Method Article

استخدام إنتاجية عالية في المختبر نظام ميكروفلويديك لتطوير الأغشية الحيوية متعدد الأنواع عن طريق الفم

DOI:

10.3791/52467

⸱

December 1st, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Epidemiology, School of Public Health, The University of Michigan, 2Centre for Oral Health Research, School of Dental Sciences, Newcastle University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من هذه الورقة هو طرق لوصف استخدام نظام ميكروفلويديك لتطوير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع التي تحتوي على الأنواع التي تم تحديدها عادة في الإنسان لوحة الأسنان فوق اللثة. طرق لوصف العمارة بيوفيلم، قابلية بيوفيلم، ونهجا لحصاد بيوفيلم عن التحليلات التي تعتمد على الثقافة أو ثقافة مستقلة وتسليط الضوء عليها.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك عدد قليل الإنتاجية العالية في أنظمة المختبر التي تسهل تطوير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع التي تحتوي على العديد من الأنواع الكشف عن عادة داخل الجسم الحي في الأغشية الحيوية عن طريق الفم. وعلاوة على ذلك، وهو النظام الذي يستخدم اللعاب البشري الطبيعي كمصدر المغذيات، بدلا من وسائل الإعلام الاصطناعي، أمر مرغوب فيه ولا سيما من أجل دعم التعبير عن الخصائص الخلوية وبيوفيلم محددة التي تحاكي المجتمعات في الجسم الحي. نحن تصف طريقة لتطوير أنواع متعددة الأغشية الحيوية عن طريق الفم التي هي قابلة للمقارنة، فيما يتعلق تكوين الأنواع، إلى فوق اللثة لوحة الأسنان، في ظل ظروف مماثلة لتجويف الفم البشري. على وجه التحديد، وهذه المادة طرق يصف كيف يمكن تكييف نظام ميكروفلويديك المتاحة تجاريا لتسهيل تطوير أنواع متعددة الأغشية الحيوية عن طريق الفم المستمدة من ونمت داخل اللعاب المجمعة. وعلاوة على ذلك، وصفا لكيفية النظام يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع confocaل يزر المسح المجهر لتوليد 3-D إعادة البناء بيوفيلم للتحليلات المعمارية وقدرتها على البقاء وستعرض. ونظرا لتنوع واسع من الكائنات الحية الدقيقة التي تنمو داخل الأغشية الحيوية في النظام ميكروفلويديك (بما في ذلك العقدية، النيسرية، الفيونيلة، Gemella، وPorphyromonas)، كما سيتم عرض بروتوكول تصف كيفية حصاد الخلايا بيوفيلم لمزيد من ثقافة فرعية أو استخراج الحمض النووي والتحليل. سيتم تناولها حدود كل من نظام بيوفيلم ميكروفلويديك والتحليلات الحالية بيانات للدولة من بين الفن. في نهاية المطاف، ومن المتوقع أن هذه المادة سوف توفر تقنية خط الأساس التي من شأنها تحسين دراسة الأغشية الحيوية عن طريق الفم ومساعدة في تطوير تكنولوجيات الإضافية التي يمكن أن تكون متكاملة مع منصة ميكروفلويديك.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأغشية الحيوية هي معماريا المجتمعات المعقدة من البكتيريا التي يتم تجميعها على الأسطح 1. يتضمن هذه المجتمعات عادة عديد من الأنواع التي تتفاعل فيما بينها ضمن بيوفيلم 2. الأغشية الحيوية عن طريق الفم، والأكثر واضحة بصريا كونها لوحة الأسنان، هي مشكلة مستمرة في البشر ونتائجها التنمية العشوائية في توليد المجتمعات متعددة الأنواع المتنوعة تصنيفيا 3. البكتيريا المكونة لهذه المجتمعات المتنوعة يمكن أن تصل إلى 1،000 مرات أكثر مقاومة للميكروبات مما هم التعويم الحر (البلانكتون) نظرائهم 4-6. الفشل في علاج هذه المجتمعات بيوفيلم عن طريق الفم، والذي يمكن أن يسبب تسوس الأسنان وأمراض اللثة، وقد نتج عن ذلك عبء جسيم للصحة العامة: أكثر من 500 مليون مرة إلى مكتب طبيب الأسنان سنويا في الولايات المتحدة، وبنحو 108 مليار دولار لعلاج أو منع اللثة المرض وتسوس الأسنان 7.

المحتوى ">" في حين تدافع العديد من علماء الأحياء المجهرية دراسة السلوك الميكروبي تحت الظروف الطبيعية، وقليل منهم القيام بذلك. وذلك لأن معنوياتهم للتغلب على الصعوبات التي استنزفت باستمرار من قبل سهولة جذابة للعمل مع الثقافات المختبر. "-Smith 8.

في الوقت الحاضر، وأجرى أبحاثا بيوفيلم عن طريق الفم باستخدام مجموعة متنوعة من المجراة في النهج المختبر، ولكل منها مزاياها وعيوبها 9،10. في المختبر النهج غالبا ما تستخدم أنظمة بيوفيلم نموذج التي هي سهلة نسبيا لاقامة ولكنها قد تفتقر السريرية / أهمية في العالم الحقيقي 10،11. في الجسم الحي تعتمد النهج عادة على نظم نموذج حيواني التي قد تتكاثر بعض جوانب البيئة عن طريق الفم الإنسان، ولكن مرة أخرى تعاني من القيود بسبب الاختلافات في علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، علم الأحياء الدقيقة وعلم المناعة بين الحيوانات والبشر 12، 13. وتجدر الإشارة إلى أن الأغشية الحيوية عن طريق الفميمكن أيضا أن تكون وضعت على الأسطح المينا الذي عقد في دعامة داخل أفواه متطوعين من البشر، ولكن هذا النهج هو حاليا مكلفة نسبيا و14،15 كثيفة العمالة. في نهاية المطاف، ويتم اختبار وكلاء أو التقنيات لتحسين الرعاية الصحية عن طريق الفم رواية في البشر في ظل ظروف التجارب السريرية التي تسيطر عليها (11). في الوقت الحاضر، وهي طريقة عمل غالبا ما تستخدم لتحديد وتقييم وكلاء الرعاية الصحية عن طريق الفم الجديد هو لأداء أول الدراسات المختبرية لتبين فعالية المحتملة، ثم قم بإجراء دراسات على الحيوانات و "التجارب الميدانية" التي توظف أطباء لتقييم مدى نجاح هذه التكنولوجيا 9، 16،17. للأسف، الدراسات المختبرية تميل إلى الاعتماد على أنظمة نموذج التي تشغل بصمة كبيرة، تمثل تحديا تقنيا للاستخدام، وغالبا ما تحتوي على المجتمعات مبسطة من واحد أو أكثر في عدد قليل من الأنواع لاستخلاص المحتملين في العالم الحقيقي يعني 10،18. وبالنظر إلى أن الأغشية الحيوية لوحة الأسنان تحتوي على أنواع متعددة، والنموذج في مجمعات للالسابق تتدفق الوسط اللعاب، وتطوير الأغشية الحيوية التي تحتوي على واحد أو عدد قليل من الأنواع في وسائل الإعلام الاصطناعي من غير المرجح أن تولد المجتمعات التي تتصرف بطريقة مشابهة لتلك التي في سيناريو العالم الحقيقي 10،19. لمعالجة الوقت والتكلفة، ومتطلبات التدريب، وطبيعة تمثيلية رديئة من أنظمة بيوفيلم نموذج المختبر بالمقارنة مع البيئة في العالم الحقيقي، وضعنا مؤخرا إنتاجية عالية ونظام بيوفيلم ثيق للبيئة 20 (الشكل 1). فوائد النظام من استخدام اللعاب خالية من الخلايا المجمعة البشري (CFS) كما تجمع البكتيريا اللعاب التي تحتوي على الخلايا البشرية المتوسطة وغير المعالجة (CCS) بمثابة اللقاح. فريد، والنظام أيضا يجمع بين تكنولوجيا ميكروفلويديك، وهو متحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر، والتنوع البكتيري تكنولوجيا التحليل ثقافة مستقلة. وهكذا، فإن نظام النموذج هو ثيق للبيئة (باستخدام اللعاب بمثابة اللقاح لتنمو الأغشية الحيوية متعددة الأنواع في 37 ° C في فلتر تعقيم تتدفقاللعاب) والأغشية الحيوية عن طريق الفم تحتوي على الأنواع (بما في ذلك العقدية، النيسرية، الفيونيلة، والأنواع Porphyromonas) في ممثل وفرة من تلك التي وجدت في وقت مبكر وحة فوق لثوي 20.

عندما اعتبر أن هذا العمل يصف استخدام نظام نموذجي وضعت حديثا، ويجب إيلاء اهتمام خاص لدمج ومتحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر (CLSM) على microfluidics، وتقنيات تحليل التنوع ثقافة مستقلة. وكان اتحاد هذه التقنيات من قبل مجموعة بحثنا عن قصد وليس فقط يضيف القدرة الإنتاجية العالية لنظام نموذجي وضعت حديثا، ولكن يسمح أيضا طرح الأسئلة التي لا يمكن معالجتها بسهولة من قبل مع النظم الأخرى. أولا، CLSM ديه مزايا واضحة على المجهري التقليدي لأنها تسمح لتحليل ثلاثي الأبعاد من الأغشية الحيوية. في كثير من الأحيان محل تقدير، وهذا مهم للغاية كما الأغشية الحيوية هي خفة دم غير متجانسةح يتعلق تكوين الأنواع وموقف المكاني فضلا عن الظروف الفسيولوجية التي يجري فرضها في مواقع مكانية مختلفة داخل بيوفيلم 6،21. بالتنسيق مع برنامج ثلاثي الأبعاد تقديم وصورة برامج التحليل، والهندسة المعمارية بيوفيلم، والعلاقات المكانية بين الأنواع المكونة، ومدى قتل المضادة للجراثيم يمكن تحليلها 22-24. هذه القدرات ليست ممكنة باستخدام معيار الضوء المرسل أو المجهري epifluorescence. وبعد ذلك، قد حصل على microfluidics اهتماما خاصا في مجال علم الأحياء المجهرية، لأنها تتيح دراسة الأغشية الحيوية تحت ظروف محكومة بعناية (التدفق، ودرجة الحرارة، ودرجة الحموضة، الخ) ويتطلب سوى كميات صغيرة من السائل 25-27. كنقطة المقارنة، وتزايد على بيوفيلم عن طريق الفم في اللعاب البشري ضمن نظام نموذج خلية تدفق (النظام الذي يعتبر يمكن القول إن النموذج الدعامة الأساسية للعديد من الدراسات بيوفيلم عن طريق الفم) لمدة 20 ساعة بمعدل تدفق مماثل والقص كما ان يتحققفي نظام ميكروفلويديك يتطلب لا يقل عن 200 مل، في مقابل 800 ميكرولتر في الجهاز ميكروفلويديك 28-31. وهكذا، فإن النظام النموذجي بيوفيلم ميكروفلويديك تمكن الدراسة من المواد محدودة الكمية في ظل ظروف محددة. وأخيرا، فقد تم تحسين التكنولوجيا سلسلة البايرو في العقد الماضي للا تتطلب سوى كميات صغيرة من المواد لإجراء تحليل المجتمع وهي متعددة بما فيه الكفاية للسيطرة على عمق التسلسل للحصول على هوية الأنواع بيوفيلم حتى النادرة. استخدام هذه التكنولوجيا، مثل البكتيريا ترميز العلامة FLX amplicon سلسلة البايرو (bTEFAP)، وقد سمح لطرح الأسئلة ذات الصلة بشأن البيئة من الأغشية الحيوية التي ينبغي معالجتها 32،33. مثل هذه الأسئلة التى تصطبغ صعوبات في الماضي عندما كانت سلسلة البايرو غير متوفر بسبب الوقت والتكاليف اللازمة لإنشاء مكتبات البلازميد والخطوات التكنولوجية والتحليلية المعقدة اللازمة لاستخلاص البيانات 33،34. وبطبيعة الحال، وهي ميزة كبيرة مع ثقافة مستقلة ا ف بمقاربات، مثل سلسلة البايرو، هو أن الأنواع البكتيرية التي لا يمكن زراعتها في عزلة داخل وسائل الإعلام مختبر التقليدي (الأنواع أي قابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة) يمكن زراعتها والتعرف داخل منظومة نموذج والوفرة النسبية في المجتمع كميا 35، 36 . لإضافة المنظور، في وقت مبكر من عام 1963، قدرت في وقت متأخر سيغموند Socransky أن ما يقرب من 50٪ من البكتيريا في المواد معزولة عن طريق الفم اللثة شق البشري لا يمكن زرع باستخدام ظروف النمو مختبر 37.

والهدف من هذه الورقة هو طرق لوصف النهج لتطوير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع عن طريق الفم في ميكروفلويديك (Bioflux) النظام المتوفرة تجاريا تحت: (ط) الظروف ممثل تجويف الفم البشري و (ii) مع تكوين الأنواع ووفرتها أن غير قابلة للمقارنة لوحة فوق اللثة. وعلاوة على ذلك، باستخدام كل البرامج مجانية والتجاري، نسلط الضوء بيوفيلم كيف الأساسييمكن أن تستمد التدابير الهندسة المعمارية من البيانات CLSM، مع التركيز على النهج لقياس الكتلة الحيوية بيوفيلم، خشونة، وقدرتها على البقاء (على أساس لايف / تلطيخ الميت). وأخيرا، تم وصفها الخطوات المطلوبة لحصاد المواد بيوفيلم لتحليل التنوع كتبها bTEFAP.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استعرض بروتوكول جمع اللعاب الموصوفة هنا من قبل جامعة ميشيغان مجلس المراجعة المؤسسية للبحوث موضوع الإنسان.
ملاحظة: وفيما يتعلق استعراض المؤسسية لعمل موضوع الإنسان من هذا النوع، يجب أن حصل على الترتيبات وأذونات مسبقة من المؤسسة المضيفة. على وجه الخصوص، وهذا يتوقف على المؤسسة، IRB أو الموافقة الأخلاق قد تحتاج إلى سعى والموافقة عليها قبل جمع اللعاب من متطوعين من البشر يمكن المضي قدما. كعامل مساعد في إعداد التطبيق، مفيد NIH خوارزمية / الرسم البياني يمكن الاطلاع هنا: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf

1. إعداد مجمع اللعاب لاستخدامها كعامل متوسطة النمو وثيق للبيئة

  1. توظيف> 5 أفراد للتبرع اللعاب. لا تأخذ أي معلومات تحديد وضمان عدم وجود individuسوف المرض التبرع اللعاب إذا كانت مريضة، أو اتخذت المضادات الحيوية عن طريق الفم في 3 أشهر الماضية، أو قد استهلكت الطعام أو السائل، مع استثناء من المياه، في ساعة 2 السابقة قبل التبرع.
  2. جمع اللعاب في 50 مل أنابيب بلاستيكية. تجميع اللعاب التي تم جمعها في كوب من البلاستيك، وابقائها على الجليد. لا تستخدم الزجاج كما البوليمرات في اللعاب سوف تلتزم الواجهات الزجاجية الداخلية.
  3. إضافة Dithiothreitol (DTT) إلى تركيز النهائي من 2.5 ملم من الأسهم 100X. (يتم تجميد أسهم في مأخوذة تستخدم مرة واحدة في -20 ° C). يحرك المزيج لمدة 10 دقيقة في كوب بلاستيكي على الجليد.
  4. من أجل إزالة الجسيمات، الطرد المركزي لعاب المجمعة لمدة 30 دقيقة في 17،500 ز س.
  5. تمييع اللعاب مع 3 أحجام درهم 2 O لإعطاء ربع اللعاب المركزة.
  6. تصفية تعقيم اللعاب باستخدام 0.22 ميكرون polyethersulfone (PES)، فلتر ملزمة منخفض البروتين. استخدام فلتر مع مساحة كبيرة، أو استخدام عدة مرشحات منطقة صغيرة. إبقاء اللعاب فيحاوية بلاستيكية على الجليد في حين التصفية.
  7. تجميد اللعاب المجمعة في -80   ° C في 50 مل أنابيب بلاستيكية لحين الحاجة إليها لتنمو البكتيريا. كل أنبوب من البلاستيك للاستخدام واحد فقط، ويجب أن يحتوي على ما لا يزيد عن 35 مل كما يحمل كل بئر ميكروفلويديك بحد أقصى 1.2 مل (1.2 مل × 24 = 28.8 الآبار مل)، وهناك حاجة إلى الفضاء في كل أنبوب مع توسع اللعاب أثناء التجميد.
  8. لاستخدامها، ذوبان الجليد لعاب المجمعة في درجة حرارة الغرفة. إذابة مرة واحدة، وتصفية تعقيم مرة أخرى (0.22 ميكرون polyethersulfone، وانخفاض البروتين مرشح ملزم لإزالة أي رواسب).

2. إعداد مجمع اللعاب لاستخدامها كعامل اللقاح

  1. توظيف> 5 أفراد للتبرع اللعاب. لا تأخذ أي معلومات تحديد وضمان لن الأفراد التبرع اللعاب إذا كانت مريضة، اتخذت المضادات الحيوية عن طريق الفم في 3 أشهر الماضية، أو قد استهلكت الطعام أو السائل، مع استثناء من المياه، في ساعة 2 السابقة قبل التبرع. جمع ساmples أكثر من 30 دقيقة.
  2. جمع اللعاب في 50 مل أنابيب البلاستيك في درجة حرارة الغرفة وتجميع اللعاب التي تم جمعها في كوب بلاستيكي في درجة حرارة الغرفة.
  3. تمييع اللعاب المجمعة مع الجلسرين تعقيمها كاشف الصف العام أن تسفر عن الأسهم مع نسبة النهائية من 25٪ الجلسرين، و 75٪ اللعاب التي تحتوي على خلية [CCS].
  4. تجميد اللعاب في -80 درجة مئوية في 3 مل مأخوذة تستخدم مرة واحدة لحين الحاجة إليها.
  5. عند الحاجة لتطعيم النظام ميكروفلويديك، وإذابة aliquots في درجة حرارة الغرفة وتحريكها بلطف على vortexer لمدة 5 ثانية قبل أن pipetted في النظام ميكروفلويديك كما هو موضح في الخطوة 3 من البروتوكول، أدناه.

3. نمو الأغشية الحيوية متعددة الأنواع عن طريق الفم

  1. لجنة الأمن الغذائي ما قبل المعالجة
    1. أول معطف القنوات ميكروفلويديك Bioflux مع CFS. إضافة 100 ميكرولتر من CFS إلى كل منفذ جيدا. باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة Bioflux، حدد "اليدوي" وتعيين التدفق من قنوات "B1-B24" ثاتي هي لاستخدامها.
    2. وبعد ذلك، وضع القص إلى 1.0 داين / سم ² والبدء في تدفق لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لضمان توزيع متجانس للجنة الأمن الغذائي العالمي في جميع أنحاء القناة. ضمان وجود السائل في كل قناة مدخل للتحقق من أن لجنة الأمن الغذائي تدفقت من خلال جميع القنوات بالتساوي.
    3. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    4. إزالة الحل / يمهد للمعالجة CFS أن يبقى في الآبار منفذ ونقل إلى الآبار مدخل. وهذا الحجم الكلي 100 ميكرولتر يخدم لتحقيق التوازن ضد الضغوط التي تطبق على اللقاح من مأخذ جيدا.
  2. تلقيح
    1. إلى كل منفذ بشكل جيد، وإضافة 100 ميكرولتر من CCS اللقاح. وضع لوحة ميكروفلويديك على لوحة الحرارة (درجة الحرارة وضعت في 37 ° C)، دليل حدد ضمن برنامج حاسوبي لمراقبة وضبط تدفق من الآبار منفذ إلى آبار مدخل (أي عكس) في 1.0 داين / سم ² بالضبط 6 ثانية.
    2. احتضان لوحة ميكروفلويديك عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة للسماح لللتمسك الأولي ونمو البكتيريا في قيحة.
  3. النمو بين عشية وضحاها
    1. لقنوات تلقيح المستخدمة، نضح قيحة النفايات من كل من الآبار منفذ. تضيف ما يصل الى 1 مل الحجم الكلي للجنة الأمن الغذائي العالمي في كل من الآبار مدخل (يمكن القيام به على رأس القائمة CFS).
    2. احتضان لوحة ميكروفلويديك في 37 ° C، حدد الدليل ووضع برنامج للتشغيل عند 0.2 داين / سم ² لمدة 20 ساعة.
  4. وصمة عار prewash
    1. نضح كل السوائل من مدخل ومخرج الآبار وإضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) إلى كل من الآبار مدخل. تدفق لمدة 20 دقيقة عند 0.2 داين / سم ².
  5. وصمة عار بالإضافة الخليط
    1. لبقاء الخلية تلطيخ جعل 100 ميكرولتر من الخليط وصمة عار لكل قناة لتكون ملطخة. على وجه التحديد، إضافة 3 ميكرولتر من SYTO 9 و 3 ميكرولتر من يوديد propidium لكل مل من PBS باستخدام التجارية بقاء الخلية تلطيخ عدة مثل لايف / الميت. وهذا يولدخليط تلطيخ تحتوي على 10 ميكرومتر SYTO 9 و 60 ميكرومتر يوديد propidium.
    2. نضح PBS المتبقية من الآبار مدخل وثم إضافة 100 ميكرولتر من بقاء الخلية الخليط وصمة عار على كل مدخل جيدا. تعيين في التدفق عند 0.2 داين / سم 2 وتشغيل حل من مدخل إلى مخرج لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. غسل ما بعد تلطيخ
    1. نضح وصمة عار المتبقية في كل من الآبار مدخل وإضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني على كل مدخل جيدا. تعيين في التدفق عند 0.2 داين / سم ² وتشغيل حل PBS من مدخل إلى مخرج لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي بقع الزائدة.

4. جمع صورة، 3D التقديم، وتحليل الصور

  1. استخدام مقلوب متحد البؤر المسح بالليزر المجهر (CLSM) لجمع بيانات الصورة بيوفيلم من نظام ميكروفلويديك. تأكد من أن CLSM غير قادرة على تحمل وزن لوحة Bioflux، والتي يمكن أن تصل إلى 150 غرام.
    ملاحظة: نظرا للالدايمnsions من القنوات ميكروفلويديك، والحاجة إلى حساسية لتمييز هيكل بيوفيلم، ومتطلبات للكشف عن إشارة مضان بدرجات متفاوتة من الشدة، تناسب CLSM مع 40X 1.25 NA عدسة موضوعية أو واحد مع نوعية مماثلة البصرية، التكبير، والفتحة العددية.
  2. توحيد بوابات التقاط الانبعاثات مع زيادة وتعويض القياسات التي تبقى ثابتة. تأكد من أن قوة الليزر لا تتجاوز 25٪ وهذا يمكن أن يؤدي في الصورة تبيض.
  3. تحويل ملفات CLSM من L eica أنا بركه F نوع إيل (LIF) لOME (يا قلم M icroscopy E nvironment) نوع الملف. وهذا يسمح لمزيد من سهولة الوصول والتوافق بين البرامج. استخدام البرمجيات المتاحة تجاريا مثل، IMARIS لتحويل الملفات إلى هذا النوع.

التقديم 3D للصور / أرقام

  1. مرة واحدة تحويلها إلى تنسيق OME، استخدام البرمجيات المتاحة تجاريا مثل IMARIS لجعل الصورفي 3D. تنفيذ هذه باستخدام مزيج من "Easy3D" و "فق" الخيارات.
    وينبغي بذل الاهتمام إشارة الخلفية والعتبة: ملاحظة. وظيفة الرسم البياني في IMARIS يمكن استخدامها للحصول على مجموعة جمع وهذا ينبغي أن يبقى ثابتا بين الصور التي يجري تحليلها.
  2. حفظ الصور باستخدام وظيفة "لقطة" وجعل النظر بعناية في دقة الصورة قبل حفظ أنواع الملفات.
  3. تجميع الصور في صورة أرقام باستخدام برامج تحرير مثل الطلاء أو أدوبي المصور.

تحليل صورة 3D للالرسوم البيانية والجداول

  1. استخدام متاحة بحرية يماغيج 23 و COMSTAT / COMSTAT2 38 لتحليل الصور. تحميل حزم من http://rsb.info.nih.gov/ij/ وhttp://comstat.dk/، على التوالي. لديك تحديث جافا أحدث تثبيت.
    ملاحظة: سيتم JAVA منصة برمجيات تحتاج إلى تثبيت PRIOr لاستخدام برنامج تحليل الصور.
    1. استخدام البرنامج يماغيج مع COMSTAT2 المساعد لاستيراد ملفات OME لكل صورة بيوفيلم في وضع "hyperstack" وعرض مع "قنوات تقسيم".
    2. فردي تحليل القناتين (أحمر / propidium-يوديد / الميتة كائن قناة 0 والأخضر / SYTO-9 / يجري بث مباشر قناة 1) باستخدام "المدرج" وظيفة من يماغيج. تسرد هذه الوظيفة العدد الإجمالي للبكسل من الملفات OME 8 بت (كما هو موضح "العد") في كل شدة اللون من 0 إلى 255 (كما هو موضح "قيمة")، مع 0 كونها بكسل مع عدم وجود إشارة (خلفية) و 255 كائن بكسل مع كامل التشبع الإشارة.
    3. تصدير البيانات إلى برنامج جدول بيانات وتوحيد كل القيم إشارة من ترجيح كل بكسل من شدة إشارة المقابلة. يتم تنفيذ هذا عن طريق ضرب العدد الإجمالي في كثافة إشارة التي قدمها العددية قيمة 8 بت (0-255) من أن كثافة إشارة.
    4. باختصار كل القيم المرجحة، 0-255، سواء بالنسبة لقنوات لكل صورة بيوفيلم القبض عليه. خذ مجموع القيم المرجحة لكل من القنوات لتحديد إشارة الإجمالية في المئة من أي قناة. نفعل ذلك لتحديد نسبة النسبية أو في المئة في المئة الأحمر وإشارة خضراء (أي في المئة "ميتة" والمئة "الحقيقية" لكل معاملة).
    5. أداء التحليلات الإحصائية، على سبيل المثال باستخدام الذيل اثنين-T-اختبار الطالب المعدلة لعدم المساواة التباين. تعتبر قيم p <0.05 كبيرة وتعتبر تلك قيم p <0.01 كبيرة للغاية.

5. خلايا حصاد بيوفيلم لتحليل الثقافة مستقل

  1. إزالة جميع اللعاب المستهلك وغير المستخدمة من مدخل ومخرج الآبار. غسل الآبار مع 1 مل من الماء المقطر المعقم ثلاث مرات.
  2. إضافة 100 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم إلى آبار مدخل و، وذلك باستخدام واجهة التحكم البرمجيات، وتمريرالماء المقطر المعقم إلى الأمام من خلال القنوات في> 8.0 داين / سم 2 (معدل التدفق> 745 ميكرولتر / ساعة، والقص من 800 ثانية -1) لمدة 5 دقائق على الأقل. كرر في الاتجاه المعاكس لمدة 5 دقائق على الأقل ثم كرر إلى الأمام وخطوة عملية الغسيل العكسي.
  3. تحقق من الضوء أو عن طريق المجهر epifluorescence (إذا كانت ملطخة خلايا / المسمى) لإزالة بيوفيلم شاملة (الشكل 2). جمع 100 ميكرولتر الخلية تعليق وتخزينها في -80 ° C لتحليل ثقافة مستقلة. لا يمكن أن يتحقق تحليل فعالة من حيث التكلفة لتكوين المجتمع من خلال استخدام البكتيريا ترميز العلامة FLX amplicon سلسلة البايرو (bTEFAP) باستخدام النهج المبين في نانس وآخرون 20

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D التقديم من الأغشية الحيوية

وتظهر نتائج ممثلة في الشكل (3). وهناك أداة مفيدة في مجال البرمجيات IMARIS هي الخيار لفحص كل شريحة من المكدس بيوفيلم التي تم جمعها، والجمع بينهما لخلق إعادة بناء ثلاثية الأبعاد. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إضافة تأثيرات التظليل الاصطناعية لمساعدة بصريا تفسير هياكل ثلاثية الأبعاد. الأغشية الحيوية المقدمة يمكن الموجه في أي اتجاه مع تكبير مختلفة لاس...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتبرز هذه الورقة طرق الخطوات الأساسية اللازمة لإعداد وتشغيل نظام ميكروفلويديك بطريقة للسماح لتطوير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع عن طريق الفم المستمدة من لعاب الإنسان المجمعة والتي تزرع في فلتر تعقيم 25٪ المجمعة لعاب الإنسان. يتم إعطاء النهج لتوصيف بيوفيلم ولكن ينبغي أن نتذكر أن هذه النهج وصفها هي التقنيات القابلة للتغيير وإضافية مثل، على سبيل المثال، البقع أو تسميات يمكن إدخالها. على سبيل المثال، يمكن للمرء أن تصور استخدام الأجسام المضادة المسمى أو إدخال سلالة فلوري لتصور ودراسة...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حصلت A.H.R. و N.S.J. على جوائز بحثية من مجموعة متنوعة من المصادر مثل المعاهد الوطنية للصحة (NIDCR) و Colgate-Palmolive (Piscataway ، NJ) وجمعية علم الأحياء الدقيقة التطبيقي لتمويل الدراسات البحثية في مختبرهم على مدار السنوات الخمس الماضية. جميع المؤلفين الآخرين: لا شيء يعلن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أشكر وليام نانس (جامعة ميشيغان) للمساعدة في صياغة بروتوكولات نمو بيوفيلم وجون باتيستا (الجريان، وسان فرانسيسكو، CA) للحصول على المشورة بشأن المسائل التكنولوجية المتعلقة بنظام Bioflux. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH: R21DE018820 إلى AHR) وجامعة ميشيغان الأموال بدء لAHR

