مقالة منهجية

نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج

DOI:

10.3791/52421

⸱

مارس 19, 2015

 , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم بيض الدجاج الخصب على نطاق واسع لإنتاج كميات كبيرة من فيروس الأنفلونزا البشرية A لأنه يوفر نظاما مناسبا وفعالا من حيث التكلفة لإثبات إنتاجية عالية من الفيروس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرتبط عدوى الإنفلونزا مع حوالي 36،000 حالة وفاة وأكثر من 200،000 المستشفيات كل عام في الولايات المتحدة. ظهور المستمر من سلالات فيروس الإنفلونزا الجديدة بسبب طفرة وإعادة تشكيلة-يعقد السيطرة على الفيروس ويتطلب التطوير الدائم لأدوية جديدة واللقاحات. الدراسة المختبري للأنفلونزا تتطلب طريقة موثوق بها وفعالة من حيث التكلفة لنشر الفيروس. هنا، يتم توفير بروتوكول شامل للأنفلونزا A انتشار الفيروس في بيض الدجاج الخصبة والتي ينتج باستمرار عيار ارتفاع الأسهم الفيروسية. وباختصار، يتم تحضين خالية من مسببات الأمراض المصل (SPF) بيض الدجاج المخصب عند 37 درجة مئوية والرطوبة 55-60٪ لمدة 10 - 11 يوما. خلال هذه الفترة، تطور الجنين يمكن رصدها بسهولة باستخدام كاندلر البيض. ويتم التلقيح خارج الفيروس عن طريق الحقن من الأسهم الفيروس في جوف السقاء باستخدام إبرة. 2 بعد أيام من الحضانة عند 37 درجة مئوية، والبيضمبردة لمدة 4 على الأقل ساعة على 4 درجات مئوية. قشر البيض فوق كيس الهواء وغشاء مشيمائي يتم بعد ذلك فتحت بعناية، ويتم حصاد السائل السقاء التي تحتوي على الفيروس. تم مسح السوائل من الحطام بواسطة الطرد المركزي، aliquoted ونقل إلى -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. وقد جعلت كمية كبيرة (5-10 مل من السوائل في البيض التي تحتوي على فيروس) وفيروس عيار عالية والتي عادة ما يتحقق مع هذا البروتوكول استخدام البيض لتحضير فيروس أسلوبنا مواتية، ولا سيما بالنسبة للفي الدراسات المختبرية التي تتطلب كميات كبيرة من الفيروسات التي هناك حاجة جرعات عالية من الأسهم الفيروس نفسه.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأنفلونزا A لا يزال يشكل خطرا كبيرا على صحة الإنسان. وهو مرض الجهاز التنفسي يمكن أن يكون مدمرا مع العبء العالمي الكبير يسبب ما يصل إلى 500،000 حالة وفاة سنويا حول العالم 1. فيروسات الأنفلونزا هي في الأسرة فيروسات مخاطية قويمة وتحمل 8-الشعور السلبي RNA واحد الذين تقطعت بهم السبل في الجينوم من 1،2. التحولية عالية (أي الأنتيجين "الانجراف") من الجينوم الفيروسي يمنع مناعة طويلة الأمد. وعلاوة على ذلك، الانفلونزا بشكل متزايد مقاومة للعقاقير المضادة للفيروسات 3.

سلط الضوء على وباء انفلونزا H1N1 2009 جميع القضايا الصعبة المرتبطة بمرض أنفلونزا (سلالة وبائية، ومقاومة مضادة للفيروسات، وإنتاج لقاح تأخر). يتم تحديد تركيبة اللقاح سنويا من قبل منظمة الصحة العالمية لسلالات الأنفلونزا الأكثر احتمالا المسببة للأمراض (واحد في كل من H1N1، H3N2 وانفلونزا B) 4. لأنه يعتمد هذا الأسلوب على سلالة انفلونزا تنبأالصورة، وأحيانا تحديدها بشكل غير صحيح السلالات المسببة للأمراض وقطرات نجاعة اللقاح بشكل كبير. وعلاوة على ذلك، يمكن أن ظهور سلالات الأنفلونزا الجديدة الالتفاف على هذه البرامج الوقائية المسببة للأمراض الوبائية 2.

