Method Article

تحليل التغييرات التعبير الجيني في الفئران الحصين بعد ديب تحفيز الدماغ الأمامي من مهادي نواة

DOI:

10.3791/52457

⸱

March 8th, 2015

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Brigham & Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحتاج الآلية الكامنة وراء التأثيرات العلاجية لجراحة التحفيز العميق للدماغ (DBS) إلى التحقيق. تصف الطرق المقدمة في هذه المخطوطة نهجا تجريبيا لفحص الأحداث الخلوية التي يسببها DBS من خلال تحليل ملف تعريف التعبير الجيني للجينات المرشحة التي يمكن أن تسهل تكوين الخلايا العصبية بعد جراحة DBS.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحفيز العميق للدماغ (DBS) جراحة، واستهداف مناطق مختلفة من الدماغ مثل العقد القاعدية، المهاد، والمناطق تحت المهاد، هو علاج فعال لعدة اضطرابات الحركة التي فشلت في الاستجابة للدواء. وقد بدأ التقدم الأخير في مجال جراحة DBS إلى توسيع نطاق تطبيق هذه التقنية الجراحية لظروف أخرى متنوعة مثل السمنة المرضية، والاكتئاب والوسواس القهري. وعلى الرغم من هذه المؤشرات التوسع، لا يعرف الكثير عن الآليات الفسيولوجية الأساسية التي تسهل التأثيرات المفيدة لعملية جراحية DBS. نهج واحد على هذا السؤال هو لإجراء تحليل التعبير الجيني في الخلايا العصبية التي تستقبل التحفيز الكهربائي. وقد أظهرت الدراسات السابقة وأثار ذلك تكوين الخلايا العصبية في التلفيف المسنن الفئران في DBS استهداف نواة الأمامية من المهاد 1. وتستخدم عملية جراحية DBS استهداف ATN على نطاق واسع لعلاج الصرع المقاوم. وبالتالي، من ينتيريس الكثيرر بالنسبة لنا لاستكشاف التغيرات النسخي الناجمة عن تحفيز كهربائيا ATN. في هذا المخطوط، وصفنا منهجيات لدينا لهدايته stereotactically جراحة DBS استهداف ATN في البالغين فئران ويستار الذكور. نحن أيضا مناقشة الخطوات اللاحقة للتشريح الأنسجة والعزلة RNA، وإعداد [كدنا والكمي RT-PCR لقياس التغيرات في التعبير الجيني. هذه الطريقة يمكن تطبيقها وتعديلها لتحفيز العقد القاعدية ومناطق أخرى من الدماغ شيوعا المستهدفة سريريا. دراسة التعبير الجيني هو موضح هنا تفترض نهجا الجين المستهدف مرشح لاكتشاف اللاعبين الجزيئية التي يمكن توجيه آلية لDBS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التاريخ وراء تطوير تحفيز الدماغ العميق كأسلوب جراحة الأعصاب يعود إلى 1870s في حين استكشاف إمكانية تحفيز كهربائيا الدوائر الدماغ 2. بدأ استخدام التحفيز عالية التردد المزمن كعلاج لاضطرابات العصبية في 1960s 3. في وقت لاحق في 1990s مع ظهور زرع المزمن DBS أقطاب 4-6، واصل عدد من الاضطرابات العصبية التي كانت تعامل من قبل DBS في الزيادة. وقد استخدم تحفيز الدماغ العميق لأول مرة في الولايات المتحدة لعلاج الهزة الضروري 6. اليوم يتم استخدام الجراحة على نطاق واسع لعلاج الاضطرابات العصبية التي هي غير قابل للعلاج عن طريق التدخل الدوائي حاليا. يستخدم DBS حاليا لعلاج اضطرابات الحركة من مرض باركنسون وخلل التوتر 7-9. الزهايمر نوع الخرف، مرض هنتنغتون، والصرع، وآلام والأمراض العصبية والنفسية مثل الاكتئاب، والوسواس القهري، توريت7؛ ق متلازمة والإدمان هي بعض الشروط قابلة للعلاج بواسطة DBS 10-12. بينما عملية جراحية DBS وافقت ادارة الاغذية والعقاقير لعلاج مرض باركنسون، خلل التوتر والهزة الأساسية، واستخدام DBS لعلاج الحالات الأخرى المذكورة أعلاه هي في مراحل مختلفة من المختبر والدراسات السريرية التي تقدم الكثير من الأمل للمرضى 13،14.

سريريا، يتم إجراء عملية جراحية DBS على مرحلتين. المرحلة الأولى تتضمن لتحديد المواقع جراحيا الأقطاب DBS في الموقع التشريحي المستهدف باستخدام مزيج من المواقع الإشعاعي، CT، MRI، وكذلك قراءات مسرى مكروي لتعزيز دقة. المرحلة الثانية تتضمن زرع مولد النبض في صدر المريض العلوي وتركيب تمديد يؤدي من فروة الرأس إلى مولد النبض. استنادا إلى حالة عصبية، والعديد من المخططات البرمجة للمولد النبض تم موحدة وسيتم استخدامها لتقديم الجهد المطلوب. في المجلد النهائييتم التوصل المئوية بطريقة تدريجية بحيث الحصول على أفضل استجابة سريرية مع الحد الأدنى من الجهد 15. ومع ذلك، في دراساتنا، على عكس يزرع DBS المزمنة المستخدمة سريريا، من أجل البساطة، ونحن لجأت إلى دراسة لمرة واحدة التحفيز عالية التردد (لمدة 1 ساعة) في النماذج الحيوانية لدينا.