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Falcon 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةفيشر Scientific14-432-22
Falcon 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةFisher Scientific14-959-49D
Dithiothreitol (بلورات بيضاء أو مسحوق / رحلان كهربائي) ، Fisher BioReactorsFisher ScientificBP172-5
Sorval ultracentrifuge   ؛ (متوافق مع SS-34)المعتمدة
الوحدة الحرارية العلمية SS-34 الدوار  Thermoscientific28-020
Thermo Scientific Type 1 كاشف الصف منزوع الأيونات الماءالحراري   ؛ Scientific Inc23-290-065
وحدات تصفية التدفق السريع Nalgene والمرشحات العلوية للزجاجة ، غشاء PES ، معقم.VWR73520-986 
GlycerolThermo Fisher Scientific IncNC0542269
BioFlux نظام الموائعالدقيقة نظام FluxionBioflux 200 نظام
Bioflux لوحة 24 قناةFluxion910-0004
PBS (Gibco)Thermo Fisher Scientific Inc10010023
LIVE / DEAD stain (Invitrogen)   ؛InvitrogenL7012
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤرLeciaSPE أو نظام
مجهر التألقمتعددةخيارات
مرافق التبريدخيارات
Decon SaniHol 70 محلول الإيثانولفيشر Scientific04-355-122
فريزر بدرجة حرارة منخفضة للغاية -80   ؛ ° Cخيارات متعددةالاختيارات نصائح متعددة الاختيارات
(20 و 200 و 1,000   μ ل)خيارات متعددةمتعددة
ماصات الحجم المتغير أحادية القناة (20 ، 200 ، 1,000 &# 956 ؛ ل)خيارات متعددةخيارات
Bioflux البرمجيات المخصصةBioflux
ImarisBitplane
Leica SPELeica
ImageJFreeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT / COMSTAT 2مجانية (http://www.comstat.dk/)
الوحدة العلمية الحرارية على eqivalent خيارات متعددة المتعدد متعددة خيارات متعددة < td colspan = "4" ><قوي> البرمجيات < / strong>

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).
  2. Wimpenny, J. Microbial metropolis. Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).
  3. Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms. Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).
  4. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
  5. Cate, J. M., Zaura, E. The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective. Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).
  6. Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities. Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).
  7. Anon, Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , http://www.cdc.gov/chronicdisease/resources/publications/AAG/doh.htm#aag (2011).
  8. Smith, H. Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro. Smith, H., Taylor, J. , Cambridge University Press. 1-29 (1964).
  9. Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment. Periodontology. 42, 7-12 (2000).
  10. McBain, A. J. Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview. Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).
  11. Baehni, P. C., Takeuchi, Y. Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases. Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).
  12. Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).
  13. Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC microbiology. 10, 101(2010).
  14. Diaz, P. I., et al. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).
  15. Auschill, T. M., et al. Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation. Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).
  16. Coenye, T., Nelis, H. J. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).
  17. Donlan, R. M. Role of biofilms in antimicrobial resistance. ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).
  18. Wimpenny, J. W. The validity of models. Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).
  19. Umland, T. C., et al. In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media. 3 (4), (2012).
  20. Nance, W. C., et al. A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).
  21. Werner, E., et al. Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
  22. Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. Visualization approaches for multidimensional biological image data. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).
  23. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  24. Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms. The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).
  25. Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).
  26. Kim, J., Park, H. D., Chung, S. Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
  27. Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).
  28. Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell. Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).
  29. Cuadra-Saenz, G., et al. Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms. Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).
  30. Rickard, A. H., et al. Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth). Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).
  31. Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model. Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).
  32. Diggle, M. A., Clarke, S. C. Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light. Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).
  33. Hiyari, S., Bennett, K. M. Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms. Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).
  34. Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology. Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).
  35. Xu, J. Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances. Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).
  36. Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. Studying bacterial infections through culture-independent approaches. Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).
  37. Socransky, S. S., et al. The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms. Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).
  38. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
  39. Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews). MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).
  40. Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling. Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).
  41. Adams, H., et al. Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing. American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).
  42. Ledder, R. G., McBain, A. J. An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas. Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Oral BiofilmsMicrofluidic SystemHigh throughput In VitroMulti species BiofilmsConfocal MicroscopyBiofilm ArchitectureSaliva based MediaStreptococcus VeillonellaDNA Extraction AnalysisLive Dead Staining

Related Articles