وقد تم إنشاء لقاح الأنفلونزا العالمي راوغ 5. لذلك، يجب أن تستمر الأبحاث في فهم التسبب في إصابة الرئة. لالبحوث المختبرية المرفق، وقد وضعت عدة طرق لعزل الفيروسية ونشر 6. يمكن أن فيروسات الأنفلونزا البشرية أن تتسع دائرة في مجموعة متنوعة من ركائز خلايا الثدييات. ومع ذلك، فإن أفضل طريقة لتحقيق توليد الفيروسات عيار عالية بكميات كبيرة في البيض المحتوي. يصف بروتوكول التالية تقنية لنشر فيروس الأنفلونزا A والتخزين من مخزونات فيروس القائمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: ملاحظات عامة: تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على التلاعب في البيض تحت ظروف معقمة، وينبغي استخدام تقنية معقمة وفقا لذلك. قبل تنظيف جميع المعدات مع الايثانول 70٪ قبل الاستخدام. وبصفة عامة، ينبغي إجراء التلقيح فيروس الإنفلونزا، والحصاد في مختبر BSL-2. ومع ذلك، إذا تم استخدام هذا البروتوكول لنشر أكثر من ذلك بكثير المسببة للأمراض فيروسات الأنفلونزا (على سبيل المثال، والسلالات الوبائية وما قبل الوباء، والسلالات التي تشكل خطرا على الدواجن والماشية، سلالات أنفلونزا الطيور الشديدة الإمراض، وH1N1 سلالة 1918)، وارتفاع مستويات السلامة الأحيائية و في بعض الحالات، يطلب من احتياطات الأمن الحيوي والتراخيص. وينبغي للجنة السلامة الأحيائية المؤسسية المحلية الموافقة على جميع البحوث المتعلقة بفيروس الأنفلونزا.

1. إعداد بيض للتلقيح

  1. الحصول على البيض (SPF) خالية من مسببات الأمراض المخصبة حديثا المصل الطيور من بائع مناسبة. عادة، يتم استخدام بيض الدجاج. يجب أن يكون لنا البيضإد فور وصوله.
  2. على بيض مكان الوصول في حاضنة البيض مرطب مع تيرنر البيض التلقائي لتدوير البيض بانتظام. إذا كان تيرنر البيض التلقائي غير متوفر، وتناوب يدويا البيض على الأقل 2-3 مرات في اليوم (تأكد من ارتداء القفازات وإبقاء كل شيء كما عقيمة ممكن).
  3. احتضان البيض عند 37 درجة مئوية والرطوبة 55-60٪ عن 10-11 يوما.

تشميع 2. البيض

  1. استخدام كاندلر البيض لفحص البيض ضد الضوء الساطع في غرفة مظلمة للتحقق البيض للعقم قبل تشميع بعد حوالي 7 أو 8 أيام من الحضانة.
    1. مسح كاندلر البيض مع الايثانول 70٪. تغيير القفازات في كثير من الأحيان وتعقيم مع الايثانول 70٪ للحد من مخاطر التلوث عن طريق الجراثيم.
    2. إزالة البيض من الحاضنة ووضعها في علب البيض الفارغة.
    3. إطفاء الأنوار في الغرفة.
    4. عقد نهاية كبيرة من كل بيضة واحدة في وقت واحد ضد كاندلر.
    5. مراقبة البيض إلى determinه إذا كان خصبة أو العقم.
      ملاحظة: الأوعية الدموية رقيقة مما يؤدي إلى الجنين على شكل حبة وينبغي أن تكون واضحة للعيان. سوف تظهر بويضة غير مخصبة كما بقعة دم صغيرة مع صفار البيض وضوحا.
  2. تجاهل البيض التي هي غير مخصبة، والعودة البيض قابلة للحياة إلى الحاضنة. لا تترك البيض من خارج الحاضنة لأكثر من 30 دقيقة. إذا كانت حالة البويضة لا يمكن تأكيد، علامة عليه، والالتزام به في وقت لاحق.

3. إعداد فيروس اللقاح

  1. تمييع الأسهم فيروس الأنفلونزا إلى حوالي 10 مارس - 10 أبريل PFU / مل في برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على 10 ملي HEPES (7.4 درجة الحموضة). خطوة حاسمة: تمييع الأسهم فيروس فورا قبل الاستخدام والحفاظ على فيروس المخفف على الجليد في كل وقت.

4. فيروسات الأنفلونزا التلقيح عن طريق السقاء الطريق

  1. في يوم التلقيح فيروس (يوم 10 أو 11)، شمعة البيض مرة أخرى والقضاء على أي أجنة ميتة. تمييز الأجنة الحيةأبحث عن الحركة داخل البيضة.
  2. إزالة ثلاث بيضات من الحاضنة، وترتيب البيض في حامل منفصل مع كيس الهواء فوق.
  3. بمناسبة المجال الجوي للبيض مع علامة دائمة.
  4. غسل قشر البيض فوق المجال الجوي مع 70٪ من الإيثانول.
  5. وضع البيض مع مساحة الهواء في كرتون البيض وإلى غطاء للسلامة الأحيائية (BSL-2).
  6. استخدام إبرة معقمة 18G لكمة ثقب صغير في وعاء على كيس الهواء من كل بيضة. يجب الحرص على عدم ادخال الإبرة عميقا جدا لتجنب طعن الجنين أو صفار البيض.
  7. وضع فيروس الانفلونزا المخفف إلى معقمة 1 مل حقنة ونعلق إبرة 22G.
  8. دفع بعناية المحاقن مع إبرة في زاوية 45 درجة في جوف السقاء.
  9. ضخ 0.2 مل من فيروس الانفلونزا المخفف.
  10. تكرار الحقن مع غيرها من اثنين من البيض، ومن ثم التخلص من المحاقن والإبر.
  11. ختم حفرة مع قطرة من الغراء من مسدس الغراء (أو ذاب شمع البارافين). Bالبريد الدقيق الذي الغراء لا تسرب داخل البويضة.
  12. وضع البيض مرة أخرى في حاضنة البيض مع وأشار المجال الجوي أعلى.
  13. كرر الخطوات من 4،2-4،12 حتى يتم تلقيح جميع البيض.

5. الحضانة الوقت

  1. احتضان البيض المصابين دون تحول عند 37 درجة مئوية والرطوبة 60٪ ~.
  2. اختيار الأمثل فترة حضانة تبعا لنوع فيروس الانفلونزا. احتضان الأنفلونزا A لمدة 48 ساعة. احتضان الإنفلونزا B و C لمدة 72 ساعة.

6. فيروسات الأنفلونزا الحصاد

  1. بعد فترة الحضانة، هدئ البيض عند 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات (أو O / N) لقتل الجنين وانقباض الأوعية الدموية للحد من مخاطر تلوث السائل السقاء بعدوى الدم. هل هذا لمنع خلايا الدم الحمراء من امتصاص الفيروس، مما يقلل من العائد. بدلا من ذلك، البيض البرد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة -20 درجة مئوية؛ ولكن هذا يزيد من خطر تلوث الدم.
  2. بعد أن كان البيض المبردة بما فيه الكفاية، ونقل البيض إلى غطاء للسلامة الأحيائية. وضع البيض إلى حامل ثابت مع كيس الهواء مواجهة. تنظيف السطح البيض مع الايثانول 70٪.
  3. استخدام مقص العقيمة لفتح قشر البيض فوق كيس الهواء. إزالة القشرة حول كيس الهواء مع الحرص على عدم تدمير غشاء مشيمائي.
  4. فتح غشاء مشيمائي مع ملقط حادة معقمة. بلطف التحرك جانبا الجنين وكيس الصفار مع ملعقة صغيرة أو ملعقة. الحرص على عدم تمزق صفار البيض.
  5. باستخدام 1 مل إيبندورف ماصة، وجمع بعناية السوائل السقاء. إذا لزم الأمر، إمالة البيض قليلا إلى الجانب لجمع السائل كما قدر الإمكان.
  6. الجمع بين السائل السقاء من جميع البيض في 50 مل أنبوب مخروطي البلاستيك. إبقاء الأنابيب على الجليد في جميع الأوقات أثناء الحصاد الفيروس. غلة واحدة البيض من 5 - 10 مل من السائل مصفر قليلا.
  7. تدور السائل السقاء التي تحتوي على الفيروس في 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 46؛ C لتكوير الحطام. نقل السوائل واضحا في أنبوب جديد 50 مل أبقى على الجليد. التخلص البيض في وعاء النفايات BSL-2.

7. التخزين

  1. قسامة فورا أوضح سقائية السائل (على سبيل المثال، 50، 100 أو 500 مأخوذة UL) والمفاجئة للتجمد في النيتروجين السائل. نقل مخزونات فيروس المجمدة إلى -80 ° C الثلاجة لمدة التخزين على المدى الطويل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تطوير طرق متعددة لعيار الفيروس الأنفلونزا. واحد الاعتبار عند اختيار الطريقة المناسبة هي التي تحدد بعض مجموع الجسيمات بغض النظر عن جدوى (على سبيل المثال، راصة دموية الفحص) في حين تستند الآخرين على العدوى، والتي سوف تقيم virions قابلة للحياة (على سبيل المثال، فحص اللوحة) 6. هنا، تم تحديد عيار الفيروسية من السوائل السقاء تم جمعها من بيض الدجاج تلقيح مع فيروس الإنفلونزا تكييفها الماوس (A / PR / 8/34) عن طريق فحص اللوحة (الشكل 1)، وم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسبب الإنفلونزا في العبء العالمي للمرض واسع، ويستمر العمل في فهم التسبب في إصابة الرئة 7. لبحث سهلت في هذا المرض الفتاك، وضعت أساليب مختلفة لنشر فيروس انفلونزا 6. هنا، نحن تصف تقنية لإنتاج فيروس الإنفلونزا في بيض الدجاج. وميزة هذه الطريقة هي أنها تكرار للغاية والنتائج في كميات كبيرة من مخزونات فيروس أنفلونزا عيار عالية، والتي غالبا ما تكون ضرورية للدراسات في المختبر.

ومعظم المختبرات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم الدراسة الحالية من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة HL120947 (PC) و HL103868 (PC) وجمعية القلب الأمريكية Grant-in-Aid (PC.)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

محلول حاضنة البيض المرطب

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Cellgro 21-040-CV
مصل الدم الخالي من مسببات الأمراض (SPF) بيض الدجاج المخصب  VALO BioMedia
 FARM iNNOVATORSموديل 2100
تيرنر بيض أوتوماتيكيFARM iNNOVATORSموديل 3200
شمعةبيض FARM iNNOVATORSموديل 3300   ؛
1 مل حقنةBD Bioscience309659
18G إبرةBD Bioscience305196
20G / 22G إبرةBD Bioscience305176 / 305156
HEPESSigma-AldrichH3375
Ethanol >99.5٪Sigma-Aldrich459844مخفف إلى 70٪ باستخدام
مسدس غراء الماء "Ad tech Hi Temp Project Pro "Ad Tech، Adhesive Technologies، Inc.نموذج 1105
الغراء "Ad tech MINI SIZE ، Multi Temp"Ad tech ، Adhesive Technologies ، Inc.220-34ZIP30
خلايا MDCKATCCCRL-2935
خلايا الدم الحمراء المغسولة المجمعة في تركيا ، 10٪مختبرات لامبيرالبيولوجية 724908

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
  2. Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
  3. Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
  4. Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
  5. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
  6. Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , Wiley. (2006).
  7. Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
  8. Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
  9. Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
  10. Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة