Method Article

التجميع الذاتي من الأشكال ثنائية الأبعاد المعقدة من البلاط DNA المفرد الذين تقطعت بهم السبل

DOI:

10.3791/52486

⸱

May 8th, 2015

 ,  ,  , 
1Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 3Department of Systems Biology, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تبليط الحمض النووي هو نهج فعال لصنع هياكل نانوية قابلة للبرمجة. نصف بروتوكولات بناء أشكال معقدة ثنائية الأبعاد عن طريق التجميع الذاتي لبلاط الحمض النووي أحادي الشريطة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
نجحت < p class = 'jove_content'> الأساليب الحالية في بنية النانو للحمض النووي في هندسة مجموعة متنوعة من الهياكل ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد باستخدام مبادئ التجميع الذاتي. في هذه المقالة ، نصف بروتوكولات مفصلة حول كيفية تصنيع أشكال ثنائية الأبعاد متطورة من خلال التجميع الذاتي لبلاط الحمض النووي أحادي الشريطة القابل للعنونة بشكل فريد والذي يعمل كوحدات بكسل جزيئية على قماش جزيئي. كل بلاطة أحادية الشريطة (SST) عبارة عن خيط DNA مكون من 42 نيوكليوتيدات يتكون من أربعة مجالات معيارية متسلسلة ترتبط بأربعة جيران أثناء التجميع الذاتي. القماش الجزيئي عبارة عن هيكل مستطيل تم تجميعه ذاتيا من SSTs. يتم تشكيل شكل ثنائي الأبعاد المعقد الموصوف عن طريق اختيار وحدات البكسل الجزيئية المكونة (SSTs) من قماش جزيئي بدقة 310 بكسل ثم إخضاع الخيوط المقابلة لتلدين وعاء واحد. نظرا للطبيعة المعيارية لنهج SST ، فإننا نظهر قابلية التوسع والتنوع والمتانة لهذه الطريقة. بالمقارنة مع الطرق البديلة ، تتيح طريقة SST مجموعة واسعة من بوليمرات المعلومات والتسلسلات من خلال استخدام خيوط الحمض النووي القصيرة المصممة والمركبة من جديد.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أدى السابق الحمض النووي أعمال التجميع الذاتي 25/01 لبناء الناجح لمجموعة متنوعة من الهياكل المعقدة، بما في ذلك DNA 2 - 5،8،10 - 13،17،23 أو RNA 7،22 3،4،7 الدوري، 22 وحسابي 5 ثنائية الأبعاد الشبكات، وأشرطة 10،12 وأنابيب 4،12،13، 3D بلورات 17، 11 المجسمات الثلاثية الأبعاد ومحدود، 2D الأشكال 7،8. وscaffolded وهناك طريقة فعالة بشكل خاص اوريغامي DNA، حيث يتم طي حبلا سقالة واحد من قبل العديد من خيوط قصيرة التيلة المساعدة لتشكيل شكل معقد 9،14 - 16،18 - 21،25.

بلغنا مؤخرا طريقة لبناء النانو منفصلة مع الأشكال 2D المقررة باستخدام البلاط واحدة الذين تقطعت بهم السبل (SST)، وأظهرت هياكل مع تعقيد مماثل لاوريغامي DNA 26. هذا articlه هو التكيف عملنا سابق 26 ويصف بروتوكولات مفصلة لترتيب درجات حرارة سطح البحر عنونة بشكل فردي في الأشكال 2D محدودة متطورة ذات أبعاد المنصوص عليها تحديدا (الاعراض وأطوال) والأشكال التضاريسية. واحد الميزة الرئيسية للطريقة طائرة أسرع من الصوت هي نمطية. كل طائرة أسرع من الصوت المكون من هيكل بمثابة وحدة بناء وحدات في التجمع، ومجموعات فرعية مختلفة من هذه درجات حرارة سطح البحر تنتج أشكال مختلفة. وهكذا، أنشأنا منصة العامة لبناء النانو مع الأحجام والأشكال المنصوص عليها من قصيرة، جدائل الحمض النووي الاصطناعية.

درجات حرارة سطح البحر تحتوي على أربعة مجالات، كل 10 أو 11 النيوكليوتيدات طويلة (الشكل 1A). في درجات حرارة سطح البحر ربط بحيث اللوالب بهم موازية خلق شعرية DNA عقدت معا عن طريق روابط كروس. كل كروس هو الفوسفات بين المجالات 2 و 3. يتم شد الفوسفات بشكل مصطنع في الرسوم البيانية لالوضوح البصري. متباعدة عمليات الانتقال لفتين حلزونية (21 قواعد) وبصرف النظر (<قوي> الشكل 1B). ويشار إلى مستطيلات المركبة من قبل أبعادها في عدد من اللوالب والمنعطفات حلزونية. على سبيل المثال، المستطيل الذي هو ستة اللوالب واسعة وثمانية حلزونية يتحول المشار إليها بوصفها 6H × 8T مستطيل طويل. درجات حرارة سطح البحر يمكن استبعاده، وأضاف، أو إعادة ترتيبها على خلاف ذلك لإنشاء هياكل من الأشكال والأحجام (الشكل 1C) التعسفية. على سبيل المثال، تصميم مستطيل ويمكن إرجاع في أنبوب بطول المطلوب ونصف قطرها (1D الشكل).

بدلا من ذلك، يمكن أن ينظر إلى طائرة أسرع من الصوت شعرية مستطيلة كما قماش الجزيئي تتكون من طائرة أسرع من الصوت بكسل، كل 3 نانومتر بنسبة 7 نانومتر. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم قماش الجزيئي 310 بالطول درجات حرارة سطح البحر الداخلية، 24 درجات حرارة سطح البحر بالطول التي تشكل الحدود اليمنى واليسرى، و 28 درجات حرارة سطح البحر نصف طول تشكيل حدود العلوية والسفلية. قماش من 24 اللوالب مزدوجة مرتبطة من قبل عمليات الانتقال وكل الحلزون يحتوي على 28 المنعطفات حلزونية (294 قواعد) وبالتالي يشار إليها باسمو24H × 28T مستطيل قماش. و24H × 28T قماش له وزن جزيئي مماثلة لتلك التي من بنية اوريغامي الحمض النووي التي تم إنشاؤها من فج سقالة M13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. DNA تسلسل التصميم

  1. استخدام البرمجيات UNIQUIMER 27 لتصميم هيكل SST-محدود عن طريق تحديد عدد من اللوالب مزدوجة، أطوال من أعلى وأسفل الحلزون لكل الحلزون المزدوج، ونمط انتقال لخلق 24H × 28T قماش. بعد تحديد هذه المعايير، ويتضح البناء الشامل (تكوين حبلا وترتيب التكامل) بيانيا في البرنامج.
  2. إنشاء تسلسل للخيوط بنية محددة لتلبية ترتيب التكامل ومتطلبات إضافية (إن وجدت). تصميم تسلسل الحمض النووي عن طريق التقليل من التماثل تسلسل 28 (بالنسبة لمعظم الهياكل).
    1. توليد النيوكليوتيدات (A، C، G و T) واحدة عشوائيا من جانب واحد.
    2. النيوكليوتيدات مباراة مكملة لتلك التي تم إنشاؤها في أعقاب حكم قاعدة الاقتران: من أ إلى T والعكس بالعكس؛ C إلى G والعكس بالعكس.
    3. لا تستخدم شرائح تكرار ما بعد ثمانية أو تسعة النيوكليوتيدات. عندما يكون هذا مندوبتناول شرائح تظهر أثناء التصميم، يتحور النيوكليوتيدات ولدت مؤخرا حتى يتم إعداد متطلبات تكرار القطاعات غير راض.
    4. لا تستخدم أربعة A، C، G أو T قواعد متتالية.
    5. استخدام النيوكليوتيدات مسبقا محددة عند نقاط الربط واحدة الذين تقطعت بهم السبل (على سبيل المثال T وG كما النيوكليوتيدات الحادية والعشرين والثانية والعشرين على التوالي، بالنسبة لمعظم فروع) لتجنب انزلاق القواعد حول نقاط الربط (على سبيل المثال، إذا كان كل وكانت النيوكليوتيدات الحادية والعشرين والثانية والعشرين T، كان من الممكن للالنوكليوتيدات الحادية والعشرين لربط النوكليوتيدات أن النوكليوتيدات الثانية والعشرين من المفترض أن ربط).
  3. تعديل تسلسل الحمض النووي يدويا لوضع العلامات ستربتافيدين، والتحول من المستطيلات في أنابيب، وتشكيل مستطيلات وأنابيب عبر مختلف المستويات المختلفة، ومنع تجميع الناجمة عن المجالات تعرض على طائرة أسرع من الصوت.
    1. استبدال المجالات تعرض على الحدود من قماش الجزيئي مع بولي-T هيئة تنظيم الاتصالاتسنت.
    2. لوضع العلامات ستربتافيدين، تصميم شرائح مقبض (الجزء الإضافي إلحاق حبلا المكون الذي يمكن أن تربط إلى نظيره مكملة مثل حبلا مكافحة مقبض) هذه التي يمكن أن تستوعب حبلا المضادة للمقبض مع 3 'تعديل البيوتين.
    3. لتحويل مستطيل في أنبوب، وإزالة الصفوف العليا والسفلى من المستطيل وإدراج صف جديد الذي يكون التكامل المحدد إلى البلاط المقابلة في اليوم الثاني إلى الصف العلوي والثاني على الصف السفلي درجات حرارة سطح البحر.
    4. للحصول على مجال واحد يتعرض الذين تقطعت بهم السبل من الأشكال المختلفة، مع استبدال بولي-T شرائح 10-11 النيوكليوتيدات طول، أو تغطية من قبل حماة الحافة التي هي مكملة لالمجال المكشوفة وإنهاء مع 10-11 النوكليوتيدات طويلة شرائح بولي-T.

2. إعداد قماش الجزيئية

  1. الحصول على خيوط مكون الحمض النووي لتسلسل محدد يذوب في الماء ريبونوكلياز خالية من oligonucleotiدي المصنعة في أسفل V 96 لوحات جيدة مع [أليغنوكليوتيد تصنيعه على نطاق و10 نانومول مع تحلية القياسية. الطرد المركزي ال 96 لوحات جيدة مع خيوط الحمض النووي لنحو 10 ثانية في 600 ز س.
    1. ماصة 1 ميكرولتر من كل من 362 بئرا مع حمض النووي ل24H × 28T المستطيل الشكل (3A) في 100 ميكرومتر في حبلا (الصانع مواصفات) إلى 2 مل أنبوب اختبار. إضافة 138 ميكرولتر من المقطر H 2 O منزوع الأيونات إلى أنبوب 2 مل اختبار لجعل حل الأسهم من خليط حبلا بتركيز 200 نيوتن متر لكل حبلا.
  2. إضافة 50 ميكرولتر من حل 200 نانومتر الأسهم من خليط حبلا، 10 ميكرولتر من 10X الصلب عازلة A (50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.9، 10 ملي EDTA، 250 ملي MgCl 2)، و 40 ميكرولتر من المقطر H 2 O منزوع الأيونات إلى 0.2 مل PCR أنبوب. هذا يجعل العينة 100 ميكرولتر من قماش الجزيئي في 1X العازلة الصلب A (5 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.9، 1 ملم EDTA، 25 ملي MgCl 2).
  3. يصلب sampl الدراسيه لمدة 17 ساعة في cycler الحرارية التبريد من 90 ° C إلى 25 ° C. برنامج cycler الحرارية على النحو التالي: المنحدر نزولا من 90 ° C إلى 61 ° C بسرعة ثابتة من 5 دقائق في درجة مئوية. المنحدر نزولا من 60 ° C إلى 25 ° C بسرعة ثابتة من 20 دقيقة في درجة مئوية. واحتضان عند 4 درجات مئوية حتى يمكن أخذ عينة من cycler الحرارية.
  4. إعداد الأصلي 2٪ agarose هلام.
    1. قياس 2.4 غرام من الاغاروز في كوب 600 مل. إضافة 120 مل من 0.5X TBE العازلة (44.5 ملي تريس بورات، ودرجة الحموضة 8.3، 1 ملم EDTA) و 30 مل من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى الدورق.
    2. الميكروويف لمدة 3 دقائق (أو 40-60 ثانية أكثر بعد الغليان). تجديد الماء المفقود خلال التبخر بإضافة 30 مل من الماء، مما يساعد على الحفاظ على تركيز الاغاروز في هلام عند 2٪.
    3. دوامة محتويات الكأس لمدة 1 دقيقة في حمام الماء البارد. إضافة 1 مل من 1.2 M MgCl 2 (لجعل 10 ملي MgCl تركيز 2 في هلام) وقبل وصمة عار على خفة دم هلامح 6 ميكرولتر من صبغ SYBR الآمن (1: 20000).
    4. من أجل حل هلام داخل مربع هلام الجافة وتضاف 1.5 مم 12 جيدا الكهربائي للهلام المشط. اسمحوا الحل يصلب لمدة 15 - 30 دقيقة على منصة حتى.
    5. صب عازلة هلام التوالي (44.5 ملي تريس بورات، ودرجة الحموضة 8.3، 1 ملم EDTA، و 10 ملي MgCl 2) في مربع هلام. تحميل 2-3 ميكرولتر من 1 كيلوبايت DNA سلم في بئر من هلام الاغاروز. خلط 4 ميكرولتر من 6X برموفينول صبغة زرقاء (0.25٪ برموفينول الزرقاء، 5 ملي تريس، 1 ملم EDTA، 10 ملي MgCl 2 و 30٪ الجلسرين) مع 20 ميكرولتر من عينة من قماش الجزيئي وتحميل الحل في جانب آخر من هلام الاغاروز.
  5. تشغيل الأصلي 2٪ الاغاروز لمدة 2 ساعة على 100 V في حمام ماء مثلج (برموفينول الأزرق، كما هو موضح باللون الأزرق، يعمل بشكل أسرع من خيوط المكونة لذلك يمكن أن تكون بمثابة مؤشر على أن إذا كان الوقت 2 ساعة تشغيل مناسب).
  6. الصورة الجل باستخدام ماسح ضوئي هلام مع مرشح مناسب لوصمة عار آمنة SYBR (الشكل 2B ).
  7. على transilluminator الضوء الأزرق، استئصال الفرقة السائدة مع التنقل على غرار عصابة من 1500 أزواج قاعدة DNA سلم 1 كيلو بايت باستخدام شفرة حادة حلاقة نظيفة. ضع قطعة هلام المطلوب (ق) في عمود الدوران ثم سحق هلام الى قطع صغيرة باستخدام مدقة microtube. أجهزة الطرد المركزي في 438 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
  8. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام معمل الأشعة فوق البنفسجية في 260 نانومتر.
    1. استخدام 2 ميكرولتر من الدناز عالى النقاء / المياه ريبونوكلياز مجاني المقطر كما فارغة لمعايرة الجهاز.
    2. استخدام ما يعادل حجم العينة التي تم جمعها من عمود الدوران للحصول على تقدير من تركيز الحمض النووي. فإن قيمة قياس تركيز ("أ" = نانوغرام / ميكرولتر) حصلت على امتصاص الأشعة فوق البنفسجية من 260 نانومتر تساعد في تحديد عامل التخفيف عن AFM والتصوير TEM.
    3. تحويل تركيز يقاس من "أ" (نانوغرام / ميكرولتر) إلى "ب" (نانومتر) بعد ب = أ × 10 6 / (330 &# 215؛ عدد من النيوكليوتيدات).
      ملاحظة: الوزن الجزيئي للالنوكليوتيدات 330 جم / مول. فإن قيمة التركيز المولي تحسب تحديد عامل التخفيف عن AFM وTEM التصوير. أما بالنسبة للحالة 24H × 28T المستطيل، وقياس مشترك لعينة النقاء حوالي 10-60 نانوغرام / ميكرولتر. حيث وصل عدد من النيوكليوتيدات لمثل هذا الهيكل هو 14616 دا، وتركيز المولي ما يقرب من 2-12 نانومتر. يتم تحديد تركيز النهائي من العائد جمع (~ 20 - 50٪) من الطرد المركزي وحجم الفرقة هلام رفعه من (كلما زاد حجم، والمزيد من تمييع العينة المنقى).

3. التصوير الذرية قوة المجهر

  1. تقشر الميكا تعلق على القرص العينة المعدنية باستخدام الاسكتلندي للحصول على سطح مستو وضع القرص العينة على مرحلة التصوير.
  2. إضافة 40 ميكرولتر من 1X العازلة الصلب وتليها 5 ميكرولتر (2-5 نانومتر) من العينة المنقى من 24H × 28Tالمستطيل على سطح الميكا المشقوق حديثا. يسمح هذا المزيج ليستقر لحوالي 2 دقيقة.
  3. تثبيت فؤاد نيتريد السيليكون ناتئ رقاقة على حامل ناتئ. استخدام غيض C الثلاثي (تردد الرنين، و 0 = 40-75 هرتز، وربيع دائم، ك = 0.24 نيوتن متر -1) للتصوير.
  4. صورة عينة في وضع التنصت على السوائل. استخدام المعلمات التصوير التالية لمسح: مسح حجم 2 ميكرون، 1024 خطوط لصالح القرار، ومعدل المسح من 0،5-1 هرتز (الشكل 2C).
  5. إذا لزم الأمر، إضافة 10 ميكرولتر أو أكثر من 10 ملي NiCl 2 الحل لزيادة قوة ملزمة 29 DNA-الميكا.

4. إعداد نموذج لستربتافيدين وصفها

  1. تصميم 24H × 28T المستطيل بحيث يتم دمج فروع مقبض في مواقع محددة لتكون مكملة لفروع مكافحة مقبض مع تعديل البيوتين، والتي بدورها تكون قادرة على ربط streptavid يدويافي على وجه التحديد.
    1. تعديل قماش الجزيئي عن طريق ربط "الجزء 17 النوكليوتيدات 3 الذي يتكون من سلسلة يومين النوكليوتيدات (TT) كفاصل ومقبض 15 النوكليوتيدات (GGAAGGGATGGAGGA) إلى البلاط 14 في الصف العلوي و 14 البلاط في الجزء السفلي صف من المستطيل الشكل (3A) لتسمية الحدود. هذا التسلسل هو مكمل ل3 'البيوتين تعديل حبلا مكافحة مقبض (TCCTCCATCCCTTCC البيوتين).
  2. لوصفها الداخلي، ونعلق الجزء 3 "17 النوكليوتيدات إلى 8 البلاط الداخلية و 6 البلاط حدود المستطيل الشكل (4A).
    1. مزيج من 28 فروع مع مقابض (الوسم الحدود) مع بقية فروع المكونة لل24H × المستطيل 28T (334 فروع) لتقديم 200 نانومتر حل سهم. مزيج من 14 فروع مع مقابض (وضع العلامات الداخلي) مع بقية فروع المكونة لل24H × المستطيل 28T (348 فروع) للحصول على 200 نانومتر حل سهم.
  3. لبووضع العلامات undary، إضافة 50 ميكرولتر من 200 نانومتر حل الأسهم للفروع، 6 ميكرولتر من 100 ميكرومتر البيوتين تعديل مسارات المضادة للمقبض، 10 ميكرولتر من 10X الصلب عازلة A، و 34 ميكرولتر من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى 0،1-0،2 مل PCR أنبوب اختبار. التركيز النهائي من حبلا العنصر هو 100 نانومتر وتركيز النهائي من حبلا تعديل المضادة للمقبض البيوتين هو 6000 نانومتر. لاحظ أن 28 جزيئات مضادة للتعامل مع البيوتين تعديل حبلا ربط إلى 24H × 28T المستطيل ذلك حبلا المضادة للتعامل مع البيوتين المعدلة في أكثر من 100٪ لجعل الربط مواتية.
  4. لوصفها الداخلي، إضافة 50 ميكرولتر من 200 نانومتر حل سهم فروع و 3 ميكرولتر من مكافحة تعامل مع البيوتين حبلا الداخلي تعديل في 100 ميكرومتر، 10 ميكرولتر من 10X العازلة الصلب A، 37 ميكرولتر من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى 0.1 - 0.2 مل PCR أنبوب اختبار. التركيز النهائي من حبلا العنصر هو 100 نانومتر وتركيز النهائي للمكافحة مقبض البيوتين modifi إد حبلا هو 3000 نانومتر. لاحظ أن 14 جزيئات مضادة للمقبض البيوتين تعديل حبلا ربط إلى 24H × 28T المستطيل بحيث المضادة للتعامل مع البيوتين حبلا تعديل ما يزيد عن 100٪ لجعل الربط مواتية.
  5. يصلب كل من العينات في cycler الحرارية لمدة 17 ساعة باستخدام الخطوات الموضحة في 2.3.
  6. إعداد الأصلي 2٪ هلام الاغاروز كما هو موضح في الخطوات 2.4.
  7. تنقية العينتين كما هو موضح في الخطوات 2.5.
  8. قياس تركيزات الهياكل DNA المطلوب كما هو موضح في الخطوات 2.6.

5. الذرية قوة المجهر لوصفها ستربتافيدين

  1. صورة كل عينة باستخدام AFM كما هو موضح في الخطوة 3 (أرقام 3B و 4B).
  2. بعد الجولة الأولى من التصوير، وإضافة 40 ميكرولتر من 1X العازلة الصلب وتليها 1 ميكرولتر من ستربتافيدين في 10 ملغ / مل للعينة. يسمح هذا المزيج ليستقر لحوالي 2 دقيقة قبل reimaging (أرقام 3C و4C).
_title "> 6. تحويل مستطيل في أنبوب

  1. من أجل تصميم أنبوب استنادا إلى المستطيل، والحفاظ على كل من درجات حرارة سطح البحر مكون في مكان باستثناء الصفوف العليا والسفلى. إدخال صف جديد التي تم تصميمها بواسطة وصل أعلى وأسفل البلاط نصف الأعمدة كل منهما إلى cyclize المستطيل الأصلي في أنبوب التشكل (الشكل 5A) درجات حرارة سطح البحر.
  2. مزيج من صف جديد من خيوط (14 فروع) مع خيوط المكونة لل24H × 28T المستطيل باستثناء الصفوف العليا والسفلى (336 فروع) للحصول على 200 نانومتر حل سهم.
  3. اتبع تنقية هلام خطوات 2،2-2،7 (الشكل 5B).

7. نقل الكترون المجهر التصوير

  1. تزن 0.06 غرام من اليورانيل فورمات في 3 مل من الماء المقطر لإعداد 2٪ اليورانيل مائي حل فورمات وصمة عار. تصفية 2٪ المائية اليورانيل فورمات حل وصمة عار باستخدام 0.2 ميكرومتر مرشح لتولي المحاقن.
    1. إضافة 5 ميكرولتر من5 N هيدروكسيد الصوديوم إلى 1 مل من محلول صمة عار تصفيتها. دوامة لفترة وجيزة الحل وأجهزة الطرد المركزي في 20000 ز س.
  2. توهج تصريف شبكات الكربون المغلفة (الجانب المغلفة تواجه متابعة) بالإعدادات التالية: 25 مللي أمبير، 45 ثانية، 0.1 ميللي بار، والسلبية عالية التوتر قطبية.
  3. استخدام ملقط ذاتية الإغلاق للاستيلاء على الشبكة تعامل توهج مفرغ من الحافة.
  4. ماصة 3.5 ميكرولتر من العينة على الشبكة لمدة 4 دقائق. استخدام قطعة من ورق الترشيح لالفتيل قبالة عينة من خلال جلب ورقة الترشيح في اتصال مع شبكة من الجانب.
  5. على الفور إضافة 3.5 ميكرولتر من الحل وصمة عار على الشبكة لمدة 1 دقيقة.
  6. الفتيل قبالة صمة عار كما هو الحال في 7،4 وعقد ورقة الترشيح ضد شبكة ل1-2 دقيقة.
  7. نقل الشبكة لصاحب العينة TEM والصورة باستخدام JEOL حركة العدل والمساواة-1400 تعمل في 80 كيلو فولت مع التكبير تتراوح ما بين 10 إلى 80 K K (الشكل 5C).

8. بناء الأشكال التعسفية باستخدام Moleculع قماش

  1. تحديد شكل وتحديد مسارات التي تتوافق مع الشكل على قماش الجزيئي. لشكل مثلث على سبيل المثال، حدد 206 من 362 فروع للقماش الجزيئي.
  2. استبدال المجال يتعرض (وهذا هو، على طول وتر المثلث) مع قطعة بولي-T 10-11 النيوكليوتيدات طويلة (تصميم 1 في الشكل 6A)، أو إضافة حافة الحامي أنه مكمل للالمجال المكشوفة وإنهائه مع 10 - شريحة طويلة بولي-T 11 النوكليوتيدات (تصميم 2 في الشكل 6A) لمنع التجميع.
    ملاحظة: ببساطة والصلب في درجات حرارة سطح البحر التي تتوافق مع بكسل للمثلث (دون استخدام خيوط حامية) سوف يؤدي إلى تجميع وليس متميزة تشكيل الفرقة المنتج على مادة هلامية. استخدام تصميم حافة الحامي لمختلف الأشكال كما هو أكثر كفاءة، من الموارد؛ فهي تتطلب سوى أربع مجموعات إضافية من خيوط (الشكل 6C) بالمقارنة مع 14 مجموعات إضافية في تصميم استبدال (شملت رقمالبريد 6B).
  3. إنشاء مكتبة حبلا لوحة زيتية على قماش الجزيئي 310 بكسل والذي يتضمن مجموعة أساسية (قماش 362 طائرة أسرع من الصوت)، مجموعة 1 * (حافة حماة التي تربط إلى مجال 1 لطائرة أسرع من الصوت)، مجموعة 2 * (حافة حماة التي ترتبط بالمجال 2 لطائرة أسرع من الصوت)، تعيين 3 * (حافة حماة التي تربط إلى مجال 3 من طائرة أسرع من الصوت)، وتعيين 4 * (حافة حماة التي تربط إلى مجال 4 من طائرة أسرع من الصوت) لإعطاء ما مجموعه 1344 حافة حماة.
  4. أجهزة الطرد المركزي ال 96 لوحات جيدة لمختلف مجموعات لنحو 10 ثانية. الماصة من فروع المطلوب من لوحات من أجل جعل حل الأسهم لشكل معين.
    1. لشكل مثلث مع حماة الحافة، ماصة 1 ميكرولتر من 206 خيوط من مجموعة أساسية، 0 من مجموعة 1 *، 0 من مجموعة 2 *، 0 من مجموعة 3 * و 24 فروع من مجموعة 4 * في 2 مل الطرد المركزي أنبوب. إضافة 20 ميكرولتر من الماء المقطر منزوع الأيونات إلى أنبوب لتقديم 400 نانومتر حل الأسهم للحمض النووي.
  5. إضافة 50 ميكرولتر من حل 400 نانومتر الأسهم من سترا DNA إدارة الأمن الوطني، و 10 ميكرولتر من 10X العازلة الصلب B (50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.9، 10 ملي EDTA، 125 ملي MgCl 2) حل سهم و 40 ميكرولتر المقطر H 2 O منزوع الأيونات إلى 0.2 مل PCR أنبوب. هذا يجعل العينة 100 ميكرولتر من المثلث في 1X العازلة الصلب B (5 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.9، 1 ملم EDTA، 12.5 ملي MgCl 2) مع خيوط بتركيز حوالي 200 نانومتر في حبلا.
  6. يصلب الخليط في cycler الحرارية لمدة 17 ساعة كما هو موضح في الخطوة 2.3.
  7. إعداد الأصلي 2٪ هلام الاغاروز كما هو موضح في الخطوة 2.4.
  8. تنقية العينة كما هو موضح في الخطوة 2.5.
  9. قياس تركيز الحمض النووي كما هو موضح في الخطوة 2.6.
  10. صورة العينة تحت AFM كما هو موضح في الخطوة 3 (الشكل 7C و7D).
  11. اختيار ومزج الخيوط لأشكال مختلفة باستخدام مكتبة حبلا نفسها. يصلب الحلول المختلفة والجمع بين عينات تنقيته من الأشكال المختلفة لتوفير الوقت أثناء AFM التصوير.
jove_title "> 9 الاختياري: روبوت الآلي من تصميم الشكل وخلط السائل

  1. استخدام برنامج MATLAB مخصصة للمساعدة في تصميم الأشكال المعقدة.
  2. استخدام البرنامج لتقديم إرشادات في شكل تسلسل pipetting للمعالج روبوت السائل. استخدام معالج السائل الروبوت لتحديد ومزج الخيوط التي تشكل شكل الهدف.
    تم تصميم الشكل الآلي وحبلا خلط للحد من الأخطاء البشرية وجعل البناء أقل كثافة عمالية: ملاحظة.

10. المستطيلات وأنابيب عبر مستويات مختلفة

  1. بناء مختلفة مستطيلات الحجم (الشكل 10) ببساطة عن طريق تغيير عدد من اللوالب موازية (H) وعدد لفات حلزونية (T).
  2. اتبع الخطوة 3 لحجم المستطيل المحدد.
  3. اتبع الخطوة 6 لأنبوب حجم معين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن التجميع الذاتي للدرجات حرارة سطح البحر (الشكل 1) تسفر عن 24H × 28T المستطيل، كما هو موضح في الشكل (2). تسلسل الحمض النووي لدرجات حرارة سطح البحر مختلفة يمكن تعديلها / الأمثل لتمكين وضع العلامات ستربتافيدين (الشكل 3 و 4)، وتحول ل المستطيل في أنبوب (الشكل 5)، وبرمجة التجميع الذاتي للدرجات حرارة سطح البحر لتشكيل الأنابيب والمستطيلات ذات أحجام مختلفة (الشكل 10)، وبناء الأشكال التع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في خطوة تشكيل هيكل، فمن المهم للحفاظ على التركيز المناسب من الكاتيونات المغنيسيوم (على سبيل المثال، 15 ملم) في خليط حبلا الحمض النووي DNA لالنانو تجميع ذاتي. وبالمثل، في خطوة توصيف الجل الاغاروز / تنقية، فمن المهم للحفاظ على تركيز الأيونات الموجبة المغنيسيوم المناسب (على سبيل المثال، 10 ملم) في هلام وعازلة هلام التوالي للاحتفاظ النانو DNA خلال الكهربائي. ل24H × هيكل 28T المستطيل، اختبرنا الصلب في تركيزات مختلفة مغ ++ وجدت أن هيكل شكلت عادة في حدود 10-3...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عن مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مكتب برنامج باحث بحوث البحرية يونغ جائزة N000141110914، مكتب بحوث البحرية غرانت N000141010827، NSF التوظيف جائزة CCF1054898، مبتكر جديد جائزة 1DP2OD007292 مدير معاهد الصحة القومية ومعهد ويس لوحي بيولوجيا صندوق بدء التشغيل كلية الهندسة (لPY) و مركز صندوق بدء التشغيل علوم الحياة ل(لBW) تسينغهوا-بكين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
خيوط الحمض النووي الحمض النووي المتكاملةالقسم 3.1
SYBR صبغة هلام الحمض النووي الآمنةInvitrogenS33102القسم 3.4.2
Freeze'N ضغط استخراج هلام الحمض النووي أعمدة الدورانBIO-RAD731-6166القسم 3.6
مجسات ذراع نيتريد حادة من Brukerمجسات بروكر AFMSNL10القسم 4.3
تصوير آمن 2.0 ضوء أزرق TransilluminatorInvitrogenG6600القسم 3.6
جهاز الطرد المركزي 5430REppendorf5428 000.414القسم 3.6
مجهر الإلكترون الإرسال JeolJem 1400القسم 7.4
متعدد الأوضاع 8Veecoالقسم 4
Typhoon FLA 9000 ماسح ضوئي بالليزرGE Heathcare Life Sciences28-9558-08القسم 3.5
الماء المقطر عالي النقاءInvitrogen10977-023القسم 3.7.1
لوازم قرص الميكاSPI12001-26-2القسم 4.1
قرص تركيب الصلبتيد بيلا ، إنك.16218القسم 4.1
شبكة نحاسية مطلية بالكربون لعلومالمجهر الإلكترونيTEM FCF400-Cuالقسم 7.2
ملاقطDumont0203-N5AC-POالقسم 7.31
نظام تفريغ التوهجQuorum TechnologiesK100Xالقسم 7.2
محرك الحمض النووي رباعي 2 Peltier Thermal CyclerBIO-RADPTC &ndash ؛ 0240Gالقسم 3.3
أنظمة الرحلان الكهربائي للهلام الصغير Wol Easycast B2ThermoScientificB2القسم 3.4.3
Seekam LE Agarose 500GLonza50004القسم 3.4.1
GeneRuler 1kb Plus سلم الحمض النووي ، جاهز للاستخدام 75-20000bpThermoScientificSM1333القسم 3.4.4
Nanodrop 2000c UV-vis مقياس الطيفThermoScientificالقسم 3-7
0.2 أم مرشحشركة Corning Inc.431219القسم 7.1.2
تقنية الضوئي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J. Theor. Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
  2. Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  3. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Rothemund, P. W. K., Papadakis, N., Winfree, E. Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles. PLoS Biol. 2 (12), e424(2004).
