فحص السريع الدوبامين حيوية مع المسح الضوئي السريع Voltammetry دوري أثناء داخل الفم إدارة منبهة للذوق في الجرذان الصحوة

ملخص

تتوسط التقلبات السريعة في الدوبامين خارج الخلية (DA) في كل من معالجة المكافأة والسلوك المحفز في الثدييات. تصف هذه المخطوطة الاستخدام المشترك لقياس الفولتامين الدوري السريع (FSCV) وإعطاء الصبغة داخل الفم لتحديد كيفية تغيير الطعم للدوبامين السريع في الفئران المستيقظة التي تتحرك بحرية.

الملخص

يلعب إطلاق الدوبامين المرحلي السريع (DA) في دماغ الثدييات دورا مهما في معالجة المكافآت والتعلم المعزز والتحكم التحفيزي. المسح السريع للفولتامتر الدوري (FSCV) هو تقنية كهروكيميائية ذات دقة مكانية وزمانية عالية (دون الثانية) تم استخدامها لفحص إطلاق DA الطوري في عدة أنواع من المستحضرات. تم استخدام التجارب في المختبر في الخلايا المفردة وشرائح الدماغ والتجارب في الجسم الحي على القوارض المخدرة لتحديد الآليات التي تتوسط في إطلاق الدوبامين وامتصاصه في ظل الظروف العادية وفي نماذج المرض. على مدى السنوات العشرين الماضية ، قدمت تجارب FSCV في الجسم الحي في القوارض المستيقظة التي تتحرك بحرية نظرة ثاقبة لآليات دوبامين في معالجة المكافآت وتعلم المكافآت. تتمثل إحدى الميزات الرئيسية للتحضير المستيقظ الذي يتحرك بحرية في القدرة على فحص تقلبات DA السريعة المقفلة زمنيا لأحداث سلوكية محددة أو لمكافأة أو الإشارة إلى العرض التقديمي. ومع ذلك ، فإن أحد قيود السلوك المشترك وتجارب قياس الجهد هو صعوبة فصل تأثيرات DA الخاصة بالمحفزات الأولية المجزية أو المكروهة من تقلبات DA المتزامنة التي تتوسط السلوكيات الحركية الموجهة بالمكافأة أو غيرها من السلوكيات الحركية. هنا ، نصف طريقة مشتركة باستخدام في الجسم الحي FSCV والتسريب داخل الفم في فأر مستيقظ للتحقيق مباشرة في استجابات DA للطعمات الفموية. في هذه التجارب ، يتم غرس المذاق الفموي مباشرة في حنك الفئران - متجاوزا السلوك الموجه بالمكافأة وسلوك الشرب الطوعي - مما يسمح بالفحص المباشر لاستجابات DA لمحفزات الشعر.

المقدمة

يلعب إصدار

Phasic DA دورا مهما في التوسط في السلوك الموجه للمكافأة ^[1-3]. ومع ذلك ، فإن عزل ودراسة كيفية تغيير المكافأة الأولية لإطلاق DA الطوري غالبا ما يكون معقدا بسبب العمليات السلوكية أو المعرفية المتزامنة التي تحدث والتي تكون قادرة أيضا على تغيير إطلاق DA الطوري - مثل عمليات صنع القرار أو السلوك الحركي الموجه بالمكافأة للحصول على المكافأة. في العمل الحالي ، نقوم بعزل استجابات DA الطورية للطعمات من خلال استخدام القياس الدوري للمسح السريع في الجسم الحي (FSCV) جنبا إلى جنب مع توصيل الطعم من خلال القنيات داخل الفم. تتجاوز هذه التقنية الاختيار والعمل وتسمح لنا بفحص إطلاق DA خارج الخلية أثناء التسريب المباشر لطعم الأذن في حنك الفئران.

FSCV هي تقنية كهروكيميائية ذات دقة زمنية ومكانية عالية ، مما يسمح بقياسات إطلاق DA في منطقة محلية منفصلة (حوالي 100 ميكرومتر) على مقياس دون الثانية (دقة 10 هرتز). يوفر الجمع بين الولادة داخل الفم و FSCV ميزة مراقبة استجابات DA السريعة "في الوقت الفعلي" للاستعراض ، والتي لا يمكن فحصها باستخدام طرق غسيل الكلى المجهري التقليدية. علاوة على ذلك ، يحدث إطلاق DA الطوري استجابة للمكافآت أو الإشارات المرتبطة بالمكافأة بتركيزات تتراوح بين 20-100 نانومتر ، وهو أعلى من عتبة الكشف عن 10-20 نانومتر ل FSCV ^[4]. تسمح الدقة المكانية العالية ل FSCV أيضا بالتسجيل من المناطق الفرعية لمناطق الدماغ الصغيرة ، مثل نواة المتكئة الأساسية (NAc). وبالتالي ، فإن FSCV جنبا إلى جنب مع الحقن داخل الفم من المذمذات هو نموذج مثالي لدراسة كيفية تغيير المذمذات أو المحفزات الأخرى لإطلاق DA الطوري في مستيقظة وتصرفة. في الواقع ، سمحت هذه التقنيات بإجراء تجارب تحقق في كيفية تغيير المذمذات المجزية والمكروهة لإطلاق DA خارج الخلية ^[5].

على مدار العقد الماضي ، تم دمج تحليلات FSCV بنجاح مع توصيل الأدوية عن طريق الوريد ^[6] ونماذج الإدارة الذاتية للفئران ^{[7 ، 8]} لتحديد دور آليات DA الطورية في نماذج إدمان المخدرات. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام التوصيل داخل الفم المشترك مع FSCV لفحص كيفية تعديل الإشارات المضادة المقترنة بتوافر الكوكايين بإطلاق DA المرحلي والاستجابات السلوكية التي تعكس التأثير العاطفي ^[3]. يمكن أيضا استخدام هذه المنهجية المدمجة داخل الفم و FSCV بقوة لفحص استجابات DA الطورية للمنكهات ، مثل المنثول والمحليات الفموية ، التي تضاف إلى السجائر ومنتجات التبغ القابلة للذوبان ^[9-11]. على الرغم من أن العديد من المنكهات المضافة إلى منتجات التبغ فاتحة للشهية ^[9-11] ، إلا أنه من غير المعروف ما إذا كانت هذه المنكهات تزيد من إطلاق DA الطوري بطريقة تتفق مع تكافؤ المتعة المجزي. في الواقع ، قد يكون للمنكهات المضافة إلى السجائر ومنتجات التبغ القابلة للذوبان تأثيرات مباشرة على نظام مكافآت DA وقد تعمل من خلال آليات دوبامين للتأثير على التكافؤ المجزي للسجائر ومنتجات التبغ الأخرى. وبالتالي ، فإن التسليم داخل الفم جنبا إلى جنب مع FSCV يمكن أن يوفر فهما جديدا لكيفية تعديل المنكهات للإطلاق السريع ل DA. يمكن أن يؤدي استخدام منهجية FSCV المدمجة داخل الفم وفي الجسم الحي ، والبيانات التي تم الحصول عليها من مثل هذه الدراسات ، إلى تسهيل الدراسات المستقبلية لتحديد كيفية تفاعل المكهات والنيكوتين لتغيير إشارات DA وتعديل تعزيز النيكوتين المحتمل. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام البيانات المكتسبة من هذه الدراسات لإبلاغ القرارات التنظيمية بشأن منكهة منتجات التبغ.

البروتوكول

وأجريت جميع التجارب وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة (NIH) دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة ييل (IACUC).

الاستعدادات 1) ما قبل الجراحة

1. إعداد حل عن طريق الفم
   1. إيجاد حلول من 10٪ سكروز و 0.005٪ L-المنثول في الماء منزوع الأيونات (7.4 درجة الحموضة). تخزين هذه الحلول في حاويات مغلقة، في RT، وإعادة تشكيل كل 2 أسابيع، لمنع تدهور.
2. حلول القطب المعايرة
   1. جعل تريس العازلة (7.4 درجة الحموضة) في أي وقت قبل المعايرة. يتكون الحل من 12.0 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 140 ملي كلوريد الصوديوم، 3.25 ملي بوكل، 1.20 ملي CaCl2، 1.25 ملي NaH2PO4، 1.20 ملي MgCl _2، و2.00 ملي نا ₂ SO _4.
   2. إيجاد حل الأسهم من 10 ملي الدوبامين (DA، الدوبامين هيدروكلوريد) في 0.1 M حمض البيركلوريك. حمض البيركلوريك يساعد على منع أكسدة dopaminه. تخزين هذا الحل السهم عند -20 درجة مئوية، وتستخدم لمدة تصل إلى 6 أشهر. جعل عدة قسامات من الحل الأسهم DA للتخزين لاستخدام كل قسامة مرة واحدة فقط.
   3. من المخزون 10 ملي DA، وتمييع الحلول العازلة في تريس لتركيزات من 1 ميكرومتر، 500 نانومتر و 250 نانومتر و 125 نانومتر، 62.5 نانومتر، و31،25 نانومتر.
   4. لدرجة الحموضة المعايرة، وإعداد الحلول من تريس العازلة مع الرقم الهيدروجيني 7.2، 7.3، 7.5، و 7.6. هذا وسوف توفر الحلول التي تحاكي التحولات درجة الحموضة التي قد تحدث أثناء التجربة في الجسم الحي.
3. القطب تلفيق
   1. بواسطة الشفط، ونضح على T-650 من ألياف الكربون (7 ميكرون قطر) في الزجاج الشعرية البورسليكات (طول 10 ملم، 0.6 ملم خارج القطر، داخل القطر 0.4 مم).
   2. ضع الشعرية زجاجية مملوءة ألياف الكربون في القطب مجتذب العمودي. لالمعلمات الأولية، ضبط سخان إلى 55.0 وإيقاف المغناطيس. ومع ذلك، قد يكون من الضروري مزيد من التحسين على حد سواء سخان وإعدادات المغناطيسي تختلف الابمختبر أوم إلى المختبر.
      ملاحظة: يجب أن يكون القطب 5.5 سم على الأقل طويل (بما في ذلك تفتق) بحيث يمكن أن تناسب بسهولة في micromanipulator وتدرج 6.9 مم على الأقل تحت الجافية في الدماغ الفئران. إذا كان القطب قصيرة جدا، سوف تسجيلات من الجزء البطني من النواة المتكئة لا تكون قابلة للتحقيق. من ناحية أخرى، ينبغي ألا يتجاوز إجمالي طول القطب 6.5 سم وإلا فإنه سيكون وقتا طويلا لتنسجم مع micromanipulator.
   3. باستخدام المجهر الضوئي، وقطع يتعرض ألياف الكربون بحيث يمتد 75-100 ميكرون بعد نهاية الزجاج. تحقق من أن القطب لديه ضيق جدا، يكاد يذكر، وختم بين الزجاج الكهربائي وألياف الكربون، والتي سوف تنتج الحد الأدنى من الضوضاء أثناء التسجيل لاحق. تجاهل الكهربائي إذا كان هناك أي شقوق ملحوظة في الزجاج أو إذا ختم واهية، مما يدل على ختم الفقراء. للحصول على تعليمات أكثر تفصيلا انظر [12] و [13].
4. تجميع الكهربائي في هيئة التصنيع العسكريromanipulator
   1. الحصول على 3 في سلك 30G التي معزول على طول نصف طول السلك واستخدام فرشاة صغيرة لتطبيق طبقة رقيقة من الفضة ترسم مباشرة على السلك. على الفور بعد تطبيق طلاء الفضة، إدراج السلك في حفرة في الجزء العلوي من القطب إلى توفير اتصال الفيزيائية والكهربائية للألياف الكربون. تحت المجهر، تأكد من أن أسلاك الفضة يجعل الاتصال مع ألياف الكربون.
   2. تأمين أسلاك الفضة والقطب إلى micromanipulator باستخدام الانكماش الحراري.
   3. وضع استعداد القطب ألياف الكربون إلى تنقية ايزوبروبيل (IPA) لمدة 10 دقيقة على الأقل لتنظيف سطح القطب وزيادة حساسية لاحقة إلى الدوبامين. بعد تمرغ في IPA، وشطف من ألياف الكربون مع ماء الصنبور لإزالة IPA.
5. إشارة القطب تلفيق
   1. تأخذ سلك 13 ملم الفضة التي تحتوي على ما يقرب من 6 ملم شبكة حج / حج الكلورين (7 ملم الأسلاك الفضة وحدها، 6 مم عيون، 0.4 مم)،قطع جزء من الفضة وصولا الى ما يقرب من نصف طوله الأصلي وجندى الجزء الفضة من الأسلاك إلى دبوس من الذهب.
   2. تطبيق الايبوكسي خلال لحام على دبوس.
   3. تراجع حج / حج الكلورين شبكة نهاية إلى كوبوليمر من 5٪ polytetrafluroethylene وperfluoro-3،6-dioxa-4-ميثيل 7octene-السلفونيك حمض 5 مرات، مع 30 دقيقة فترات تجفيف الهواء بين كل تراجع.
   4. السماح للالمغلفة حج / حج الكلورين شبكة للهواء الجاف O / N.
   5. علاج في الفرن على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.

2) جراحة المشتركة داخل الفم وجراحة داخل الجمجمة كيفية تركيب الكانيولا (حوالي 75 دقيقة)

1. عن طريق الفم القسطرة تلفيق
   1. جعل القسطرة عن طريق الفم، وتعقيم بواسطة التعقيم أكسيد الإثيلين، 10 يوما على الأقل قبل الجراحة.
   2. قطع PE 100 أنابيب إلى 6 سم شرائح طويلة.
   3. باستخدام حام الحديد، تذوب واحدة من نهاية الأنبوب PE واضغط فورا على سطح صلب لتبريد أنابيب PE. النتيجة يجب أن تخلقلا ينبغي ذات حواف لذلك، قرص مسطح صغير في واحدة من نهاية الأنبوب PE و. استخدام إبرة (18 G) أو دفع دبوس على خلق فتحة في وسط هذا القرص.
   4. على الطرف الآخر من الأنبوب PE، بشكل مريح إدراج نهاية حادة من الإبرة G 18 في أنبوب.
   5. استخدام معيار حفرة رقة الناخس، لكمة عدة قطع دائرية من ورقة polytetrafluroethylene (3.18 مم، 6 مم في القطر) لإنشاء غسالات polytetrafluroethylene.
   6. إنشاء حفرة في وسط الغسالة. أخذ إبرة تعلق على أنابيب PE ودفعها بالكامل من خلال الغسالة. مرة واحدة على الإبرة من خلال الشريحة الغسالة إلى أسفل الأنبوب PE بحيث يكون دافق ضد الغسالة.
2. جراحة الفم
   1. بعد تعقيم الأدوات الجراحية، قنية (خفضت إلى 2.5 ملم تحت التمثال قبل التعقيم)، والقطب المرجعية، تخدير الفئران مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (100 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ).
      1. AFثالثا مدة 5 دقائق، وتطبيق اختبار التحفيز الضارة (الأقدام أو قرصة الذيل) لتقييم مستوى التخدير. إذا تبين هذا الموضوع أي رد فعل مادي لاختبار الحوافز الضارة (تتوانى ردا على ذلك، زيادة في معدل التنفس أو القلب)، إدارة دفعة الكيتامين من 10٪ إلى 15٪ من الجرعة الأصلية وتكرار بروتوكول الحوافز الضارة أعلاه.
   2. بعد الفأر هو تخدير كامل ولا يظهر أي رد فعل على اختبار تحفيز الضارة، استخدم كليبرز وبر أن يحلق الفراء الفئران من أعين إلى حوالي 2 ملم وراء الأذنين. ثم ضع الفئران على إعادة تدوير المياه رقيقة سادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة. تطبيق مواد التشحيم العين. إدارة غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (NSAID) المخدرات، كاربروفين (5 ملغ / كلغ)، عن طريق الحقن داخل الصفاق قبل إجراء أي شقوق وقبل إدخال قنية داخل الفم. استخدام تقنية العقيم في جميع الأوقات.
   3. تطبيق betadine تليها الايثانول 70٪ لتنظيف الجلد. كرر 3 مرات.
   4. جيش التحرير الشعبى الصينىCE الفئران على ظهرها، وفتح الفم باستخدام قطعة من القطن المعقم. العثور على أول الرحى العلوي.
   5. ادخال الإبرة في النسيج بين الخد وأول ضرس العلوي حتى يخرج الإبرة خلف وسطي للآذان.
   6. بيرس الإبرة من خلال الجلد حتى الأنبوب PE مخارج الجلد ويمكن الوصول إليها.
   7. سحب ما يصل على قنية (تجتاح من قبل قنية نفسها وليس إبرة) وتأمين غسالة polytetrafluroethylene في الأضراس بحيث تبقى القسطرة في مكانها.
      ملاحظة: قطع الغسالة في شكل شبه منحرف، وتأمين ضد الأضراس مع الجانب المسطح التي تواجه الخد يجعل هذه الخطوة أسهل.
   8. تأخذ غسالة polytetrafluroethylene آخر، والانزلاق على الإبرة المكشوفة، أسفل أنابيب بلاستيكية، وتتاخم ضد شق.
   9. لتأمين غسالة polytetrafluroethylene، استخدم الشريط تعقيمها لخلق الثلاثي "العلم" بحيث غسالة لا تنزلق فوق. تأمين غسلإيه ضد جلد الفئران والشريط تعقيمها.
   10. قطع القسطرة تعرضوا للسماح 2-4 سم من الأنابيب إلى أن يتعرض فوق رأس فأر.
   11. كرر الخطوات من 2.2.1 من خلال 2.2.10 للجانب الآخر من الفم.
3. جراحة داخل الجمجمة لvoltammetry
   1. وضع الفئران في إطار التجسيمي وتنظيف فروة الرأس الحيوان باستخدام مرحلتين فرك (فرك betadine تليها الايثانول 70٪ فرك، نفذ مع تكرار 3 دورة).
   2. استخدام ملاقط معقمة الأنف إبرة ومقص جراحي لخفض بعيدا قسم 15 × 15 ملم من أنسجة فروة الرأس.
   3. بلطف تنظيف سطح الجمجمة باستخدام معقم تطبيقها طرف القطن. وعلاوة على ذلك تنظيف الجمجمة عن طريق تطبيق 2-3 قطرات من 3٪ بيروكسيد الهيدروجين.
   4. استخدام الحفر التجسيمي تقديم 3 صغيرة (1 مم) ثقوب في الجمجمة لإدراجها لاحقا مسامير، 1 حفرة لقنية دليل، 1 حفرة لالقطب محفزة، و1 حفرة للانتخاب المرجعيةركب.
   5. للتسجيلات في قلب حلف شمال الأطلسي، وضع قنية دليل على 1.2 مم الأمامي و 1.4 ملم الوحشي لBregma. خفض جهاز قنية حتى قاعدة من البلاستيك هي الاحمرار مع الجمجمة.
   6. وضع القطب إشارة تعقيمها في الجانب المقابل لنصف الكرة قنية دليل. خفض المرجع حوالي 2 ملم تحت الجافية.
   7. موقف القطب تحفيز في 5.2 ملم والخلفي 1.0 ملم الوحشي لBregma وخفضت 8.0 مم تحت الجافية لاستهداف منطقة السقيفية البطنية (VTA).
   8. استخدم مفك الجراحية الصغيرة تعقيمها لتأمين مسامير في الجمجمة. ثم، تضاف القطب المرجعية، وتحفيز الكهربائي، وتوجيه قنية. أخيرا، تأمين جميع المكونات باستخدام الاسمنت cranioplastic.
   9. لمدة 48 ساعة الأولى من الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية وإدارة غير الستيرويدية المضادة للالتهابات المخدرات (NSAID) كاربروفين عن طريق الحقن تحت الجلد (5 ملغ / كلغ). تسمح على الأقل 1 أسبوع للتعافي الجراحي الكامل قبل تنفيذ voltamتسجيل متري.
      1. خلال الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية، والقسطرة تدفق يوميا عن طريق الفم بالماء. توفير الغذاء المشبعة في الماء لمدة 2 أيام لمساعدة الحيوانات في المضغ والأكل. توفير الرصد اليومي لمؤشرات محتملة للإجهاد من الألم (بسبب الإصابة خفيفة أو الجفاف) وتقديم التدخلات المناسبة عند الضرورة (بما في ذلك إدارة السوائل، والإدارة الموضعية من المطهرات، وأو الإدارة NSAID كاربروفين في 5 ملغ / كلغ).

3) Voltammetric تسجيلات في استيقظ الجرذ تتحرك بحرية

1. خفض القطب والحصول على مجموعة التدريب DA.
   1. في يوم من التجربة، والتحقق من المباح للقنية عن طريق الفم عن طريق غرس 200 ميكرولتر من الماء ومراقبة ردود فموي وجهي (للتحقق من أن الفئران وتذوق الماء).
   2. إرفاق headstage FSCV إلى الفئران عن طريق إدخال القطب محفزة (على headstage) في تحفيز القطبين القطب cannuلا (على الفئران). وبالتالي، فإن headstage (المنمنمة تحويل الجاري إلى الجهد) يربط مباشرة إلى القطبين تحفيز الكهربائي.
   3. إزالة قنية همية من جهاز قنية وتطبيق قطرتين من 50٪ من محلول الهيبارين في قنية. ثم تضاف برفق قنية همية (أطول قليلا أن قنية همية التي تم إزالتها سابقا) لمسح أي جلطات الدم أو تندب الدبقية التي قد حدثت، والتي سوف كسر أقطاب من ألياف الكربون التي من شأنها في وقت لاحق إدراجها أثناء التجربة. تمديد قنية المستخدمة لإزالة جلطات 3-4 مم أسفل الجمجمة (2 مم على الأقل فوق موقع تسجيل).
   4. إدراج micromanipulator، مع القطب، في قنية دليل ووضع عصابة أوميغا في موقف "مؤمن".
   5. قم بتوصيل سلك كهربائي إشارة من headstage إلى دبوس الملائمة. ثم قم بتوصيل سلك كهربائي عمل من micromanipulator إلى السلك المناسب على headstage.
   6. خفض كهربائيtrode إلى حوالي 4-4.5 مم أسفل الجمجمة.
   7. استخدام potentiostat لتطبيق الموجي الثلاثي (400 V / S، -0.4 إلى +1.3 V). تطبيق الموجي إلى القطب في 60 هرتز لمدة 10 دقيقة على الأقل، ثم قم بتغيير التردد تطبيق الموجي إلى 10 هرتز للتسجيلات التجريبية لاحقة.
      ملاحظة: الخطوة تطبيق الموجي 60 هرتز تنتج استقرارا سطح ألياف الكربون، وسوف تساعد على منع الانجراف الكهربائية
   8. تطبيق التحفيز الكهربائي للVTA باستخدام ترددات مختلفة (10-60 هرتز) البقول (10-30 البقول) والتيارات (50-150 أمبير) مع كل عرض النبضة من 2 مللي / المرحلة، لاستحضار تركيزات مختلفة من الإفراج DA ودرجة الحموضة التحولات. الحصول على الأقل 5 تركيزات مختلفة من الإفراج DA و 5 التحولات درجة الحموضة المختلفة. الانتظار (2-3 دقيقة على الأقل) بين التحفيز للسماح لإعادة تحميل حويصلي [14].
      ملاحظة: من المهم الحصول على التحفيز التي تنتج تركيزات DA عبر مجموعة كاملة التي سيتم جمعها خلال احقاالتجربة لأنها سوف تستخدم مجموعة تدريبية لمدير تحليل المكونات (انظر القسم 5.1).
   9. خفض الكهربائي في صلب بريدا (6.3 ملم بطني لالجافية). بعد ذلك خفض الكهربائي في 100 ميكرون الزيادات داخل نواة بريدا حتى يتم ملاحظة عابرة الأحداث الإفراج DA على ترددات من 1 لكل دقيقة على الأقل.
   10. توصيل أنابيب (القطر الداخلي 1/32 "، القطر الخارجي 3/32") لحقنة 20 مل، تعلق على ضخ حقنة. على الطرف الآخر من الأنبوب، واستخدام مشطوف 23 G إبرة لربط الأنابيب لقنية للفأر. ضمان أن يتم تعبئة أنابيب تماما مع منبهة للذوق المرجوة وتحقق من عدم وجود فقاعات موجودة في الأنبوب.
       ملاحظة: عادة، وإدارة كمية صغيرة من منبهة للذوق في فم الفئران قبل تسجيل للتأكد من أن التسريب الأول لتسجيل يسلم كمية ضخ كامل وليس أي ماء أو الهواء المتبقي في الأنبوب. وعلاوة على ذلك، وهذا يسمح للحيوان لديك بعض الخبرة الطرافة السابقةح منبهة للذوق منذ tastants رواية، حتى تلك مشهي، يمكن أن يكون مكره في البداية نظرا لحداثته.
   11. لجمع البيانات، ولبث 200 ميكرولتر من منبهة للذوق (6.5 ثانية باستخدام مضخة وأنابيب وصفها سابقا). يبث في منبهة للذوق كل دقيقة 1-3. يبث ما مجموعه 25 مرات في منبهة للذوق. كل التسريب يسلم 200 ميكرولتر من الحل.
   12. إذا كان يتم تسليم tastants متعددة في تجربة واحدة، تدفق القسطرة عن طريق الفم بالماء بعد جمع البيانات عن منبهة للذوق واحدة وانتظر 20 دقيقة على الأقل قبل غرس منبهة للذوق جديدة.
   13. بعد تسجيل الدورة DA، وإعداد للتحقق النسيجي من خلال خلق آفة صغيرة في موقع التسجيل. للحفاظ على القطب ألياف الكربون للمعايرة لاحقة، سحب أول القطب وإزالة micromanipulator. ثم استخدام micromanipulator جديد مع مسرى مكروي زجاج وسلك التنغستن (تمتد 100 ميكرون وراء طرف زجاج) إلى نفس العمق (أقل من الجافية) كما و الكربون الأصليمسرى مكروي IBER.
   14. للتحقق النسيجي، إنشاء آفة صغيرة عن طريق تطبيق 3 V في سلك التنغستن وزيادة الجهد في 1 V الزيادات، كل 10 ثانية، حتى يتم الوصول إلى إعداد 10 V.
   15. إذا تم بالفعل إنشاء منحنى تركيز قياسي باستخدام متعددة الأقطاب من ألياف الكربون، نفذ الخطوة الآفة فوق (3.1.14) من خلال تطبيق الإمكانات مباشرة القطب ألياف الكربون.
       ملاحظة: هذه الطريقة سوف الآفة تلف ألياف الكربون ومنع المعايرة لاحقة مع أن القطب معين.
   16. الموت ببطء الحيوان باستخدام بنتوباربيتال الحقنة المميتة (150 ملغ / كغ، والملكية الفكرية).
   17. إزاحة مترسة الرأس مع حقنة عادية باستخدام كماشة عن طريق سحب مباشرة التصاعدي على مترسة الرأس. لا يلوون على مترسة الرأس لأن هذا سوف يسبب الضرر لا لزوم لها الدماغ وجعلها صعبة لتحديد موقع القطب خلال الأنسجة.
       1. إزالة الدماغ ووضعه في 4٪ من الفورمالين لمدة 3 أيام تليها 30٪ سوكروز لمدة 1 أسبوع. إنشاء 30 ميكرون شرائح باستخدام ناظم البرد، جبل على زلات الغطاء وفحص شرائح تحت المجهر الضوئي لتحديد الموقع من ألياف الكربون أو التنغستن الآفة.
          ملاحظة: الإرواء هو اختياري ل3.1.17.

4) الكهربائي المعايرة

1. باستخدام خلية تدفق لخلق عامل التحويل الحالي على التركيز.
   1. من أجل تحديد حساسية القطب، معايرة الأقطاب بعد كل تجربة باستخدام تدفق "تي ​​خلية" الجهاز. خفض الكهربائي في "تي خلية" بينما يتم غسلها تريس العازلة، حلول درجة الحموضة، أو حلول DA على سطح القطب (بمعدل 2 مل / دقيقة). استخدام ستة الموقف الملف اللولبي الهواء المحرك إلى الانتقال ذهابا وإيابا بين العازلة ودرجة الحموضة أو حل DA.
   2. لكل معايرة، وجمع البيانات voltammetric خلال 5 تطبيق ثانية من تريس العازلة (خط الأساس) تليها 5 تطبيق ثانية من الرقم الهيدروجيني أو حل DA، تليها 20 ثانية لpplication من تريس العازلة (ملف مجموعه 30 ثانية). تكرار كل تشغيل 3 مرات لكل معايرة تركيز القياسية، موازنة بين تركيزات مختلفة من كل مستوى.
   3. لكل جمع العينات، وقياس الذروة DA أو أثار الرقم الهيدروجيني الحالية. متوسط ​​ذروة التيار عبر كل محاكمة للحصول على تركيز مقابل العلاقة الحالية الذروة. للحصول على تعليمات أكثر تفصيلا انظر [12] و [13].

5) تحليل البيانات

1. باستخدام التدريب المنصوص عليها في تحليل المكون الرئيسي (PCA)
   ملاحظة: أثناء تجربة voltammetry، يتم إنتاج الإخراج كما الحالية، والتي هي نتيجة الأكسدة الدوبامين والحد منها، التحولات درجة الحموضة، والضجيج الكهروكيميائية. PCA يسمح الفصل بين هذه العوامل بحيث يمكن للمرء أن عزل العناصر المطلوبة (DA ودرجة الحموضة) وإزالة المكونات الإضافية التي قد تشوه إشارات المطلوبة (للحصول على وصف أكثر تفصيلا، انظر ^{15، 16).}
   1. تعيين عامل المعايرة إلى thالناتج البريد الحالي (حوالي 5-10 غ / ميكرومتر) بعد PCA للسماح للقيم تركيز التحاليل يحدد لاحقا.
   2. استخدام مجموعة التدريب التي تم الحصول عليها خلال تجربة ل"القطار" نموذج PCA لفصل DA، ودرجة الحموضة، وعوامل أخرى. PCA يأخذ تدريب مجموعة voltammograms دوري (التي تم جمعها في القسم 3.1.8) ويحدد أي الخصائص الأساسية للvoltammogram يمكن استخدامها لتحديد كل الحليلة التي تم جمعها خلال المجراة التسجيلات voltammetry.
   3. لتحديد عدد من العناصر الأساسية للحفاظ على، واستخدام مالينوفسكي F-الاختبار. عادة، والحفاظ فقط 2 أو 3 عناصر الرئيسية التي تفسر عادة حوالي 95-99٪ من التباين في البيانات. لمزيد من المناقشة على تنفيذ مالينوفسكي F-اختبار، انظر ^17.
      ملاحظة: مرة واحدة يتم تحديد عدد من العناصر، وتحليل PCA فعال سوف المشروع voltammograms تقاس من DA ويحدد درجة الحموضة التدريب على المكونات الرئيسية التي تم الاحتفاظ بها.والنتيجة هي مجموعة من البيانات التي تم تصفيتها بحيث لا يبقى سوى DA (أو درجة الحموضة) البيانات وتتم إزالة البيانات المتبقية التي لا تشبه DA أو الرقم الهيدروجيني (انظر ممثل النتائج لإخراج المتوقعة). للحصول على شرح بمزيد من التفصيل وخطوة خطوة تعليمات لاستخدام PCA لتحليل voltammetric رؤية ورقة المواد و ^{16 و 17.}

النتائج

تم استخدام FSCV جنبا إلى جنب مع القسطرة داخل الفم زرع لدراسة كيفية السكروز، وهو منبهة للذوق مشهي، ينظم طوري الإفراج DA في قلب بريدا. قبل ضخ منبهة للذوق، والتحفيز الكهربائي (150 أمبير، 60 هرتز، 24 البقول؛ يدل على ذلك شريط أحمر) من VTA تنتج زيادات قوية في طوري الإفراج DA في حلف شمال الأطلسي (الشكل 1) الشكل 1 يدل على مؤامرة اللون مع إمكانية جرا. المحور الصادي، الوقت على محور س، والتيار (ممثلة اللون كاذبة) على المحور Z. أقل من مؤامرة هو لون تركيز DA مقابل الوقت التتبع...

المناقشة

تسليم منبهة للذوق داخل الفم جنبا إلى جنب مع FSCV يسمح تحليل "الوقت الحقيقي" ردود DA إلى flavorants عن طريق الفم. هناك ثلاث خطوات حاسمة في البروتوكول التي مطلوبة من أجل القياسات DA ناجحة. أولا، زرع الصحيح من القسطرة عن طريق الفم هو أمر حاسم لتسليم flavorants. ضمان أن يتم إدخال القسطرة وراء الضرس الأول ومثبتة في مكانها يمنع القسطرة من فقدان المباح ويمنع إزالة عرضي من قبل الحيوانات. بيغ القسطرة خلال الأيام القليلة الأولى بعد الشفاء من المهم أيضا، لأن الطعام اللين نظرا للحيو...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
القطب	البلاستيك	MS303 / 2-A / SPC	عند الطلب ، اطلب قطعا مقاس 22 مم أسفل
قنية قاعدة التمثال لأنظمة التحليل	الحيوي	MD-2251
أنظمة AE الشعرية الزجاجية		624503
ألياف الكربون	Thornel	T650
مجتذب القطب الكهربائي	Narishige International	PE-22
Neurolog Stimulus isolator< / a>	Digitimer Ltd.< / a>	DS4< / a>
الانكماش الحراري	3M	FP-301
الأسلاك المعزولة للأقطاب الكهربائية	سكوايرز للإلكترونيات	مخصص	L 3.000 × 1.000 ثانية × 1.000 ثانية UL1423 30/1 BLU
Micromanipulator	جامعة إلينوي في شيكاغو ، ورشة	الآلات الهندسية
الايبوكسي	ITW Devcon	14250	"5 دقائق الايبوكسي"
كوبوليمر من حمض البيرفلورو -3،6-ديوكسا-4-ميثيل-7أوكتين-سلفونيك وحمض رباعي فلورو إيثيلين	أيون	الطاقة LQ-1105	أي < / em> Nafion
الطلاء الفضي	GC Electronics	22-023
مزود الطاقة	BK Precision	9110
الأنابيب ل القسطرة داخل الفم	Intramedic	427426	PE 100 ، معرف = 0.86 مم ؛ OD = 1.52 مم
أنابيب للتسريب داخل الفم	Fischer Scientific	02-587-1A	ID 1/32 "؛ OD 3/32"
مضخة حقنة لخلايا التدفق	Pump Systems Inc.	NE 1000
الأسمنت الجراحي	Dentsply Caulk	675571 و 675572
مشغل الهواء	VICI	A60	واجهة صمام رقمي 6 مواضع
واجهة صمام رقمي	VICI	DVI	230 VAC
رباعية المسرح	جامعة نورث كارولينا ، مرفق
UEI امدادات الطاقة	جامعة نورث كارولينا ، الإلكترونيات منشأة
UEI صندوق اندلاع	جامعة نورث كارولينا ، منشأة
إمدادات الطاقة لمضخة حقنة tastant	Med Associates	SG-504
مضخة حقنة Tastant	Med Associates	PHM-107
MicroProbes MicroProbes من التنغستن		WE30030.5A3
مرجع الأسلاك الفضية مع AgCl	InVivo متري	E255A
سكروز	سيجما	80497
كلوريد المغنيسيوم	سيجما	M8266
كلرويد الصوديوم	سيجما	S7653
حمض البيركلوريك	سيجما	244252
حمض الهيدروكلوريك (4 م)	سيجما	54435
هيدروكسيد الصوديوم	سيجما	306576
بيروكسيد الهيدروجين	سيجما	H1009
الدوبامين هيدروكلوريد	سيجما	H8502
TarHeel HDCV Software	جامعة نورث كارولينا-تشابل هيل		يجب طلب البرنامج: انقر هنا للحصول على رابط إلى صفحة طلب البرنامجأ>