مقالة منهجية

توصيف وظيفي نا + / H + المبادلات بين الخلايا من المقصورات عن طريق بروتون-مما أسفر عن مقتل اختيار للتعبير عنها في غشاء البلازما

DOI:

10.3791/52453

⸱

مارس 30, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الجزء الأول من هذه المقالة كيفية تحديد خطوط الخلايا الطافرة التي تعبر عن المبادلات الحويصلية Na + / H + في غشاء البلازما. يوفر الجزء الثاني بروتوكولات تستند إلى قياسات الأس الهيدروجيني داخل الخلايا وامتصاص الأيونات السريع ، والتي تستخدم لتحديد انتقائية الأيونات والمعلمات الحركية لهذه المبادلات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحمض Endosomal أمر بالغ الأهمية لمجموعة واسعة من العمليات، مثل إعادة التدوير البروتين وتدهور، مستقبلات الحساسية، وناقل عصبي تحميل في الحويصلات المشبكية. يتم وصف هذا تحمض أن بوساطة ATPases بروتون، بالإضافة إلى النقل كلوريد CLC. غاية الحفاظ-البروتونات النقل electroneutral، وأعرب نا + / H + المبادلات (NHE) 6 و 7 و 9 أيضا في هذه المقصورات. وقد تم ربط الطفرات في الجينات مع الأمراض المعرفية والعصبية البشرية. ومن المفارقات، تظل أدوارهم بعيد المنال، وتوطين لهم داخل الخلايا منعت توصيف وظيفي مفصل. وتظهر هذه المخطوطة طريقة لحل هذه المشكلة. هذا يتكون من مجموعة من خطوط الخلايا الطافرة، قادرة على قيد الحياة تحمض عصاري خلوي الحاد من خلال الاحتفاظ NHEs داخل الخلايا في الغشاء البلازمي. ثم يصور اثنين من البروتوكولات المكملة لقياس الانتقائية أيون والنشاطهذه المبادلات: (ط) واحدة على أساس قياسات درجة الحموضة داخل الخلايا باستخدام المجهر مضان الفيديو، و (ثانيا) واحدة على أساس حركية سريعة الامتصاص الليثيوم. هذه البروتوكولات يمكن استقراء لقياس غيرها من شركات النقل غير كهربي. وعلاوة على ذلك، فإن الإجراء اختيار المعروضة هنا يولد خلايا مع الاحتفاظ النمط الظاهري خلل داخل الخلايا. لذلك هذه الخلايا سوف التعبير عن الأخرى أيضا بروتينات الغشاء الحويصلي على غشاء البلازما. ولذلك فإن استراتيجية التجريبية يصور هنا تشكل أداة قوية محتملة لدراسة البروتينات داخل الخلايا الأخرى التي سيتم ثم أعرب عنها في غشاء البلازما جنبا إلى جنب مع حويصلي نا + / H + المبادلات المستخدمة في اختيار.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عرض معظم مقصورات درجة الحموضة داخل الخلايا اللمعية الحمضية، وهي معلمة رئيسية للنضوج، والاتجار، وإعادة التدوير من البروتينات أو الهرمونات والناقلات العصبية تحميل. وقد تبين أن يتم إنشاء التدرج درجة الحموضة بين العصارة الخلوية والحويصلي المحتوى من قبل فجوي H + ATPases 1، بالإضافة إلى حويصلي النقل كلوريد CLC 2. سواء في طرق المغادرة (KO) الفئران والمرضى من البشر، وقد تم تسليط الضوء على أهمية هذه الناقلين من الظواهر الثقيلة التي تسببها طفرات في جيناتها 3-6.

ووصف أعضاء المبادلات الصوديوم والهيدروجين SLC9A الأسرة، وكذلك NHEs لنا + / H + المبادلات، وقد ثبت أن تكون المؤثرات الرئيسية في درجة الحموضة داخل الخلايا وتنظيم حجم الخلية، وكذلك في نقل اتجاهي من مكافئات الحمضي القاعدي عبر الظهارة . إلى جانب NHEs غشاء البلازما، وثلاثة حفظا للغاية نا + / H + المبادلات، NHE 6 و 7ويتم التعبير عن 9 في شبكة عابرة للجولجي والإندوسومات في وقت مبكر (7). وقد تم ربط الطفرات في الجينات مع Angelman تشبه أو كرستيانسون المتلازمات 8-9 والتوحد القائم على الأسرة 10 ونقص الانتباه فرط النشاط اضطراب 11-12. كما شاركت هذه المبادلات في المشاكل العصبية مثل مرض الزهايمر القابلية 13 و X-ربط التخلف العقلي الجينات متجاورة متلازمات 14. أخذت معا، وتبرز هذه الدراسات على أهمية هذه NHEs داخل الخلايا في نمو الدماغ و / أو وظيفة.

