Method Article

المتوازية الوراثية مع نيون البروتينات للتطبيقات المضاعفة

DOI:

10.3791/52452

⸱

April 14th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ اكتشاف جين البروتين الفلوري الأخضر ، أثرت بروتينات الفلورسنت على بيولوجيا الخلية الجزيئية. يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام التعبير عن البروتينات الفلورية المتميزة من خلال الهندسة الوراثية للترميز الشريطي للخلايا الفردية. يتيح الإجراء تتبع مجموعات سكانية مميزة في خليط خلوي ، وهو مثالي للتطبيقات متعددة الإرسال.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحدثت البروتينات الفلورية والأصباغ الفلورية والفلوروفورات بشكل عام ثورة في مجال بيولوجيا الخلية الجزيئية. على وجه الخصوص ، مكن اكتشاف البروتينات الفلورية وجيناتها من هندسة اندماج البروتين من أجل التوطين ، أو تحليل تنشيط النسخ وترجمة البروتينات ذات الأهمية ، أو التتبع العام للخلايا الفردية ومجموعات الخلايا. سمح استخدام جينات البروتين الفلوري جنبا إلى جنب مع تقنية الفيروسات القهقرية بالتعبير عن هذه البروتينات في خلايا الثدييات بطريقة مستقرة وموثوقة. يظهر هنا كيف يمكن للمرء استخدام هذه الجينات لإعطاء الخلايا داخل مجموعة من الخلايا بصمتها الحيوية الخاصة. نظرا لأن التوقيع الحيوي يتم تحقيقه باستخدام تقنية الفيروسات القهقرية ، يتم ترميز الخلايا "إلى أجل غير مسمى". على هذا النحو ، يمكن تتبعها بشكل فردي داخل مزيج من الخلايا المشفرة واستخدامها في تطبيقات بيولوجية أكثر تعقيدا. يعد تتبع المجموعات السكانية المتميزة في خليط من الخلايا مثاليا للتطبيقات المتعددة مثل اكتشاف الأدوية ضد العديد من الأهداف أو ملف تعريف التنشيط للمروجين المختلفين. يصف البروتوكول كيفية تطوير وتضخيم خلايا الثدييات المشفرة بأناقة باستخدام علامات فلورية وراثية مميزة ، وكيفية استخدام عدة علامات في وقت واحد أو علامة واحدة بكثافة مختلفة. أخيرا ، يصف البروتوكول كيف يمكن استخدام الخلايا بشكل أكبر مع المقايسات القائمة على الخلايا لزيادة قوة التحليل من خلال تعدد الإرسال.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقنيات مثل التحليل الطيفي مضان، مضان المجهر والتدفق الخلوي، وكلها تعتمد على مضان، خاصية استغلال على نطاق واسع في التطبيقات الكيميائية الحيوية، الطب الحيوي، والكيميائية. مضان، سواء جوهري أو من خلال وضع العلامات تم استغلاله، لتحليل البروتين أنماط التعبير وملامح، ومصير الخلية، وتفاعلات البروتين والوظائف البيولوجية 1-9، ومن خلال مضان / فورستر نقل الطاقة الرنين للكشف عن التفاعلات جزيء حيوي والتغيرات متعلق بتكوين 10-13. منذ عزل Aequorea فيكتوريا الأخضر الفلورسنت البروتين (GFP) 14، واكتشاف طبيعيا البروتينات الفلورية إضافية من الكائنات المجوفة الأخرى، وخاصة الشعاب المرجانية، ازداد إلى حد كبير ع....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد خلايا الثدييات وإنتاج الفيروسية وتنبيغ لالمتوازية الوراثية

  1. لوحة 2.5 × 10 6 الخلايا الملتصقة في 10 سم لوحة (أو حوالي 50-60٪ confluency) يوم واحد قبل ترنسفكأيشن في Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) مع 10٪ مصل العجل الجنين (FCS). للفيروسات الرجعية استخدام الإنتاج التعبئة والتغليف خلية خط لاختيار مثل فينيكس-GP (هدية عينية من غاري نولان، جامعة ستانفورد).
    ملاحظة: خط الخلية التعبئة والتغليف يعبر عن مستقر الكمامة وبول البروتينات لتشكيل الجسيمات فيروسات في العابرة. جعل خلايا المؤكد صحية والالتزام بها لوحة ف....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مضاعفة الفلورسنت barcoded وراثيا الخلايا لأغراض التطبيقات البيولوجية يمكن أن يتحقق إلا مرة واحدة وقد ولدت السكان نسيلي الفردية. مضاعفة هو الأكثر فعالية عندما السكان barcoded لها خصائص متميزة الفلورسنت واضحة مع الحد الأدنى من التداخل الطيفي. على سبيل المثال هو موضح في الشكل 1 مع السكان نسيلي خلايا الثدييات SupT1 يوضح أن الخلايا barcoded مع mCherry وcyano البروتين الفلوري (CFP) يمكن تحليلها بسهولة في وقت واحد دون أن تفقد خصائصها الفلورسنت الفردية. وبالتالي هذه المصف.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا تم الجمع بين اثنين من إجراءات راسخة؛ الهندسة الوراثية من خلال التكنولوجيا فيروسات والكشف عن البروتينات الفلورية باستخدام التدفق الخلوي. الفلورسنت المتوازية الوراثية القائم على البروتين لإنتاج خطوط الخلايا الفريدة توفر وسيلة قوية وبسيطة لتطبيقات المضاعفة. توليد خلايا barcoded المهندسة وراثيا من خلال التكنولوجيا فيروسات الرجعية، في البداية عملية طويلة، ولكن يسمح احد للحصول على، عند إنشائه، مصدر موثوق ومستقر من المواد الخلية. طبيعة هذه التكنولوجيا تنتج باستمرار خطوط الخلايا المعد.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونود أن نشكر الدكتور غاري نولان من جامعة ستانفورد لتوفير خط الخلية التعبئة والتغليف فينيكس GP لإنتاج جزيئات فيروس. نشكر الدكتور روجر تسين في جامعة كاليفورنيا في سان دييغو لتوفير TD الطماطم. كما نود أن نشكر مرفق سان دييغو جامعة ولاية التدفق الخلوي الأساسية لخدمتهم والمساعدة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 مل محاقنBD309604تستخدم لتصفية الفيروس
0.45 & micro; مرشح م ploytetrafluoroethylenePall Corporation4219المستخدم لتصفية الفيروس
DMEM (وسط النسر المعدل من Dulbecco)وسائط نمو الخلايا Corning45000-304لخلايا HEK 293T
PEI (Polyethylenimine)poly23966-2تركيز 2 مجم / مل يستخدم
جهاز طرد مركزي دلو معلق (مبرد)Eppendorf5805 000.017يستخدم ل عدوى الدوران
PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات)Corning21-040-CVيستخدم لغسل الخلايا
البوليبرين (بروميد سداديميثرين)سيجما ألدريتش107689يستخدم لزيادة كفاءة العدوى الفيروسية. تستخدم في 5 & ميكرو; تركيز جم / مل.
FACSAriaBD Biosciencesالمستخدمة لفرز مجموعات الخلايا أداة
FACSCantoBD Biosciencesالمستخدمة لتحليل الخلايا
هدية Phoenix-GPGary Nolanالمستخدمة لإنتاج جزيئات الفيروسات القهقرية
مصل عجل الجنينMediatechMT35015CV تستخدم لنمو الخلايا وفرز
خلايا SupT1ATCCCRL-1942الخلايا الليمفاوية التائية البشرية
خلايا HEK 293Tخلايا ATCCCRL-11268الكلى الجنينية البشرية التي تحتوي أيضا على وسائط نمو الخلايا SV40 الكبيرة T
T RPMI 1640Corning10-040-CVلخلايا SupT1
Sciences أداة من خط خلايا خلايا

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescent ProteinsRetroviral TechnologyFlow CytometryFluorescent Activated Cell SortingGenetic BarcodingMultiplexed ApplicationsCell Based AssaysFluorescent MarkersClonal PopulationsViral Transduction

Related Articles