنزيمات للحرارة تعطيل التالية الهضم وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. فقدان الحد الادنى من تركيز الحمض النووي يحدث خلال تقييد مزدوج هضم.
  11. تشغيل البلازميدات يهضم ضعف في 1٪ agarose هلام DNA في 100 V لمدة 1 ساعة للسماح للانفصال سو ناقلات وإدراج (الشكل 4C). الحذر. ارتداء الأشعة فوق البنفسجية واقية درع الوجه، ووضع جل DNA على ضوء أسود الطاولة لتصور العصابات. على أساس الحجم والمكوس إدراج الميثيلي وغير ميثليته وناقلات غير ميثليته باستخدام شفرة جراحية نظيفة.
  12. هلام استخراج الحمض النووي باستخدام الفينول المشبعة، ودرجة الحموضة 6.6. لفترة وجيزة، تزن هلام DNA التي تحتوي على ناقل أو إدراج. استخدام 100 ميكرولتر من الفينول في 0.1 غرام من هلام DNA. التجانس هلام DNA في الفينول استخدام الزجاج dounce الخالط.
  13. إضافة الكلوروفورم (باستخدام 1/5 من حجم الفينول) ويهز عينات لمدة 20 ثانية. احتضان العينات في RT لمدة 2-3 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في أقصى سرعة (16.1 X 1000 x ج) في 4 درجات مئوية.
  14. إزالة محلول مائي وإضافة حجم 0.1X من 3 M خلات الصوديوم وحجم 2.5X من الايثانول. احتضان العينات لمدة 1 ساعة على -80 ° C. بعد الحضانة، وإزالة الإيثانول وإعادة تعليق الحمض النووي في 30 ميكرولتر من العازلة المفضل. خسارة كبيرة من الحمض النووي يحدث العزلة التالية من إدراج وناقلات، 30-50٪ لوق ق.
  15. إعادة ligate إدراج مميثل وغير مثيلة لغير ميثليته المتجه باستخدام T4 DNA يغاز 38. استخدام نسبة 1: 4 ناقلات لادخال لردود الفعل ربط. رد فعل الإعداد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدام الحجم الكلي لل50 ميكرولتر لردود الفعل واحتضان O / N عند درجة حرارة -20 درجة مئوية أو على الجليد مع غطاء على دلو الجليد.
  16. بعد ربط، نفذ تنظيف DNA باستخدام المفضلة، غشاء المتاحة تجاريا السيليكا جل تنظيف عدة. خسائر كبيرة في DNA تحدث بعد رد فعل ربط، وهي تقريبية فقدان 30-50٪ من الحمض النووي. التحقق من إعادة ربط كل من يعمل على 1٪ هلام DNA الاغاروز في 100 V لمدة 45 دقيقة وتقييم تركيز-ligated إعادة البلازميدات (الشكل 4D).
  17. Transfect البلازميدات ميثليته أو غير مثيلة في الخلايا D54 باستخدام كاشف ترنسفكأيشن التجاري وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. الخلايا D54 البذور على 12 لوحة جيدا في 0.14 × 10 6 خلايا / جيد.
  18. وبعد 24 ساعة، وخلايا transfect وايتركيزات متساوية عشر إما (1) البلازميد غير methyated الدليل السياسي الشامل، luc2 + Renilla أو غيرها من ناقلات السيطرة luciferase المراسل أو (2) ميثليته البلازميد الدليل السياسي الشامل، luc2 + Renilla أو غيرها من ناقلات السيطرة luciferase المراسل.
  19. تسمح للخلايا ل transfect لمدة 24 ساعة قبل إجراء المزدوج luciferase الفحص. أداء الاختبار وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أداء قراءات باستخدام luminometer. قراءة كل بئر في ثلاث نسخ.
  20. حساب نسبة اليراع luciferase النشاط إلى Renilla أو غيرها من الأنشطة السيطرة luciferase المراسل. تطبيع الميثيلي واليراع: السيطرة luciferase النشاط إلى اليراع غير ميثليته: السيطرة luciferase النشاط بتقسيم luciferase النشاط الميثيلي التي كتبها luciferase النشاط غير ميثليته

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد اكتسب السكان المخصب من الخلايا النجمية عبر FACS الفرز من EGFP-S100β الحيوانات المعدلة وراثيا 27. بسبب تدني نوعية الخلايا والجزيئات الجزيئية المعزولة من الحيوانات القديمة من بعد الولادة اليوم 50 (P50)، والحيوانات الذين تتراوح أعمارهم بين P0-P40 هي الأمثل لمثل هذه التجارب. تم استخدام الأنسجة القشرية لهذه التجارب. وكان يتم تجميع القشور من يومين إلى ستة الحيوانات معا. تم تنفيذ FACS في منشأة UAB الشامل التدفق الخلوي الأساسية. تم إجراء الفرز على بيكتون ديكنسون FacsAria II...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول عزل مجموعة مخصبة من الخلايا النجمية عبر FACS بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من التقنيات التي تسمح بإجراء دراسات مترابطة ومسببة بين مثيلة الحمض النووي والتعبير الجيني. هذه التقنيات ، المستخدمة بمعزل عن بعضها البعض أو مجتمعة ، مفيدة بشكل خاص للمختبرات التي تعمل مع الأنسجة ذات التغايرية الخلوية العالية أو المهتمة بحالة مثيلة الحمض النووي لجين معين أو منطقة جينية معينة مقابل تغيرات مثيلة الحمض النووي العالمية. أحد التحديات الفريدة نسبيا في دراسة إبيجينوم الجهاز العصبي المركزي هو تنوع مجموعات الخلايا. نظرا لأنه...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي إفصاح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بواسطة R01NS075062-01A1. تم إجراء فرز FACS في منشأة UAB الشاملة لقياس التدفق الخلوي الأساسية (P30 AR048311 ، P30 A1027767). ساعد الدكتور سكوت فيليبس من منشأة UAB Neurobiology Core والدكتورة سوزان نوزيل من UAB CDIB في الجوانب الفنية لمقايسة لوسيفيراز.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
نظام تفكك غراءشركة ورثينجتون للكيمياء الحيويةLK003150
AllPrep DNA / RNA Mini KitQiagen80204
برنامج Methyl PrimerApplied Biosystemsعبر الإنترنتلتوطين CpG Islands
EZ DNA Thaylation KitZymo ResearchD5001
معيار معايرة الفئران المختلطةمسبقا EpiGenDx80-8060R-Premix
CpG Methylase (M.Sssl) ZymoResearchE2010
QIAquick Gel Extraction QIagen28704تستخدم لاستخراج الهلام وتنظيف الحمض النووي
إنزيمات تقييدنيو إنجلاند BioLabs
NEB قاطعنيو إنجلاند BioLabsعبر الإنترنتتحقق من مواقع ملخص التقييد
نظام فحص مراسل Luciferase المزدوجPromegaE1910
Luc2 vector ، pGL4.10PromegaE6651
ناقلات رينيلا ، pGL4.74PromegaE2241
TD-20 / 20 LuminometerTurner Designs
Lipofectamine LTX و Plus ReagentLife TechnologiesA12621
الفينول ، درجة الحموضة المشبعة 6.6 / 6.9فيشر ScientificBP 17501-100
Nanodrop 2000 / 2000c مقياس الطيفالحراري العلمي
الذائبدكتور ماستر ميكسLife Technologies4415440
High Resolution Melt (HRM) Software v2.0Life Technologies4397808
AB SDS software v2.3Life Technologiesعبر الإنترنت
AB عالي الدقة ذوبان دليل البدء تقنيات الحياةعبر الإنترنت
AB 7900HT تقنيات حياة
النظام في الوقت الحقيقي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
  2. Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
  3. Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
  4. Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
  5. Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
  6. Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
  7. Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
  8. Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
  9. Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
  10. Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
  11. Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
  12. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  13. Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
  14. Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
  15. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  16. Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
  17. Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
  18. Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
  19. Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
  20. MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
  21. Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
  22. Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
  23. Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
  24. Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
  25. Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
  26. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
  27. Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
  28. Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
  29. Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
  31. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
  32. Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
  33. Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
  34. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
  35. Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
  36. Sambrook, J., Russell, D. W. The basic polymerase chain reaction. CSH.Protoc. 1, (2006).
  37. Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
  38. Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
  39. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
  40. Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
  41. Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
  42. Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
  43. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  44. Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
  45. Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
  46. Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
  47. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  48. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nat.Protoc. 3, 1903-1908 (2008).
  49. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
  50. Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA MethylationGene ExpressionAstrocyte IsolationFACS SortingMS HRMALuciferase AssayKCNJ10 PromoterTranscriptional ActivityMethylation Sensitive High Resolution Melt AnalysisCortical Astrocytes

Related Articles