توطين الخلايا من هذه المبادلات يمنع قياسات دقيقة من الانتقائية أيون، والاتجاه النقل والمعلمات الحركية، والتنظيم. كما هو الحال بالنسبة لجميع الناقلين أعرب في المقصورات داخل الخلايا، فإنه من الصعب للغاية لتقييم أنشطتها الحيوية، وبالتالي التوصل إلى فهم كامل أدوارهم الفسيولوجية وميكانالمذهبين الكامنة آثارها المرضية. وبناء على عصاري خلوي تركيز K + عالية، وكانت الفرضية الأكثر شيوعا قبلت أن كانوا يعملون كما K + جانب بروتون النقل هروب رأس المال. وكان وجود مثل تسرب بروتون تم الافتراض، لأنها قد موازنة بروتون ضخ من قبل V-ATPases من أجل الحفاظ على حالة الاستقرار حويصلي درجة الحموضة. والهدف من هذه المادة هو البصرية (ط) ليبرهن على وجود طريقة التي تسمح للاختيار الوراثية من خطوط الخلايا التي تعبر عن هذه الناقلين حويصلي في غشاء البلازما الخاصة بهم، و (ثانيا) لإظهار نهجين مستقلة لقياس وظائف هذه الناقلين.

قبل ثلاثة عقود، Pouysségur وفرانكي كان لها السبق في نهج الجيني التي مكنت الاستنساخ الجزيئي وتوصيف أعضاء الأسرة NHE 15. وقد استند هذا على سمية البروتونات داخل الخلايا كوسيلة من وسائل الفحص. وكانت الخطوة الأولى للحصول على خطوط الخلايا ناقصةفي أي نا + / H + الصرف التي أعرب عنها في غشاء البلازما، وذلك باستخدام عكس هذا الناقل. تم مسبقة الخلايا الليفية (CCL39 خط خلية) مع نا + أو لي + ثم توضع في وسيلة خارج الخلية الحمضية (الرقم الهيدروجيني 6.5) لمدة 2 ساعة. وأدى ذلك إلى موت خلايا تعبر عن وظيفي نا + / H + الصرف واختيار خلايا antiporter ناقص (PS120 خط الخلية) 16. عندما يزرع في خالية من بيكربونات المتوسطة، وهذه الخلايا هي حساسة جدا لتحمض داخل الخلايا الحاد. ونتيجة لذلك، وسيتم اختيار التعبير عن أي آلية بروتون هروب رأس المال وظيفية في غشاء البلازما إيجابيا (انظر 17) إذا قدمت مثل هذه الخلايا إلى داخل الخلايا acidifications الحادة. تقنيات تحمض مثل هذه يمكن استخدامها لعزل خطوط الخلايا مع الاتجار العيوب تمكين التعبير القسري للNHEs داخل الخلايا WT على غشاء البلازما.

كما حقيقية النواة نا + / H+ المبادلات هي electroneutral، فهي ليست قابلة للقياس من قبل النهج الكهربية التي استخدمت مع النجاح الكبير لقياس القنوات. لذا يوضح هذا المخطوط كيفية قياس نشاط هذا مبادل من قياسات درجة الحموضة داخل الخلايا وحركية السريع لامتصاص الليثيوم. كما المفاهيم الأساسية هي نفسها، ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أن العديد من العمليات التي وضعت لاختيار القسم تستخدم أيضا بشكل مباشر عن القياسات الوظيفية.