ويركز الجزء من البحث مجموعتنا على التحقيق في استخدام جراحة DBS لعلاج الصرع المعالجة الحرارية. النهج الجراحية المجسم باستخدام التحفيز الترددات العالية قد تم استكشافها من قبل العديد من الآخرين كخيار فعال لعلاج الصرع طبيا الحرارية التي تشكل حوالي 30٪ من جميع حالات الصرع 10،16،17. التحفيز الدماغي استهداف السطح القشري وكذلك نواة المخيخ العميقة التي استخدمت في الماضي كأهداف لعلاج الصرع 10،18،19. وبالإضافة إلى ذلك، كما تم حاول تحفيز الحصين ولكن مع نتائج متفاوتة 20،21. بعض الآخر التحقيقوتشمل أهداف DBS لعلاج الصرع قشرة الدماغ، المهاد، نواة تحت المهاد والعصب المبهم 8. ومع ذلك، في أعقاب نتائج العديد من الدراسات في السنوات القليلة الماضية، النواة المهادية الأمامية (ATN) برز كهدف DBS الأكثر شيوعا لعلاج الصرع 10،22. على أساس المعرفة حول الدوائر تشريحي عصبي والنتائج من النماذج الحيوانية، وقد ركزت العديد من الدراسات على تأثير علاجي من التحفيز العميق للدماغ من ATN في علاج الصرع 23-26. وATN هو جزء من الدائرة الحوفي، ويقع في منطقة من الدماغ الذي يؤثر على وتيرة مصادرة. الدراسات التي حماني وآخرون، لقد اختبرت فعالية ATN-DBS في بيلوكاربين الناجم عن نموذج الصرع ووجد أن التحفيز ATN الثنائي الإختفاء عن المضبوطات التي يسببها بيلوكاربين وصرعية وضع 24 لفترات طويلة. وعلاوة على ذلك، تم العثور على التحفيز الترددات العالية من ATN للحد من وتيرة مصادرة في نموذج بنتيلين تترازول (PTZ) من الجيش الشعبيilepsy 25،27-29. وذكرت لي وآخرون، انخفاض متوسط ​​في وتيرة مصادرة بنحو 75٪ على التحفيز العميق للمخ المزمن من ATN في علاج الصرع الجزئي صهر 30.

وقد أظهرت دراسة سريرية حديثة حول الصرع المعالجة الحرارية نتائج واعدة بعد الجراحة DBS استهداف النواة المهادية الأمامية (ATN) 22. تجربة سريرية عشوائية متعددة المراكز مع 110 المرضى الذين يخضعون DBS الثنائي من ATN لعلاج الصرع المقاوم (SANTE محاكمة) تدل على وجود انخفاض في وتيرة الاستيلاء عليها ما يقرب من 40٪ 31. ألمح النتائج من هذه الدراسة أيضا على أفضل تأثير مضاد للصرع تأخر لوحظ في 2-3 أشهر بعد الجراحة. مزيد من الدراسات قبل تودا وآخرون، تؤكده مع هذه النتائج حيث أظهرت تكوين الخلايا العصبية يحدث في وقت آخر في وقت لاحق DBS (أيام 3-5) في النماذج الحيوانية 1. وبالإضافة إلى ذلك، إنسيناس وآخرون، وأفادت neurogene الحصينجهاز الأمن والمخابرات في الماوس الكبار التلفيف المسنن بعد التحفيز الترددات العالية من ATN 32. وأفادت الدراسات السابقة 33-35 انخفاض تكوين الخلايا العصبية قرن آمون في بعض الحالات الصرع مثل الصرع المزمن الفص الصدغي وجود علاقة مع عجز التعلم، وضعف الذاكرة وعفوية المضبوطات السيارات المتكررة. وعلاوة على ذلك، كان هناك انخفاض في العوامل السلف الخلايا الجذعية العصبية مثل FGF2 وIGF-1 في قرن آمون صرع مزمنة في النماذج الحيوانية 33. النظر في هذا، والاستراتيجيات التدخلية مثل DBS التي تظهر زيادة من تكوين الخلايا العصبية في التلفيف المسنن هي السبل مثيرة للأبحاث. وقد شجعت هذه النتائج لنا لاستكشاف المزيد عميقا في الآلية الكامنة وراء العلاج تكوين الخلايا العصبية بعد DBS لعلاج الصرع. لقد استهدفت ATN على حد سواء من جانب واحد (البيانات لم تبلغ)، وكذلك على المستوى الثنائي (في نتائج تمثيلية) وينظر neurotrophin مرتفعة (BDNF) التعبير في التلفيف المسنن الفئران. لدينا جurrent الفرضية هي أن عامل التغذية العصبية التعبير يبدأ تعبير سلسلة الجين الذي يبلغ ذروته في تكوين الخلايا العصبية التي تترجم إلى تأثير مضاد للصرع من عملية جراحية DBS. في هذه الورقة، نقدم طرقنا لعملية جراحية DBS استهداف ATN في الفئران تليها تحليل التعبير الجيني كنهج جذابة لدراسة الآلية الكامنة وراء فوائد DBS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان الأخلاق: ملاحظة: جميع الإجراءات التي تمت مناقشتها في هذه المخطوطة هي في فقا للمبادئ التوجيهية NIH للبحوث الحيوان (دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية) وتمت الموافقة من قبل لجنة IACUC كلية الطب في جامعة هارفارد.

1. إعداد ما قبل العمليات الجراحية

  1. تأكد من أن جميع الأدوات الجراحية يتم تعقيم إما عن طريق التعقيم أو التطهير بمحلول مطهر و / أو الايثانول حسب الضرورة. حيثما كان ذلك ممكنا، واستخدام معدات معقمة القابل للتصرف مثل المشارط وإبر والمحاقن.
  2. تغطية طاولة العمل مع الستائر الجراحية والتأكد من أن هناك التخلص من النفايات واقية المتاحة.
  3. وزن الفئران وحساب جرعة التخدير. استخدام مزيج / زيلازين الكيتامين (الكيتامين 75 ملغ / كغ وزيلازين 10 ملغ / كلغ) لتخدير الفئران.
    ملاحظة: بين 200-250 جرام هو الوزن الأمثل لتحديد المناسب للحيوان في إطار المجسم فضلا عن استهداف دقيق للATN. Isoflurويمكن أيضا أن تستخدم انو كوكيل التخدير.
  4. جبل وآمنة قطبين معقمة (تعقيمها بواسطة التعقيم أو مع أكسيد الإيثيلين) على حامل القطب (الشكل 2) من إطار الجراحي المجسم وبمساعدة المجهر (10-40X التكبير) والإطلاع على نصائح من القطب لالسليم المحاذاة. تأمين القطبين 3.0 ملم على حدة.
    ملاحظة: احرص على تفادي تلف طرف القطب عن طريق لمس على الأسطح الصلبة.

2. DBS جراحة

  1. حقن الكيتامين / زيلازين مزيج البريتونى للحيوان وتأكيد أن هذا الحيوان قد وصلت إلى الطائرة من التخدير الجراحي (عن طريق التحقق من منعكس إصبع القدم قرصة، معدل التنفس وعمق وانتظام التنفس). إزالة الشعر من منطقة فروة الرأس التي سيتم قطعي وتطهير فروة الرأس مع 3 الدعك بالتناوب كل من بتدين وإما الكحول أو ملحي معقم. تأمين ووضع الحيوان على فرام المجسمه.
  2. استخدام منصات تداول المياه الدافئة للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان على المستوى الأمثل. تطبيق مواد التشحيم العين لعيون الحيوان للحماية من overdrying.
  3. استخدام الإحداثيات التالية المجسم لاستهداف ATN (الأمامي النواة المهادية): anterioposterior -1.6 ملم، 1.5 ملم الناصف الوحشي وظهري بطني 5.2 مم 1.
    ملاحظة: تعتمد الإحداثيات المجسم على Paxinos واتسون (6 عشر طبعة) الفئران أطلس الدماغ 36.
  4. إجراء شق في فروة الرأس sagittally للكشف عن الجمجمة. باستخدام زوج من الكامشات تأمين فروة الرأس قطعي لفضح الجمجمة. استخدام محلول ملحي معقم لطرد شق. إذا شق رطبة جدا، استخدم قطعة قطن معقمة لتجف. تحديد موقع bregma ووضع علامة مع علامة سوداء. لتوجيه الموقف من الثقوب لدغ، وجعل اثنين من أكثر علامات في حوالي 1.5 ملم mediolaterally على كلا الجانبين من الدرز السهمي و 1.6 ملم الخلفي إلى كورونآل خياطة.
  5. استخدام الحفر باليد لجعل الثقوب لدغ. تأكد من غيض من ثقب لدغ معقم بواسطة تعقيم مع الايثانول. عقد الحفر في حوالي 45 درجة زاوية على سطح الجمجمة عند الحفر. التبديل في كثير من الأحيان بين الثقوب لدغ اثنين لتجنب الحرارة المفرطة في الموقع من أي ثقب لدغ.
  6. تواصل الحفر حتى يتعرض الجافية. باستخدام إبرة مع عازمة طرفها تشبه على شكل "L '، وإزالة أي القطع المكسورة من العظام التي من شأنها عرقلة الإدراج من القطب. الحرص على تجنب إتلاف الجافية و / أو الدماغ الأنسجة الكامنة في حين إزالة شظايا العظام باستخدام إبرة عازمة.
    ملاحظة: استخدام إبرة أضعفت أو ملقط حادة الجميلة هي أيضا خيار.
  7. إصلاح التجمع القطب المزدوج إلى مقبض الدورية للإطار المجسم وإصلاح مقبض بزاوية 90 درجة. باستخدام التعديلات في إطار المجسم، ضع القطب غادر بالضبط فوق bregma.
  8. باستخدام ستيريوتعديلات تكتيكية لتحديد المواقع الناصف الوحشي، وتحديدا تحرك القطب الأيسر 1.5 ملم إلى الجانب الأيسر من bregma مثل أن الآن هناك قطبين المنحازة تماما على طول الدرز الإكليلي ولكن بصرف النظر متباعدة في 1.5 ملم mediolaterally من bregma.
  9. باستخدام تعديلات المجسم anterioposterior، نقل الأقطاب 1.6 ملم الخلفي إلى الدرز الإكليلي.
  10. استخدام التعديلات ظهري بطني لخفض الأقطاب إلى الاختيار الأول إذا تم إجراء ثقوب لدغ في الموقع الصحيح بحيث الأقطاب يمكن إدراج بكل سهولة، دون لمس حواف خشنة من الثقوب لدغ. إذا كان الأمر كذلك، إدراج الأقطاب على عمق 5.2 مم من سطح الجمجمة.
  11. قم بتوصيل أقطاب كهربائية عن طريق يؤدي إلى التحفيز والتشجيع وضعت في 130 هرتز، 2.5 V و 90 μsec pulsewidth 1.
  12. تقديم التحفيز عالية التردد لمدة ساعة (أو لفترة من الوقت المطلوب وفقا الإعداد التجريبية). خلال التحفيز، تذكر أن أؤكد صعمق مخدر روبر بانتظام عن طريق التحقق من عدم وجود انسحاب القدم ردا على قرصة أخمص قدميه. تكملة التخدير مع ما يقرب من نصف الجرعة الأولية المستخدمة للحث على التخدير. تجنب التلوث من القفازات المعقمة الخاصة بك عند التحقق من عمق التخدير وتغييرها إذا لزم الأمر. أداء التحفيز من جانب واحد أو ثنائية على أساس الاحتياجات المرء التجريبية. وتشمل الضوابط مثل التحفيز التردد المنخفض (لعلى سبيل المثال.، 10 هرتز) والحيوانات unstimulated (إدخال أقطاب كهربائية مع عدم وجود التحفيز لاحق).
  13. بعد أن يتم التحفيز، وإزالة الأقطاب بعناية وخياطة الجرح مع الغرز 3-0 أو مع الدبابيس الجراحية المعقمة.
  14. إدارة البوبرينورفين (0.05 ملغ / كلغ) تحت الجلد كما التسكين. مراقبة الحيوانات حتى يعود إلى النشاط العادي ومن ثم إعادته إلى منشأة سكنية.
  15. بعد فترة معينة من الزمن على أساس التصميم التجريبي (على سبيل المثال ل، 0، 3، 6 أو 12 ساعة بعد الجراحة DBS)، الموت ببطء الحيوان مع التخدير جرعة زائدة. بعد التأكد من عدم وجود العلامات الحيوية، قطع رأس الحيوان.
  16. تشريح خارج الدماغ عن طريق إزالة أول الجلد باستخدام المقص. قطع طريق العظام على طول الدرز السهمي باستخدام مقص تشريح. جعل اثنين من أكثر الشقوق (عن شبر واحد لكل منهما) من خلال العظام على كلا الجانبين الجانبية. باستخدام ملقط، ورفع قطعة قطعت جزئيا من العظم من الجزء العلوي من الجمجمة لفضح الدماغ.
  17. باستخدام مقص غرامة أو ملقط، طرد الدماغ من الجمجمة ونقل إلى طبق بتري مع برنامج تلفزيوني الباردة على الجليد.
    ملاحظة: احرص على تفادي تلف في خلايا المخ في حين جعل شقوق من خلال العظام.

3. الحصين عزل

ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في هذا القسم على الجليد.

  1. وضع الدماغ على مصفوفة الدماغ الاكريليك تبريد مسبقا على الجليد. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع الدماغ coronally في حوالي 7-8 ملم من الأمامي أقصى إدجنرال الكتريك من الدماغ. اجراء خفض الثاني coronally والخلفي للأول خطوة من نوعها بحيث يمكن إزالة شريحة الدماغ حوالي 5 مم.
  2. نقل شريحة الدماغ على طبق بتري مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة. باستخدام شفرة حلاقة، قطع القسمين نصف كروية ورعاية الإشارة إلى نصف الكرة الأرضية الذي يتوافق مع الجانبين الأيسر والأيمن على التوالي. هذا مهم بشكل خاص أثناء أداء التحفيز من جانب واحد.
  3. باستخدام ملقط غرامة ومقص إزالة الحصين بعناية.
  4. فلاش تجميد الأنسجة قرن آمون على الثلج الجاف وتخزينها في الثلاجة -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للخطوات استخراج الحمض النووي الريبي لاحقة.
    ملاحظة: للتخزين على المدى الطويل، فإنه من المستحسن لتخزين الأنسجة في -80 ° C الفريزر.

4. استخراج الحمض النووي الريبي والكمية PCR

  1. تأكد من الأنسجة مجمدة في الجليد الجاف لتصبح جاهزة للالتجانس.
  2. ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في غطاء محرك السيارة.
    1. إضافة 1 مل من ثلاثي كاشف لهيبالأنسجة ocampal في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل والتجانس عليه من قبل pipetting الأول عدة مرات حتى يتم كسر الأنسجة في أجزاء أصغر. وعلاوة على ذلك تجانس الأنسجة عن طريق تمرير من خلال حقنة بإبرة G 25 حتى لا الأنسجة دون انقطاع مرئية. تنفيذ الخطوات التجانس على الجليد.
    2. بعد المجانسة الأنسجة، والسماح للتعليق خلية للوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح للتحلل الخلية.
      ملاحظة: بعد هذه النقطة تعليق الخلية يمكن أن تكون سريعة المجمدة وتخزينها في -70 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
  3. إضافة 0.2 مل الكلوروفورم ومزيج من قبل vortexing لمدة 20 ثانية، وترك بقية الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  4. أجهزة الطرد المركزي العينات في 12،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، وإزالة الأنابيب بعناية من دون إزعاج طبقات منفصلة الثلاث التي سوف تكون مرئية.
    ملاحظة: (الأحمر) المرحلة السفلي يحتوي على البروتينات، والمرحلة المتوسطة غائم تحتوي على الحمض النووي وأعلى مرحلة واضحة تحتوي RNA.
  5. نقل المرحلة واضحة العليا (RNA) الى الطازجة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي (عادة 500 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي التي تحتوي على مرحلة يتم الحصول عليها). لهذا إضافة 0.5 مل الأيزوبروبانول ومزيج من قبل vortexing. إلى هذه الوظيفة 2-3 الجليكوجين ميكرولتر (20 ملغ / مل) باعتبارها الناقل للRNA. السماح للعينة للراحة على الطاولة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  6. الطرد المركزي العينة في 12،000 x ج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. تأكد من أن بيليه RNA مرئيا في الجزء السفلي من الأنبوب.
  7. تجاهل طاف ويغسل بيليه RNA عن طريق إضافة 1 مل من الايثانول 75٪ (مع المياه مجانا نوكلياز). عكس العينة عدة مرات حتى يزيح بيليه من أسفل الأنبوب ويعوم في الحل. أجهزة الطرد المركزي الحل في 12،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بيليه في 75٪ من الإيثانول يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية حتى المزيد من الخطوات.
  8. السماح للبيليه RNA إلى الهواء الجاف من خلال ترك الأنابيب مفتوحة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب اوفهص تجفيف بيليه لأن ذلك قد يؤثر على انحلاله في الماء في خطوة لاحقة.

5. إزالة الحمض النووي من إعداد RNA

  1. إضافة 9 ميكرولتر من المياه مجانا نوكلياز لبيليه RNA وتأكد من حل بيليه قبل الشروع قبل vortexing بلطف الأنبوب. لهذا إضافة 1 ميكرولتر من 10X الدناز أنا العازلة و 1 ميكرولتر الدناز المؤتلف (من الدناز I عدة)، مزيج من قبل عبها بلطف الأنابيب، لفترة وجيزة تدور الأنابيب واحتضان عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة.
  2. إضافة 2 ميكرولتر الدناز تعطيل كاشف (من الدناز I عدة) لعينة ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة وتخلط في كثير من الأحيان عبها بلطف الأنبوب. الطرد المركزي في 12،000 x ج لمدة 10 دقيقة ونقل ما يقرب من 10 ميكرولتر من طاف واضح إلى الطازجة 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي.
  3. قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام معمل NanoDrop أو معمل.

6. جعل [كدنا من RNA

  1. إضافة عشر حجم المطلوبةفي تحتوي على 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي وجلب الحجم الإجمالي إلى 8 ميكرولتر بإضافة الماء مجانا نوكلياز. لهذا إضافة 1 ميكرولتر 10 ملي dNTP مزيج 1 ميكرولتر من hexamers عشوائي من عدة مرتفع الأولى ستراند التجميعي. بلطف خلط واحتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في أي حمام مائي أو على thermocycler مبرمجة مسبقا.
  2. جعل الخلطة الجاهزة التي تحتوي على الكواشف التالية: 2 ميكرولتر من 10X RT العازلة، 4 ميكرولتر من 25 M MgCl 2، 2 ميكرولتر من 0.1 M DTT و 1 ميكرولتر من ريبونوكلياز OUT (40 U / ميكرولتر).
    ملاحظة: وبالنظر إلى الكميات هي في رد الفعل، من شأنه أن يحتاج المستخدم لزيادة وفقا لاحتياجات التجريبية واحد.
  3. بعد إزالة RNA يحتوي على عينة من 65 درجة مئوية، ووضع أنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة. إضافة 9 ميكرولتر حل الخلطة الجاهزة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. إضافة 1 ميكرولتر من مرتفع II إنزيم النسخ العكسي (50 U / ميكرولتر)، ثم يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  4. احتضان العينات عند 42 درجة مئوية لمدة 50دقيقة للالنسخ العكسي تحدث.
  5. احتضان العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإنهاء رد فعل.
  6. وضع العينات على الجليد لفترة وجيزة وإضافة 1 ميكرولتر RNAseH (2 U / ميكرولتر) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  7. لفترة وجيزة الطرد المركزي الأنابيب في 3،000 x ج لتدور باستمرار السائل المكثفات.
    ملاحظة: هذا هو [كدنا التي سيتم استخدامها لالكمي PCR. [كدنا يمكن تخزينها في الثلاجة -20 درجة مئوية حتى إعداد PCR. ويمكن أيضا أن تضعف [كدنا مع المياه مجانا نوكلياز قبل الشروع في PCR.

7. الكمي PCR

  1. جعل مزيج الرئيسي الذي يحتوي على الكواشف التالية (مجلدات معينة هم في رد الفعل): 6.3 ميكرولتر من 2X SYBR الأخضر ميكس، 0.6 ميكرولتر من الأمام التمهيدي (10 ميكرون)، 0.6 ميكرولتر من عكس التمهيدي (10 ميكرون) و 0.5 ميكرولتر من المياه nuclease مجانا .
    ملاحظة: تم تصميم التمهيدي باستخدام الخيار في الصفحة تسلسل النوكليوتيدات NCBI في "الاشعال اختيار" لهذا الجين من الفائدة.
  2. إضافة 10 ميكرولتر mastermix إلى كل بئر من 96 لوحة جيدا PCR. إضافة 2.5 ميكرولتر من [كدنا حققها في وقت سابق إلى البئر تحتوي على mastermix. تأكد من تعيين ما يصل ردود الفعل PCR ثلاث نسخ لكل عينة.
  3. بعد الانتهاء من إضافة mastermix وكدنا]، وتغطي لوحة PCR باستخدام ورقة لاصقة البصرية لاغلاق الآبار. تدور لوحة لفترة وجيزة لمدة 5 دقائق في 500 x ج في جهاز للطرد المركزي الطاولة لتسوية كل السائل إلى قاع البئر.
  4. تحميل لوحة PCR على آلة RT-PCR مبرمجة مسبقا. استخدام المعلمات PCR الواردة في الجدول 1.
  5. تحليل البيانات: استخدم القيم C ر من إخراج QPCR لمزيد من العمليات الحسابية. جنبا إلى جنب مع الجين الاختبار، وإعداد ردود الفعل PCR لجينات الرقابة الداخلية، 18S الرنا الريباسي (لضمان مدخلات المساواة) وβ-الأكتين (المراقبة السلبية). حساب التغيرات أضعاف على أساس طريقة ΔΔCt 37.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأرقام 1A و 1B تظهر التعبير النسبي للعامل التغذية العصبية وGABRD نسبة إلى السيطرة الجين β-الأكتين. عامل التغذية العصبية، وكثيرا ما يرتبط في neurotrophin مع آثار اعصاب في العديد من الأمراض العصبية 38-41. ولذلك فمن المثير للاهتمام أن تحليل الشخصية التعبير عن BDNF ردا على التحفيز من ATN التي ينتج الفوائد العلاجية لمرضى الصرع. في الشكل 1A مما يدل على الشخصية التعبير الجيني للعامل التغذية العصبية في جميع أنحاء أشار نقاط في ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد عمل معلما قبل Benabid وآخرون في استخدام التحفيز العميق للمخ لعلاج المرض والهزة الضروري باركنسون، وقد تم التحقيق في تقنية جراحية DBS باهتمام كبير خلال العقد الماضي لعلاج العديد من الاضطرابات العصبية 6،10،43. يتم إجراء دراسات DBS التي تستهدف مختلف المناطق العصبية التشريحية للدوائر الدماغ حاليا من قبل العديد من الجماعات لمعالجة الأمراض العصبية الرئيسية وهي في مراحل مختلفة من التجارب السريرية. التحفيز للنواة تحت المهاد (STN) أو جزء الداخلي من الشاحبة جلوبس (GPI...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي إفصاح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ممتنون لدعم مؤسسة NREF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
التحفيز العميق للدماغ
الإطار التجسيميKopf InstrumentsModel 900
Drill Dremmel7700 ، 7.2 V
مشرطBD372610
كيتامينباترسون البيطري07-803-6637الجدول الثالث المواد الخاضعة للرقابة والشراء والاستخدام والتخزين وفقا للقواعد المؤسسية
زيلازينباترسون البيطري07-808-1947
بوبرينورفينباترسون البيطري07-850-2280الجدول الثالث المواد الخاضعة للرقابة والشراء والاستخدام والتخزين وفقا للقواعد المؤسسية
الدبابيس الجراحيةConMed Corporation8035
خيوط (3-0)   ؛هارفارد72-3333
(1 مل ، 29 1/2 جم)BD329464معقمة ، تستخدم لإعطاء التخدير داخل الصفاق
حقنة (3 مل ، 25 جم)BD309570معقمة ، تستخدم لإعطاء التسكين تحت الجلد
إبرBD305761معقمة ، تستخدم لإزالة قطع العظام المكسورة من ثقوب الأزيز
إيثانولفيشر S25309Bللتعقيم العام  
زيوت تشحيم العينفيشر Scientific19-898-350
محفزMedtronicModel 3628
DBS أقطابرودس الطبية ، CASNEX100x-100 ممالأقطاب الكهربائية هي البيتادين البلاتيني ومتحد المركز وثنائي القطب
(بوفيدون اليود)   ؛PDIS23125أعواد مسحة تستخدم مرة واحدة ، تستخدم لتعقيم فروة الرأس قبل إجراء شق ؛
  تشريح الدماغ وعزل
الأكريليك القوارض مصفوفة الدماغعلوم المجهر الإلكتروني175-300www.emsdiasum.com
شفرة الحلاقةV W R55411-050
مقص المقصلةClauss18039لقطع الرأس ، تأكد من الحفاظ على هذه المقصات في حالة نظيفة وصالحة
مقصكودمان كلاسيكي34-4098يستخدم لإزالة الدماغ من الجمجمة
ملقطعلوم المجهر الإلكتروني72957-06يستخدم لإزالة الدماغ من الجمجمة وللتعامل أثناء تشريح
محلول ملحي مخزن الفوسفات بوسطن بيوبروكتسBM-220
  استخراج الحمض النووي الريبي وتحضير
كاشف ثلاثيسيجماT9424استخدمه دائما في غطاء الدخان وارتد نظارات واقية أثناء المناولة ؛ تجنب ملامسة حقنة الجلد
(3 مل ، 25 جم)ديناربحريني 309570استخدم لتجانس الأنسجة
كلوروفورمفيشر ScientificBP1145-1استخدمه دائما في غطاء الدخان وارتد نظارات واقية أثناء المناولة ؛ تجنب ملامسة الجلد
IsopropanolFisher ScientificA416-1
GlycogenThermo ScientificR0561
Dnase I KitAmbionAM1906
Superscript First Strand Synthesis KitInvitrogen11904-018
جهاز الطرد المركزي الدقيق المنضديةEppendorf5415D
& nbsp ؛ PCR الكمي                           
SYBR Green PCR KitQiagen204143
10668051OligosInvitrogen
المخصصة (96 بئرا)صفائح لاصقة بصرية من Denville ScientificC18080-10
Thermo ScientificAB1170
خالية من النويات المياهالحرارية العلميةSH30538-02
Real آلة PCRللأنظمة الحيوية التطبيقية7500
جراحة حقنة استخدام العلمي أنسجة الحصين(كدنا) لوحات PCR

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of. 108, 132-138 (2008).
  2. Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual review of neuroscience. 29, 229-257 (2006).
  3. Bergstrom, M. R., Johansson, G. G., Laitinen, L. V., Sipponen, P. Electrical stimulation of the thalamic and subthalamic area in cerebral palsy. Acta physiologica Scandinavica. 67, 208-213 (1966).
  4. Benabid, A. L., et al. Chronic electrical stimulation of the ventralis intermedius nucleus of the thalamus as a treatment of movement disorders. Journal of neurosurgery. 84, 203-214 (1996).
  5. Benabid, A. L., et al. Long-term electrical inhibition of deep brain targets in movement disorders. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 13, Suppl 3. 119-125 (1998).
  6. Benabid, A. L., et al. Long-term suppression of tremor by chronic stimulation of the ventral intermediate thalamic nucleus. Lancet. 337, 403-406 (1991).
  7. Tierney, T. S., Lozano, A. M. Surgical treatment for secondary dystonia. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 27, 1598-1605 (2012).
  8. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta neurochirurgica. Supplement. 117, 87-92 (2013).
  9. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation emerging indications. Progress in brain research. 194, 83-95 (2011).
  10. Sankar, T., Tierney, T. S., Hamani, C. Novel applications of deep brain stimulation. Surgical neurology international. 3, S26-S33 (2012).
  11. Tierney, T. S., Vasudeva, V. S., Weir, S., Hayes, M. T. Neuromodulation for neurodegenerative conditions. Frontiers in bioscience. 5, 490-499 (2013).
  12. Mayberg, H. S., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  13. Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic proceedings. 86, 662-672 (2011).
  14. Ch. 4. Rehabilitation in movement disorders. Lansek, R., Morris, M. E. , Cambridge University Press. 36-43 (2013).
  15. Goodwin, R., Tierney, T., Lenz, F., Anderson, W. Ch. 15. Single Neuron Studies of the Human Brain: Probing Cognition. Fried, I., Rutishauser, U., Cerf, M., Kreiman, G. 15, MIT Press. 275-293 (2014).
  16. Hauser, W. A. Epidemiology of epilepsy in children. Neurosurgery clinics of North America. 6, 419-429 (1995).
  17. Hauser, W. A. Recent developments in the epidemiology of epilepsy. Acta neurologica Scandinavica. Supplementum. 162, 17-21 (1995).
  18. Davis, R., Emmonds, S. E. Cerebellar stimulation for seizure control: 17-year study. Stereotactic and functional neurosurgery. 58, 200-208 (1992).
  19. Levy, L. F., Auchterlonie, W. C. Chronic cerebellar stimulation in the treatment of epilepsy. Epilepsia. 20, 235-245 (1979).
  20. Velasco, A. L., et al. Electrical stimulation of the hippocampal epileptic foci for seizure control: a double-blind, long-term follow-up study. Epilepsia. 48, 1895-1903 (2007).
  21. Tellez-Zenteno, J. F., McLachlan, R. S., Parrent, A., Kubu, C. S., Wiebe, S. Hippocampal electrical stimulation in mesial temporal lobe epilepsy. Neurology. 66, 1490-1494 (2006).
  22. Kerrigan, J. F., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of the thalamus for the treatment of intractable epilepsy. Epilepsia. 45, 346-354 (2004).
  23. Hamani, C., et al. Deep brain stimulation of the anterior nucleus of the thalamus: effects of electrical stimulation on pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Epilepsy research. 78, 117-123 (2008).
  24. Hamani, C., et al. Bilateral anterior thalamic nucleus lesions and high-frequency stimulation are protective against pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Neurosurgery. 54, 191-195 (2004).
  25. Mirski, M. A., Rossell, L. A., Terry, J. B., Fisher, R. S. Anticonvulsant effect of anterior thalamic high frequency electrical stimulation in the rat. Epilepsy research. 28, 89-100 (1997).
  26. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the mammillothalamic tract prevents seizures in guinea pigs. Science. 226, 72-74 (1984).
  27. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamic mediation of generalized pentylenetetrazol seizures. Brain research. 399, 212-223 (1986).
  28. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the connections of the mammillary bodies protects against generalized pentylenetetrazol seizures in guinea pigs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 7, 662-670 (1987).
  29. Mirski, M. A., McKeon, A. C., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamus and substantia nigra: two distinct structures mediating experimental generalized seizures. Brain research. 397, 377-380 (1986).
  30. Lee, K. J., Jang, K. S., Shon, Y. M. Chronic deep brain stimulation of subthalamic and anterior thalamic nuclei for controlling refractory partial epilepsy. Acta neurochirurgica. Supplement. 99, 87-91 (2006).
  31. Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
  32. Encinas, J. M., Hamani, C., Lozano, A. M., Enikolopov, G. Neurogenic hippocampal targets of deep brain stimulation. The Journal of comparative neurology. 519, 6-20 (2011).
  33. Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of disease. 17, 473-490 (2004).
  34. Kuruba, R., Hattiangady, B., Shetty, A. K. Hippocampal neurogenesis and neural stem cells in temporal lobe epilepsy. Epilepsy & behavior : E&B. 14, Suppl 1. 65-73 (2009).
  35. Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5. 26-41 (2008).
  36. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Inc. (2007).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method. METHODS. 25, 402-408 (2001).
  38. Kells, A. P., et al. AAV-mediated gene delivery of BDNF or GDNF is neuroprotective in a model of Huntington disease. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 9, 682-688 (2004).
  39. Han, B. H., Holtzman, D. M. BDNF protects the neonatal brain from hypoxic-ischemic injury in vivo via the ERK pathway. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 5775-5781 (2000).
  40. Hetman, M., Kanning, K., Cavanaugh, J. E., Xia, Z. Neuroprotection by brain-derived neurotrophic factor is mediated by extracellular signal-regulated kinase and phosphatidylinositol 3-kinase. The Journal of biological chemistry. 274, 22569-22580 (1999).
  41. Stadelmann, C., et al. BDNF and gp145trkB in multiple sclerosis brain lesions: neuroprotective interactions between immune and neuronal cells. Brain : a journal of neurology. 125, 75-85 (2002).
  42. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42, Suppl 3. 8-12 (2001).
  43. Benabid, A. L., Pollak, P., Louveau, A., Henry, S., de Rougemont, J. Combined (thalamotomy and stimulation) stereotactic surgery of the VIM thalamic nucleus for bilateral Parkinson disease. Applied neurophysiology. 50, 344-346 (1987).
  44. Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of. 68, 521-534 (2010).
  45. Tierney, T. S., Abd-El-Barr, M. M., Stanford, A. D., Foote, K. D., Okun, M. S. Deep brain stimulation and ablation for obsessive compulsive disorder: evolution of contemporary indications, targets and techniques. The International journal of neuroscience. 124, 394-402 (2014).
  46. Kennedy, S. H., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression: follow-up after 3 to 6 years. The American journal of psychiatry. 168, 502-510 (2011).
  47. Lozano, A. M., et al. Subcallosal cingulate gyrus deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Biological psychiatry. 64, 461-467 (2008).
  48. Ackermans, L., et al. Double-blind clinical trial of thalamic stimulation in patients with Tourette syndrome. Brain : a journal of neurology. 134, 832-844 (2011).
  49. Houeto, J. L., et al. Tourette's syndrome and deep brain stimulation. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 76, 992-995 (2005).
  50. Maciunas, R. J., et al. Prospective randomized double-blind trial of bilateral thalamic deep brain stimulation in adults with Tourette syndrome. Journal of neurosurgery. 107, 1004-1014 (2007).
  51. Koning, P. P., Figee, M., van den Munckhof, P., Schuurman, P. R., Denys, D. Current status of deep brain stimulation for obsessive-compulsive disorder: a clinical review of different targets. Current psychiatry reports. 13, 274-282 (2011).
  52. Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular psychiatry. 15, 64-79 (2010).
  53. Muller, U. J., et al. Successful treatment of chronic resistant alcoholism by deep brain stimulation of nucleus accumbens: first experience with three cases. Pharmacopsychiatry. 42, 288-291 (2009).
  54. Zhou, H., Xu, J., Jiang, J. Deep brain stimulation of nucleus accumbens on heroin-seeking behaviors: a case report. Biological psychiatry. 69, e41-e42 (2011).
  55. Porta, M., et al. Thalamic deep brain stimulation for treatment-refractory Tourette syndrome: two-year outcome. Neurology. 73, 1375-1380 (2009).
  56. Younce, J. R., Albaugh, D. L., Shih, Y. Y. Deep brain stimulation with simultaneous FMRI in rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51271(2014).
  57. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature reviews. Genetics. 10, 669-680 (2009).
  58. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature methods. 5, 829-834 (2008).
  59. Fiore, R., Siegel, G., Schratt, G. MicroRNA function in neuronal development, plasticity and disease. Biochimica et biophysica acta. 1779, 471-478 (2008).
  60. Hebert, S. S., De Strooper, B. Alterations of the microRNA network cause neurodegenerative disease. Trends in neurosciences. 32, 199-206 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Deep Brain StimulationAnterior Thalamic NucleusGene ExpressionRat HippocampusStereotactic SurgeryRNA IsolationQuantitative RT PCRBDNF ExpressionGABA ReceptorNeuroprotection

Related Articles