  6. Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
  7. Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
  8. Park, S. H., et al. Finite-size, fully-addressable DNA tile lattices formed by hierarchical assembly procedures. Angew. Chem. Int. Ed. 45 (5), 735-739 (2006).
  9. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  10. Schulman, R., Winfree, E. Synthesis of crystals with a programmable kinetic barrier to nucleation. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 104 (39), 15236-15241 (2007).
  11. He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
  12. Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  13. Sharma, J., et al. Control of self-assembly of DNA tubules through integration of gold nanoparticles. Science. 323 (5910), 112-116 (2009).
  14. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
  15. Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
  16. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
  17. Zheng, J. P., et al. From molecular to macroscopic via the rational design of self-assembled 3D. DNA crystal. Nature. 461 (7260), 74-77 (2009).
  18. Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
  19. Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. Crystalline two-dimensional DNA origami arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (1), 264-267 (2011).
  20. Zhao, Z., Liu, Y., Yan, H. Organizing DNA origami tiles into larger structures using preformed scaffold frames. Nano Lett. 11 (7), 2997-3002 (2011).
  21. Woo, S., Rothemund, P. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nat. Chem. 3 (8), 620-627 (2011).
  22. Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
  23. Lin, C., Liu, Y., Rinker, S., Yan, H. DNA tile based self-assembly: building complex nanoarchitectures. ChemPhysChem. 7 (8), 1641-1647 (2006).
  24. Seeman, N. C. Nanomaterials based on DNA. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 65-87 (2010).
  25. Voigt, N. V., Nangreave, J., Yan, H., Gothelf, K. V. DNA origami: a quantum leap for self-assembly of complex structures. Chem. Soc. Rev. 40 (12), 5636-5646 (2011).
  26. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex Shapes self-assembled from single stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
  27. Wei, B., Wang, Z., Mi, Y. Uniquimer: software of de novo DNA sequence generation for DNA self-assembly: an introduction and the related applications in DNA self-assembly. J. Comput. Theor. Nanosci. 4 (1), 133-141 (2007).
  28. Seeman, N. C. De novo design of sequences for nucleic acid structural engineering. J. Biomol. Struct. Dyn. 8 (3), 573-581 (1990).
  29. Hansma, H. G., Laney, D. E. DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy. Biophys. J. 70 (4), 1933-1939 (1996).
  30. Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. Enzyme-free nucleic acid logic circuits. Science. 314 (5805), 1585-1588 (2006).
  31. Yin, P., Choi, H. M. T., Calvert, C. R., Pierce, N. A. Programming biomolecular self-assembly pathways. Nature. 451 (7176), 318-322 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single stranded DNA TilesDNA Nanostructure Self assemblyMolecular Canvas AssemblyNative Agarose Gel ElectrophoresisAtomic Force Microscopy ImagingDNA Strand PurificationThermal Cycler AnnealingEdge Protector DesignDomain Substitution MethodDNA Concentration Measurement

Related Articles