ومن المثير للاهتمام، لاحظنا أن العيب الاتجار الحالي في خطوط الخلية المحددة باستخدام النهج الوارد وصفها في هذه المخطوطة يؤدي إلى التعبير أكبر من البروتينات حويصلي أخرى في غشاء البلازما مثل قناة البوتاسيوم حويصلي TWIK1 18. وهذا يشير إلى نحو اختيار آلية عيب الاحتفاظ العامة للبروتينات الغشاء حويصلي. وبالتالي هذا الإجراء الاختيار وخلايا أنه يولد مايوتشكل أداة واعدة بالنسبة للمجتمع العلمي تعمل على بروتينات الغشاء من المقصورات داخل الخلايا. وكذلك تقنيات قياس المقدمة هنا قد تكون قابلة للتطبيق لدراسة أخرى الناقلين غير كهربي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. H + قتل اختيار

  1. خطوط الخلايا
    1. ثابت بالنقل خلايا NHE التي تعاني من نقص (على سبيل المثال، PS120 خط الخلية المستمدة CCL39 16) باستخدام أي مزيج من متجه التعبير الثدييات وطريقة ترنسفكأيشن من شأنها أن تنتج عائدات ترنسفكأيشن كفاءة والتحديد في خط الخلية الليفية.
      ملاحظة: لسنوات عديدة كانت تستخدم فوسفات الكالسيوم هطول الأمطار 19 مع عائدات ترنسفكأيشن جيدة. تم استبدال هذا أكثر مؤخرا من قبل الكواشف التجارية مثل Lipofectamine2000، وtransfections الذي يقوم باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  2. حلول
    1. إعداد ثلاثة حلول عقيمة وصفها على النحو التالي. تعقيم هذه الحلول عن طريق الترشيح (0.22 ميكرون).
      1. إعداد NH 4 + الحل تحميل (7.4 درجة الحموضة) تتألف من 50 ملي NH 4 CL، 70 ملي كلوريد الكولين، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي GLucose و 15 ملي اجتماعات الأطراف في درجة الحموضة 7.4.
      2. إعداد الحل شطف (درجة الحموضة 7.0) تتألف من 120 ملي كلوريد الكولين، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، الجلوكوز 5 ملي و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.0.
      3. يعد حل الاسترداد (7.4 درجة الحموضة) تتألف من 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4.
  3. قبل البدء في الاختيار، والحصول على حاضنة الثقافة الخلية التي يمكن استخدامها عند 37 درجة مئوية مع عدم وجود CO إضافي 2 من خزان الوقود الخارجي (وهو ما يسمى CO 2 - حاضنة "الحرة")، و5٪ CO 2 سيؤدي إلى التخزين المؤقت التي قد تنال من التحميض. تضخيم خط الخلية تعبر عن NHE من الفائدة تصل إلى حوالي 2 × 10 8 خلايا (عادة حوالي 20 متكدسة 100 لوحات ملم).
  4. H + قتل الإجراء:
    1. احتضان الخلايا معربا عن NHE داخل الخلايا من الفائدة لمدة 1 ساعة في الحل تحميل، في 37 ° C في الحاضنة خالية من CO 2.
    2. نضح الحل التحميل وثم شطف لهم مرتين في الحل وصفها-شطف أعلاه. تنفيذ هذه الخطوة بشكل فعال للقضاء على المتبقي خارج الخلية NH 4 الكلورين التي من شأنها أن تنال من إنشاء حاد NH 4 + التدرج من شأنها أن تولد والتحميض.
    3. القضاء على المديين المتوسط ​​شطف بواسطة الطموح واحتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في حل الانتعاش مرة أخرى عند 37 درجة مئوية في حاضنة المجانية CO 2.
    4. استبدال المتوسطة الانتعاش مع مستنبت منتظمة (عادة DMEM مع 7.5٪ FCS) وتنمو الخلايا في ظروف الثقافة القياسية (37 درجة مئوية في جو مرطب من CO 2 و 95٪ الجوية 5٪).
  5. كرر هذه الدورة من اختيار مرتين في الأسبوع حتى تظهر الحيوانات المستنسخة مستقرة.
    ملاحظة: خذ رعاية خاصة فيما يتعلق زراعة الخلايا وشروط الاختيار. أشهر من العمل يمكن أن تكون مدمرة من قبل أي تلوث التي هي أكثر عرضة للسccur بعد فترة طويلة من الثقافة والتلاعب خلية المتكررة.
    1. هنا، اختر ما إذا لتضخيم الحيوانات المستنسخة وتميز منهم على حدة كما هو موضح في أقسام 2-3، أو تجمع لهم معا لتوليد سكان الخلوي قبل التوصيف.
  6. تطبيق الاختيار بين الحين والآخر (حوالي مرة كل أسبوعين) للاحتفاظ خلايا مقاومة للحموضة من قبل تلك التي ربما تكون قد عادت إلى حساسة للحمض النمط الظاهري الوالدين (الشكل 1B)، اختيار المضاد.

2. بين الخلايا درجة الحموضة القياسات

2.1) التصوير الإسفار درجة الحموضة

  1. استخدام ratiometric الحساسة درجة الحموضة الفلورسنت صبغ BCECF / AM، وهو الرقم الهيدروجيني الحساسة عندما متحمس في 490 نانومتر، وتمتلك 445 نقطة isosbestic نانومتر، بعد بروتوكولات المصنعة.
    1. بدلا من ذلك، استخدام غيرها من تحقيقات حساسة للدرجة الحموضة، وبعد بروتوكولات الشركة المصنعة.
  2. استخدام التصوير المنصوص يخدعsisting من مجهر مقلوب بالإضافة إلى كاميرا فيديو عالية الحساسية. تجهيز هذه المجموعة مع 450 نانومتر و 490 نانومتر الضيقة المرشحات تدخل الفرقة يقترن الكوارتز المناسبة مرشحات الكثافة محايدة لالإثارة.
    1. إذا كان ذلك ممكنا، استخدم مجموعة مناسبة من المرشحات وشروط الإضاءة لإعداد قيم مضان مماثلة لλ1 وλ2 بحيث تقترب نسبة 1. أيضا تجنب القيم مضان القاعدية التي تم تعيينها إما تشبع أو منخفضة جدا، سواء بالنسبة للλ1 و / أو λ2. وهذا قد تسفر عن القطع الأثرية الهامة كما ثم نسبة قد يكن كشفها على الرغم من أن درجة الحموضة داخل الخلايا يتغير.
      ملاحظة: هذا النظام يجب تمكين نضح السريع، والإثارة في الوقت الفاصل بين اثنين من موجات المذكورة أعلاه والاستحواذ في الطول الموجي الانبعاثات السليم (535 نانومتر لBCECF). تجهيز نظام مع برنامج تمكين الحصول على البيانات التلقائي والتخزين.

2.2) قياس NHE إلى الأمام آخر (بثقالبروتونات من العصارة الخلوية)

  1. تحمض الخلايا عن طريق حضانة 1 ساعة في حل NH 4 + التحميل (راجع الخطوة 1.4) في غياب CO 2.
  2. إضافة BCECF-AM (5 ميكرومتر تركيز النهائي) إلى حل لآخر خمس دقائق ومن ثم شطفه مع NH 4 + الحل تحميل للقضاء على التحقيق خارج الخلية.
  3. تركيب الخلايا على المجهر وأخذ عدة صور لتسجيل خط الأساس مستقرة. يروي الحل شطف (انظر أعلاه). وهذا يؤدي إلى انخفاض في مضان المقابلة لالتحميض.
  4. بعد استقرار درجة الحموضة، ويروي أي من الحلول الواردة أدناه لقياس معدلات الاسترداد درجة الحموضة بوساطة لي + / H +، نا + / H + K + أو / H + الصرف. يحتوي كل حل كاتيون اقتران المحتملين لفحصها لH + الصرف. إذا تم نقل واحد من هؤلاء، وهذا سوف يؤدي إلى زيادة مضان في 495 نانومتر التي سوف الموافقأندو إلى زيادة في درجة الحموضة داخل الخلايا:
    120 ملي LiCl، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4
    120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4
    125 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4

2.3) قياس NHE آخر عكسي

ملاحظة: إن المبدأ هنا هو عكس الغشاء التدرجات الأيونية.

  1. قبل القياس، تحميل الخلايا مع الموجبة داخل الخلايا من الفائدة (انظر أدناه).
  2. احتضان لهم لمدة 5 دقائق مع BCECF / AM (راجع الخطوة 2.2.2)؛ شطف لهم، جبل لهم على المجهر الفيديو.
  3. يروي الحل التحميل وتأخذ عدة صور لتسجيل خط الأساس مستقرة.
  4. بعد استقرار خط الأساس، صورة الاختلافات درجة الحموضة عند و perfused الخلايا مع وسيلة الحمضية خارج الخلية التي تحتوي على 120 مM كلوريد الكولين، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 الجلوكوز ملي و 15 ملي زارة التربية والعلم في درجة الحموضة 6.5.
  5. لLiCl التحميل واحتضان خلايا لمدة 2 ساعة في محلول مكون من 120 ملي LiCl، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4. الليثيوم داخل الخلايا يقاس الامتصاص الذري الطيفي غلة قيمتها نحو 60 ملي.
  6. لنا + التحميل واحتضان خلايا لمدة ساعتين في محلول مكون من 120 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2، 2 مم CaCl 2، 5 ملي الجلوكوز و 15 ملي HEPES في درجة الحموضة 7.4 بحضور 1 ملم ابائين لمنع نا / K أتباز. في هذه الظروف، بين الخلايا تركيز نا + هو في حدود 40 مم.
    ملاحظة: K + تحميل ليس من الضروري كما K + عصاري خلوي التركيز هو في حدود 140 مم وموجهة ظاهريا-K + التدرج هو بالتالي من السهل تحقيق.

2.4) العلاج ومعايرة البيانات:

ملاحظة: هذه الخطوة ينطبق على كل من القياسات إلى الأمام وعكس.

  1. في نهاية كل تجربة، يروي خلايا بمحلول مكون من 140 ملي بوكل، 20 ملي HEPES و 5 ميكرومتر nigericin تعديلها لقيم درجة الحموضة ما بين 6.5 و 7.4.
  2. جمع البيانات والقياسات مضان من الصور (مستويات الرمادي تمثل مستويات كثافة) والتصدير تحت تنسيق النص وعلاج كما هو موضح أدناه باستخدام برنامج جدول بيانات.
  3. حساب القيم الرقم الهيدروجيني بين الخلايا لكل خلية فردية أو المنطقة ذات الاهتمام باستخدام المعادلة التالية:
    الرقم الهيدروجيني = + الباكاف الحمضية (سجل (R-RMIN) / (ماكس R -R)) × F دقيقة (λ2) / F ماكس (λ2)
  4. استخدام دقيقة F (λ2) / F أماه العاشر (λ2) نسبة إذا كان هناك تحقيق تبييض أو تسرب، مما أدى إلى انخفاض في مضان 450 نانومتر في جميع أنحاء التجارب. هذا هو ولكن نادرا جدا ما لوحظ في الظروف المستخدمة في ديستجارب cribed.
  5. كما موجودة في نهاية كل قياس درجة الحموضة بيانات المعايرة، والتحقق ما إذا كانت القيم المحسوبة المناظرة تختلف عن قيم الرقم الهيدروجيني المستخدمة في المعايرة. إذا كان هذا هو الحال، ثم ضبط جميع القيم الرقم الهيدروجيني تجريبيا لمعايرة باستخدام الإجراء التالي:
    1. حساب حاصل التالية (Q، والفرق بين القيم المقاسة / الفرق بين القيم المعايرة). مضاعفة بيانات كله Q. جعل التعديل النهائي من قبل الجمع أو الطرح بحيث القيم المحسوبة سوف تساوي القيم المعايرة المقابلة.

3. قياسات معدلات الأولية للNHE7 التي كتبها سريع لي + امتصاص

  1. خلايا البذور على لوحات متعددة جيدا (6 إلى 24 عاما أيضا) وتحمض لهم باستخدام إما NH 4 تقنية + تحميل المذكورة أعلاه أو بالتناوب nigericin / البقري ألبومين المصل (BSA) تحمض وصفها في 20.
  2. لوحات شطف مرتين بسرعة باستخدام محلول شطف المبين أعلاه ثم احتضان الخلايا في امتصاص الحلول التي تحتوي على 1-10 ملم الليثيوم (أقل قليلا من القيم كم) وتركيزات المطلوب من الكاتيونات و / أو مثبطات التي تهم المبلغ المطلوب من الزمن.
  3. الحفاظ على فترات امتصاص قصيرة ومتسقة (عادة دقيقة واحدة أو أقل) لضمان حسن سير هذا النقل في ظروف معدلات الأولية. وتأكد أيضا من أن جميع الحلول المستخدمة لامتصاص هي متساوي التوتر.
  4. في نهاية الوقت امتصاص، والقضاء على بعناية المتوسطة امتصاص وغسل الخلايا أربع مرات مع المالحة الفوسفات الجليد الباردة مخزنة (PBS). تنفيذ هذه يغسل بأسرع وقت ممكن (أقل من 10 ثانية لأربعة منهم هو المثالي) لمنع هروب رأس المال الليثيوم.
  5. ليز الخلايا في 25٪ حمض النيتريك. تطبيق 250 ميكرولتر لكل بئر من 25٪ حمض النيتريك والسماح لها الجلوس لمدة 1 ساعة على الأقل، ثم إلغاء كل بئر مع نهاية غيض ماصة ونقل تعليق جيدا كله في ميل جديدأنبوب crocentrifuge.
  6. نقل المحللة في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge، الطرد المركزي لهم لمدة 5 دقائق على 15،000 x ج (درجة حرارة الغرفة) لإزالة الحطام الخلوي.
  7. قياس محتوى الليثيوم من supernatants بواسطة الامتصاص الذري الطيفي 21.
    ملاحظة: توفر شركات مختلفة الطيف الامتصاص الذري، والتي يجب أن تكون مجهزة ليثيوم مصباح الكاثود جوفاء. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لأن هذه الآلات هي دقيقة جدا ولكن أيضا حساسة جدا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاختيار:

ويستند اختيار H + قتل على نشر قاعدة ضعيفة الأمونيوم، كما هو مبين في الشكل 1A. وقد رائدة تأثير قواعد ضعيفة والأحماض نشر على درجة الحموضة داخل الخلايا والتر البورون والمتعاونين 22. فكرة أنيقة لاستخدام هذه الظاهرة لإنتاج تحمض قاتلة لاختيار الوراثية إيجابية ثم تم تطويرها من قبل جاك Pouysségur 17. وبموجب هذا البروتوكول، وتنخفض درجة الحموضة داخل الخلايا إلى حو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول وكيفية اختيار الخلايا معربا داخل الخلايا نا + / H + المبادلات في غشاء البلازما دون تغيير تسلسل الأساسي من خلال الطفرات موقع الموجه. ويمكن الآن أن تتسم هذه المبادلات.

ويستند هذا الأسلوب على سمية الخلوية من البروتونات داخل الخلايا لتحديد خطوط الخلايا التي من شأنها التعبير عن حويصلي نا + / H + المبادلات في غشاء البلازما. قد يكون من الممكن، من حيث المبدأ،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون مدينون بشدة لجميع أعضاء المجتمع العلمي الذين يعملون على الأس الهيدروجيني ونقل الأيونات ، والذين ابتكروا وحسنوا القياسات الموضحة هنا. يشكرون بشكل خاص الدكتور جاك بويسيغور الذي ابتكر تقنية اختيار قتل H + المستخدمة هنا. إنهم يعترفون بجامعة نيس صوفيا أنتيبوليس ، و CNRS ، و ANR (JCJC SVSE1 NHEint) و ICST Labex للدعم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
زراعة الخلايا القياسيةالمستخدمة لاختيار قتل H + يتكون من العديد من الأجهزة بأرقام كتالوج مختلفة
حاضنة مع CO2< / sub>SanyoMCO15A
حاضنة بدون CO2< / sub>HeraeusBB6220
غطاء التدفق الصفحي PSM1200NFفيشر & nbsp ؛52010120
DMEM متوسطسيجماD5796
FBS الذهبGE HealthcareA15-151
Penicilin / streptomycinPAAP11-010
Trypsin 10xPAAL11-003
مطياف الامتصاص الذري مع نظام فرن ZeemanThermo ScientificICE 3500 GFZ
LiClsigmaL4408
حمض النيتريكسيجما438073
مجموعة الفحص المجهري بالفيديو الفلوريةLeicaتتكون من العديد من الأجهزة بأرقام كتالوج مختلفة
المجهر الآليالمقلوب LeicaDMI6000B
المجهر الوقوفLeica11888906
11888911
11505180
11888377
حادث التألقلايكا11888901
قوس المحرك 11504166
11888379
11505234
11521505
11522106
ضوء ناقل الحركة LED 8097321
8102034
11521580
اللوحةالآلية Leica11522068
11531172
11521734
11521719
11888423
الكاميرا 11888424
11888373
11507807
11888393
11888259
11888258
11541510
برنامج الحصول على الصور /11888375 لايكا
البصرياتلايكا11506507
11506243
11506203
مضان مصباح زينونلايكاDMI6000
الكاميراهاماماتسو8100601
برنامج11640905
مسبار حساس للأس الهيدروجيني ، BCECF-AMتقنيات الحياةB1170
النيجيريةسيجماN7143
معدات أداة إخراج لايكا تحليلها metafluor / Mmfluor

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
  2. Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
  3. Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
  4. Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse - an animal model for Dent's disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
  5. Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
  6. Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
  7. Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
  8. Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
  9. Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
  10. Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
  11. Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
  12. Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
  13. Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer's disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
  14. Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
  15. Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
  16. Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
  17. Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
  18. Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
  19. Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
  20. Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
  21. Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
  22. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
  23. Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
  24. Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
  25. Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
  26. Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة