يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تقييم الغزو البكتيري لخلايا القلب في الثقافة والاستعمار القلب في الفئران المصابة باستخدام monocytogenes الليستيريا

4.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52497

⸱

مايو 27, 2015

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, University of Illinois at Chicago

في هذه المقالة

ملخص

الليستيريا monocytogenes يسبب التهابات الجنين في النساء الحوامل والتهاب السحايا في السكان المعرضين. يمكن أن تستعمر الاكتظاظ السكاني الفرعي للبكتيريا أنسجة القلب ، مما يسبب التهاب عضلة القلب في المرضى المختبر. هنا نقدم بروتوكولا يصف كيفية تقييم L. monocytogenes غزو الخلايا القلبية في المختبر والاستعمار القلبي في الحيوانات المصابة.

الملخص

الليستيريا monocytogenes هو مسببات الأمراض داخل الخلايا إيجابية الغرام التي هي قادرة على التسبب في التهابات الغازية الخطيرة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة، وكبار السن، والنساء الحوامل. المظاهر الأكثر شيوعا من الليستريات في البشر تشمل التهاب السحايا والتهاب الدماغ والإجهاض الجنيني. وهناك تتمة كبيرة ولكن أقل توثيقا بكثير من العدوى L. monocytogenes الغازية ينطوي على القلب. يمكن أن يصل معدل الوفيات الناجمة عن مرض القلب إلى 35٪ على الرغم من العلاج ، ولكن لا يعرف سوى القليل جدا فيما يتعلق ب استعمار L. monocytogenes للأنسجة القلبية والأمراض الناتجة عنها. وبالإضافة إلى ذلك، أصبح من الواضح مؤخرا أن الاكتظاظ السكاني الفرعي من L. monocytogenes لديها قدرة معززة لغزو وتنمو داخل الأنسجة القلبية. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل في المختبر وفي أساليب الجسم الحي التي يمكن استخدامها لتقييم cardiotropism من L. يعزل monocytogenes. وتقدم أساليب للعدوى من الخلايا العضلية القلبية الفئران H9c2 في زراعة الأنسجة، فضلا عن تحديد الاستعمار البكتيري لقلوب الفئران المصابة. هذه الأساليب مفيدة ليس فقط لتحديد السلالات التي يمكن أن تستعمر الأنسجة القلبية في الحيوانات المصابة ، ولكن قد تسهل أيضا تحديد المنتجات الجينية البكتيرية التي تعمل على تعزيز غزو خلايا القلب و / أو دفع التغيرات في أمراض القلب. هذه الأساليب توفر أيضا للمقارنة المباشرة من القلب بين سلالات متعددة L. monocytogenes.

المقدمة

الليستيريا monocytogenes هو الممرض داخل الخلايا إيجابية غرام قادرة على التسبب في مرض شديد في السكان المعرضين، بما في ذلك كبار السن، والنساء الحوامل، والأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز، والأشخاص الذين يتلقون العلاج الكيميائي1. وكثيرا ما تكون العدوى بين هذه المجموعات نتيجة تناول منتجات غذائية ملوثة، وترتبط معظم الإصابات بتفشي المرض على نطاق واسع المنقول بالأغذية2.3. في البشر والثدييات الأخرى ، L. monocytogenes قادرة على نقل عبر الحدود الظهارية للأمعاء الدقيقة ، وبعد ذلك يتم نقلها إلى الكبد4،5. وتشير النماذج الحيوانية إلى أن البكتيريا المبتلعة تتكرر داخل الزغب المعوي وتمر إلى الكبد عبر الوريد البوابي أو تنتشر عبر الغدد الليمفاوية الميسنتريكية في مجرى الدم، مما يؤدي إلى انتشار الدم إلى الكبد والطحال6،7. في الكبد والطحال ، والبكتيريا قادرة على التوسط امتصاص في كل من الخلايا الفصيلية المهنية وكذلك الخلايا parenchymal المقيمين ، ويقيم بسرعة العدوى داخل هذه الأجهزة. مع زيادة الحمل البكتيري ، يتم تشتيت العديد من البكتيريا مرة أخرى في الدم ، حيث تكون قادرة على استعمار المزيد من الأنسجة المعرضة بما في ذلك الجهاز العصبي المركزي والمشيمة (عند وجودها). استعمار هذه المواقع يحول دون المظاهر الأكثر شيوعا من الليستريات في البشر، بما في ذلك التهاب السحايا والتهاب الدماغ، والإجهاضالجنيني 2.

وقد تبين مؤخرا أن الخلايا الفرعية المختارة من L. monocytogenes لديها قدرة معززة على غزو وتكرار داخل الأنسجة القلبية8. وتتنوع مظاهر مشاركة القلب، وتتراوح بين التهاب الشغاف والتهاب التامور، لالتهاب عضلة القلب فولمينانت كاملة مع تشوهات التوصيل9-13. العدد الإجمالي لحالات القلب أحادية السيتوجينات L. في السنة منخفض ولكن قد يكون أقل من التقدير لأن هذا الجانب من العدوى غير معترف به بشكل جيد بشكل عام. استعمار القلب من قبل مسببات الأمراض غالبا ما يتطلب الاستعداد المضيف مثل الضرر الصمامي الموجودة من قبل أو صمامات القلب الاصطناعية. ومع ذلك، هناك عزلات من L. monocytogenes التي تم تحديدها التي هي ملحوظة لقدرتها على استعمار قلوب الحيوانات المصابة في غياب أي تلف القلب و / أو شذوذ8.

هنا توصف في المختبر وفي أساليب الجسم الحي لتقييم الاستعمار البكتيري للأنسجة القلبية داخل الحيوانات المصابة باستخدام المقايسات الغزو في زراعة الأنسجة، فضلا عن العدوى الحيوانية الحية. وقد أثبتت هذه الطرق فائدتها ليس فقط لتحديد السلالات التي لديها القدرة على استعمار الأنسجة القلبية في الحيوانات المصابة ، ولكن ينبغي أيضا أن تكون مفيدة لتحديد المنتجات الجينية البكتيرية التي تعمل على تعزيز غزو خلايا القلب و / أو تؤدي إلى تغييرات في أمراض القلب. هذه الأساليب تسهل مقارنة القلب بين سلالات متعددة. للأساليب الموصوفة هنا, L. monocytogenes 10403S يستخدم كممثل مدروسة جيدا من سلالة غير القلب الاستوائية ويتم استخدام عزل السريرية 07PF0776 كمثال تمثيلي لسلالة القلب والتروبيك. وقد تم اختيار هذين النوعين لتوفير مقارنة للغزو البكتيري للخلايا القلبية في المختبر والاستعمار من قلوب الفئران المصابة في الجسم الحي. عزل 07PF0776 هو عزل السريرية تعافى من خراج التدخلية التي تسببت في عدم انتظام ضربات القلب القاتلة في فيروس نقص المناعة البشرية + المريض8. L. قد تختلف عزلات أحادية السيتوجينات في إمكاناتها الفوعة، ونظرا لميل ليستريا لإصابة الأشخاص مع كبت المناعة والنساء الحوامل، والأشخاص داخل هذه المجموعات السكانية يجب توخي الحذر أثناء تقييم العزلات السريرية المختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التخزين وظروف الثقافة لسلالات أحادية السيتوجينات

  1. إعداد وسائل الإعلام الصلبة عن طريق الالاستعباد الذاتي الدماغ القلب ضخ أجار (BHI) وصب وسائل الإعلام المنصهرة في لوحات بتري. السماح للوحات لتجف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، ثم بين عشية وضحاها مرة أخرى في 37 °C.
  2. باستخدام حلقة معقمة، والحصول على عينة صغيرة من L. monocytogenes إما مخزونات الفريزر التي سبق إجراؤها (البكتيريا المعلقة في 20٪ الجلسرين في وسائل الإعلام السائلة BHI، وتخزينها في -80 درجة مئوية) أو من لوحة أجار تحتوي على المستعمرات ضرب سابقا للعزلة.
  3. باستخدام تقنية مطهرة، خط العينة لعزل مستعمرة واحدة. تأكد من تعقيم الحلقة بين الشرائط المتقاطعة لمنع ترحيل الزائدة وضمان عزل المستعمرات الفردية للسلالة التي يجري تقييمها. احتضان لوحة (ق) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  4. باستخدام حلقة معقمة، قم بإزالة مستعمرة واحدة من عزل وتطعيم 2 مل من مرق BHI (بدون أجار) في أنبوب البوليسترين 14 مل.
  5. بالنسبة للمقاايسات والعدوى ، احتضن ثقافة المرق بشكل ثابت (دون اهتزاز) بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية. لتخزين العزلات المستزرعة ، احتضن ثقافة المرق عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 180-200 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. ويمكن تخزين الثقافات بإضافة الجلسرين إلى تركيز النهائي من 20٪ وتخزين أنابيب مختومة في -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.

2. تخزين وزراعة الظروف من H9c2 القلب الخلايا الشبيهة بالخلايا

  1. شراء أو الحصول على مخزون المجمدة من خلايا H9c2، فضلا عن دوبلكو النسر المعدل المتوسط (DMEM) التي تحتوي على ارتفاع الجلوكوز وبيروفات، مصل البقر الجنيني (FBS)، L-الجلوتامين (غلوتامين)، ومخاليط البنسلين-ستربتومايسين-الجلوتامين (PSG).  يجب تخزين FBS وGlud و PSG عند -20 درجة مئوية ، في حين يمكن تخزين DMEM عند 4 درجة مئوية. من المفيد أن aliquot FBS في 50 مل أنابيب مخروطية قبل التجميد.
  2. في غطاء محرك السيارة تدفق صفح، إذابة اثنين من aliquots من FBS. إضافة واحد aliquot إلى زجاجة واحدة 500 مل من DMEM، مما يجعل خليط FBS / DMEM 10٪. لهذا، إضافة 6 مل من التخمة وتخزين الحل الناتج في 4 درجة مئوية. يمكن تسمية هذا الحل "DMEM بدون مضادات حيوية". (DMEM -Ab)
  3. إلى زجاجة 500 مل الثانية من DMEM، إضافة أخرى 50 مل aliquot من FBS. لهذا الحل، إضافة 6 مل من باريس سان جيرمان والأسهم في 4 °C. يمكن تسمية هذا الحل "DMEM مع المضادات الحيوية". (DMEM + أب)
  4. بينما في غطاء محرك السيارة صفح، وإزالة 10 مل من DMEM + Ab ومكان في قارورة زراعة الأنسجة 25 مل.
  5. ترك القارورة في غطاء غطاء محرك السيارة، وإزالة aliquot المجمدة من خلايا H9c2 من التخزين في النيتروجين السائل ووضع بسرعة الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى ذوبان الثقافة.
  6. رش الأنبوب مع الإيثانول 70٪ لتطهير، ثم العودة إلى غطاء محرك السيارة. العمل بسرعة لتقليل وقت الخلية في DMSO المركزة، إضافة aliquot كامل من الخلايا إلى 10 مل من DMEM + Ab.  وهذا يضعف DMSO بما فيه الكفاية البقاء على الخلايا بين عشية وضحاها والالتزام.
  7. ضع القارورة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ C02، و 95٪ رطوبة بين عشية وضحاها.
  8. في صباح اليوم التالي، تحقق من طبقة الخلية لضمان الالتزام. من المرجح أن تكون الخلايا بين التقاء 80-100٪ بحلول هذا الوقت.
  9. في غطاء محرك السيارة الأنسجة والثقافة، وإزالة وسائل الإعلام الواردة داخل قارورة باستخدام الفراغ، وترك الخلايا فقط داخل القارورة.
  10. إضافة ما يقرب من 2 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA إلى الخلايا والصخور بلطف لمدة 3 ثوان تقريبا.
  11. عكس قارورة بحيث الحل التريبسين لم يعد على اتصال مع monolayer، وإزالة التربسين عن طريق الفراغ.
  12. إضافة ثانية 2 مل aliquot من التربسين إلى الخلايا، ونقل القارورة إلى المجهر مقلوب. مراقبة الخلايا في حين هزاز بلطف قارورة لضمان تفريق monolayer.
  13. بمجرد تفريق الطبقة الأحادية ، ارجع على الفور إلى غطاء محرك السيارة المليمتري للأنسجة وأضف 4 مل من DMEM + Ab إلى تعليق الخلية.
  14. إزالة جزء 2 مل من تعليق الخلية، وإضافته إلى قارورة زراعة الأنسجة 50 مل تحتوي على 23 مل من DMEM + Ab. صخرة القارورة بلطف، ثم وضعه في حاضنة الأنسجة والثقافة في الظروف المذكورة في الخطوة 2.5.
  15. تحقق من الخلايا يوميا حتى تصل إلى التقاء 80٪ تقريبا (حوالي 2.0-4.0 × 105 خلايا لكل مل). من المهم جدا أن الخلايا لا تصبح التقاء جدا، لأنها قد تفرق في الأنابيب العضلية الهيكل العظمي عندما يتضورون جوعا من FBS لفترات طويلة من الزمن14 وهذا التمايز يمكن أن يغير الغزو البكتيري.  مراقبة الخلايا بعناية وتبدأ مع أنبوب جديد من الخلايا إذا كان الثقافة يصبح التقاء.
  16. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء 80٪، يمكن إما أن يتم تمريرها إلى قارورة أخرى 50 مل كما هو موضح للتو، أو على استعداد لإجراء فحص الغزو.

3. إعداد خلايا H9c2 للغزو المقايسة

  1. في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة، وإزالة وسائل الإعلام من قارورة 50 مل من خلايا H9c2 التي وصلت إلى التقاء 80٪ باستخدام فراغ الطموح.
  2. إضافة 4 مل من 0.25٪ Trypsin-EDTA حل ل monolayer وإزالة فورا باستخدام فراغ الطموح.
  3. إضافة جزء آخر 4 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA إلى القارورة ونقل القارورة إلى مجهر مقلوب لمراقبة تشتت طبقة واحدة.
  4. بمجرد أن تفرق الخلايا، والعودة إلى غطاء محرك السيارة وإضافة 4 مل من DMEM -Ab إلى الخلايا. Pipetting الحل صعودا وهبوطا يضمن إزالة كاملة للخلايا من أسفل القارورة.
  5. بعد إعادة تعليق طبقة أحادية، وإزالة كل من تعليق ووضعه في أنبوب مخروطي 50 مل.
  6. إزالة جزء 20 ul من هذا التعليق وعد عدد الخلايا لكل ملليلتر باستخدام مقياس الدم.
  7. بمجرد تحديد تركيز الخلايا في المحلول، قم بضبط التركيز إلى 2.25 × 104 خلايا / مل عن طريق إضافة الحجم المناسب من محلول الخلية إلى DMEM -Ab الطازج. يجب أن يكون إجمالي حجم الحل المعدل 25 مل.
  8. بينما في غطاء محرك السيارة، تعقيم الزجاج coverlips عن طريق غمس لهم في الإيثانول 90٪ وتمرير لفترة وجيزة كل coverslip من خلال اللهب. إضافة كل غطاء إلى بئر فردية من 24 جيدا الأنسجة زراعة لوحة المعالجة مباشرة بعد تعقيمها.
  9. بعد كل الآبار لديها غطاء الفردية، واستخدام ماصة 25 مل لإضافة 1 مل من محلول الخلية المخفف إلى كل من الآبار في لوحة، ودفع كل coverslip أسفل مع إبرة معقمة.
  10. تحقق من كل بئر باستخدام مجهر مقلوب لضمان وجود كميات مماثلة من الخلايا في كل بئر. ضع لوحة البئر ال 24 في حاضنة زراعة الأنسجة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية فيرطوبة 5٪ CO 2 و 95٪.
  11. في صباح اليوم التالي، عرض كل بئر لضمان أن الأغطية لديها كميات مماثلة من الخلايا الميوبلاستات الملتصقة وأن الأغطية لا تطفو في البئر.

4. إعداد سلالات من L. monocytogenes لاقتراة الغزو

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الأعمال المختبرية وفقا لإرشادات CDC للسلامة البيولوجية من المستوى 2.

  1. بعد إعداد لوحة 24 جيدا للمقايسة، استخدم حلقة معقمة لإزالة مستعمرات واحدة من السلالات لفحصها للغزو البكتيري وتطعيم كل منها في أنابيب فردية 14 مل تحتوي على 2 مل من مرق BHI.
  2. ضع الأنابيب الملقحة في حاضنة 37 درجة مئوية مائلة عند 45 درجة واحتضنها بشكل ثابت (دون اهتزاز) بين عشية وضحاها.
  3. في صباح اليوم التالي، قم بإزالة أنبوب الثقافة من الحاضنة والدوامة لفترة وجيزة لضمان تعليق موحد للبكتيريا.
  4. قياس الكثافة البصرية للثقافة باستخدام مطياف في الطول الموجي 600 نانومتر. تأكد من صفر الطيف الضوئي باستخدام مرق BHI معقمة قبل قراءة الكثافة البصرية.
  5. بالنسبة ل L. monocytogenes، ترتبط الكثافة البصرية مباشرة بتركيز البكتيريا لكل مل ، بحيث تكون الكثافة 1.000 = 1.0 × 109 CFU لكل مل.
  6. حساب مقدار الثقافة اللازمة لإصابة 2.25 × 104 خلايا مع 2.25 × 106 (MOI = 100).
  7. إزالة كمية الثقافة اللازمة ووضعها في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل.
  8. تدور الثقافة في 19،000 × ز لمدة 3 دقائق، ثم تجاهل supernatant. اضغط على الطرف المفتوح للأنبوب مقابل منشفة ورقية من أجل إزالة الوسائط الزائدة العالقة في شفة الأنبوب.
  9. Resuspend البكتيريا في 1 مل من برنامج تلفزيوني معقم، ودوامة لضمان خلط كافية. يجب أن يحتوي هذا الخليط على حوالي 2.25 × 106 CFU لكل 20 ul (1.125 × 108 CFU /ml).

5. أداء فحص الغزو

  1. في اليوم السابق للغزو المقايسة، وإعداد لوحات 24 بئرا من خلايا H9c2 كما هو موضح في القسم 3، وأيضا تلقيح مرق BHI المعقمة مع السلالة المطلوبة (ق) من الليستيريا كما هو موضح في القسم 4.
  2. باستخدام البروتوكول في القسم 4، وإعداد الثقافات PBS-resuspended من السلالات لتقييم الغزو. ملاحظة: يمكن تقييم التيتر المعدية في هذه المرحلة عن طريق طلاء التخفيف من كل عينة على وسائل الإعلام الصلبة وعدد المستعمرات بعد الحضانة بين عشية وضحاها.
  3. تحميل ما لا يقل عن 20 ul من محلول البكتيريا PBS في الآبار الفردية من لوحة 24 جيدا. لاحظ أن هناك حاجة إلى ما لا يقل عن ثلاثة آبار فردية لكل سلالة من أجل الحصول على نتائج في ثلاثية، لذلك يمكن تقييم ما يصل إلى 8 سلالات جنبا إلى جنب.
  4. بعد تحميل الآبار بالبكتيريا، قم بصخز الصحن برفق لتشجيع الانتشار المتجانس لكل عينة داخل البئر، ووضع لوحة 24 بئرا مرة أخرى في الحاضنة لمدة 45 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ورطوبة 95٪، مع 5٪ CO2.
  5. خلال هذا الحضانة، وإعداد aliquot من DMEM - Ab (القسم 2) ببساطة عن طريق إزالة 25 مل من DMEM -Ab ووضعه في أنبوب الصقر 50 مل (أو ما يعادلها).
  6. إضافة جنتاميسين إلى 25 مل DMEM -Ab aliquot إلى تركيز 15 ميكروغرام /مل (7.5 أول من محلول الأسهم 50 ملغم/مل). ضع محلول DMEM -Ab +Gent في حمام مائي 37 درجة مئوية طوال فترة الحضانة التي تستغرق 45 دقيقة.
  7. Aliquot 25 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب الصقر 50 مل ومكان في حمام الماء 37 درجة مئوية خلال الحضانة 45 دقيقة.
  8. بعد اكتمال الحضانة لمدة 45 دقيقة، قم بإزالة لوحة 24 جيدا ووضعها في غطاء محرك السيارة. إزالة الوسائط التي تحتوي على البكتيريا من كل بئر عن طريق فراغ الطموح، وتغيير نصائح ماصة الزجاج بين سلالات مختلفة.
  9. إضافة ما يقرب من 1 مل من برنامج تلفزيوني إلى كل بئر من أجل غسل البكتيريا فضفاضة الملتصقة من سطح الخلايا، ثم إزالة برنامج تلفزيوني باستخدام فراغ الطموح.
  10. بعد إزالة كاملة من برنامج تلفزيوني، إضافة 1 مل من DMEM -Ab + جنت إلى كل بئر. فإن gentamicin قتل فقط تلك البكتيريا التي تبقى خارج الخلايا، وبالتالي تلك التي هي داخل الخلايا ستبقى قابلة للحياة.
  11. ضع اللوحة ذات ال 24 بئرا مرة أخرى في الحاضنة واتركها تحتضنها لمدة ساعة إضافية.
  12. خلال فترة حضانة ساعة طويلة، وإعداد 14 مل أنابيب البولي بروبلين بإضافة 1 مل من ddHالعقيمة 20 إلى كل أنبوب. وسوف تكون هناك حاجة أنبوب واحد لكل coverslip، لذلك لوحة واحدة 24 جيدا، وإعداد 24 أنابيب المجموع.
  13. بعد ساعة حضانة طويلة، وإزالة لوحة 24 جيدا من الحاضنة ووضعها في غطاء محرك السيارة، جنبا إلى جنب مع أنابيب أعدت في الخطوة 5.12.
  14. باستخدام ملاقط معقمة، قم بإزالة كل غطاء من بئره وضعه على الفور في أنبوب فردي. تأكد من تراجع الملاقط في الإيثانول واللهب لهم بين كل coverslip من أجل منع التلوث.
  15. بعد إزالة جميع الأغطية ووضعها في أنابيب فردية ، تجاهل لوحة 24 بئرا.
  16. العودة إلى مقاعد البدلاء ودوامة كل أنبوب لمدة 5-10 ثانية.
  17. إزالة جزء من كل أنبوب ووضع كل عينة في بئر فردية من لوحة 96 بئر، ثم تمييع كل عينة بشكل متسلسل باستخدام 1:10 التخفيف تصل إلى تخفيف 1:1،000.
  18. باستخدام لوحات LB prewarmed والجافة، لوحة بقعة كل من سلسلة التخفيف على لوحات أجار. يمكن استخدام ماصة متعددة القنوات للوحة بقع 5-10 ميكرولتر من سلسلة تخفيف كل عينة.
  19. أيضا إزالة عينات 20 ميكرولتر من كل بئر غير مخفف ولوحة بقعة هذا المبلغ مباشرة على LB أجار على لوحة منفصلة من سلسلة التخفيف. (يمكن استخدام هذا الحجم الأكبر لتعداد السلالات الغازية الضعيفة).
  20. بعد أن تكون جميع العينات مطلية على الفور ، تجاهل أنابيب 14 مل التي تحتوي على الأغطية. Parafilm لوحة 96 جيدا ووضعه في مربع التجميد في -80 درجة مئوية لإعادة الصياغة، إذا لزم الأمر.
  21. السماح للبقع لتجف تماما. يتم تسريع هذه العملية إلى حد كبير عن طريق وضع لوحات في غطاء محرك السيارة وإزالة الأغطية.
  22. بعد أن تجف البقع، ضع اللوحات في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  23. في صباح اليوم التالي، عد عدد المستعمرات في كل بقعة من سلسلة التخفيف التي يمكن تقييم أرقام المستعمرة بسهولة (بين ما يقرب من 5 و 50 مستعمرة) (الشكل 1)، واستخدام السلسلة لحساب عدد البكتيريا لكل غطاء لكل سلالة تم تقييمها.

6. إعداد سلالات من L. monocytogenes لالتهابات الماوس

  1. في الليلة السابقة للعدوى، استخدم حلقة معقمة لإزالة مستعمرات واحدة من السلالات المطلوبة وتطعيم كل منها في أنابيب فردية 14 مل تحتوي على 2 مل من مرق BHI.
  2. ضع الأنابيب الملقحة في حاضنة 37 درجة مئوية مائلة عند 45 درجة واحتضنها بشكل ثابت (دون اهتزاز) بين عشية وضحاها.
  3. في صباح اليوم التالي، قم بإزالة أنبوب الثقافة من الحاضنة والدوامة لفترة وجيزة لضمان تعليق موحد للبكتيريا.
  4. قياس الكثافة البصرية للثقافة باستخدام مطياف في الطول الموجي 600 نانومتر. تأكد من صفر الطيف الضوئي باستخدام مرق BHI معقمة قبل قراءة الكثافة البصرية. (بالنسبة ل. أحادية السيتوجينات، ترتبط الكثافة البصرية مباشرة بتركيز البكتيريا لكل مل ، بحيث تكون الكثافة 1.000 = 1.0 × 109 CFU لكل مل)
  5. حساب كمية الثقافة اللازمة لتصيب كل. الحقن تحتوي عادة على 200 ميكروغرام من برنامج تلفزيوني مع 10،000 CFU من سلالة فردية، وهو ما يترجم إلى التركيز المطلوب من 5.00 × 104 CFU /ml.
  6. إزالة aliquot 5 ميكرولتر من كل تخفيف النهائي وانتشار لوحة مباشرة على أجار LB.  احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية لتأكيد التركيز المستخدم للتلقيح.
  7. حقن كل تعليق CFU في غضون 1 ساعة من التخفيف (انظر أدناه).

7. تلقيح L. monocytogenes في الفئران عن طريق حقن الوريد الذيل وتقييم العبء البكتيري داخل الكبد, الطحال, والقلب

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الأعمال الحيوانية وفقا لإرشادات CDC للسلامة البيولوجية من المستوى 2.  وعادة ما يطلب الفئران قبل أسبوع واحد وحبسها مع 5 في القفص الواحد. يسمح للفئران بالتأقلم مع البيئة المختبرية الجديدة لمدة أربعة أيام قبل الحقن. استخدمت هذه التجارب فئران سويسرية ويبستر تبلغ من العمر 6-8 أسابيع كانت تؤوي 5 إلى قفص في بيئة حاجزة وتغذي نظاما غذائيا غير مقيد.

  1. إعداد قفص واحد من الفئران في وقت واحد عن طريق إزالة الغطاء وصناديق الطعام / الماء، ووضع القفص تحت مصباح الحرارة لمدة خمس دقائق. تسمح هذه العملية لتوسع الأوردة الذيلية ، مما يجعل الحقن أسهل في الأداء.
  2. إزالة واحد ووضعه في تسخير (أو أنبوب الصقر مع قطع نهاية) من أجل كبح جماح الحيوان أثناء الحقن.
  3. تنظيف موقع الحقن باستخدام وسادة الكحول، والسماح للكحول لتتبخر. هذا لا يطهر الموقع فحسب ، بل يوسع أيضا وريد الذيل.
  4. باستخدام حقنة 1 مل مجهزة بإبرة قياس 27.5 ، قم بحقن الماوس بلطف مع 200 ميكرولتر من الثقافة المطلوبة في الوريد الذيل.
  5. استخدام شاش لوقف أي نزيف التي قد تحدث نتيجة للحقن، ووضع الحيوان في قفص جديد.
  6. كرر هذه العملية للحيوانات المتبقية والسلالات. تأكد من تسمية كل قفص من الحيوانات مع سلالة أنها تلقت.
  7. تحقق من الحيوانات يوميا، وإزالة والتضحية بأي الحيوانات التي يبدو أنها في حالة مرضى.  إذا لم تظهر على أي علامات المرض، اسمح للعدوى بالمضي قدما لمدة 72 ساعة قبل التضحية بجميع الحيوانات.
  8. للتضحية، استخدم ثاني أكسيد الكربونالتخدير من مصدر المعبأة في زجاجات حتى توقفت جميع التنفس، ثم استخدام خلع عنق الرحم من أجل ضمان أن الحيوان ميت.
  9. بعد التضحية، نقل الحيوانات إلى غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة لتشريح.
  10. باستخدام كتلة تشريح، دبوس كل ساق من الحيوان مع إبر قياس كبير ورش الحيوان مع الإيثانول 70٪ حتى انها مشبعة.
  11. قطع الجلد من البطن والصدر مرة أخرى باستخدام شق على شكل Y التي تمتد من فتح المهبل تصل إلى عملية xiphoid، والتقدم ثم تصل إلى محور كل ذراع.
  12. سحب الجلد وإزالة الإبر من كل ساق لعقد تشريح مفتوحة.
  13. قطع بلطف من خلال الصفاق، وفضح الأمعاء والمعدة والكبد والطحال.
  14. عن طريق قطع الوريد الكبدي والرباط التاجي في الجزء العلوي من الكبد، والبدء في إزالة الكبد. توجد أربطة إضافية يجب إزالتها تحت الكبد ، وتربطها بالقسم الأول من الأمعاء الدقيقة ، وكذلك بعضلات الظهر.
  15. ضع الكبد في 5 مل من ddH2 0العقيمة في أنبوب الصقر 50 مل.
  16. بعد ذلك، قم بإزالة الطحال عن طريق عزله وقطع الأوعية والأربطة بلطف. سيتم إزالة الطحال بسهولة أكبر من الكبد. ضع الطحال في أنبوب صقر منفصل يحتوي على 5 مل من ddH2 0معقم.
  17. حدد موقع الحجاب الحاجز وقطع بلطف على طول القفص الصدري من أجل تصور الصدر. قطع من خلال عملية xiphoid والقص إلى مستوى الرقبة من أجل فتح الصدر، وفضح القلب والرئتين.
  18. باستخدام ملقط، والاستيلاء على القلب بلطف من قبل ذروته، ورفعه بحيث الشريان الأورطي والأوعية الرئوية في التوتر. قطع هذه الأوعية لتحرير القلب.
  19. ضع القلب في أنبوب فالكون 50 مل يحتوي على 5 مل من ddH2 0معقم.
  20. تجاهل جثة الماوس، وتكرار هذه العملية لكل حيوان، وذلك باستخدام أنابيب الصقر نظيفة تحتوي على 5 مل ddH عقيمة20 لكل جهاز إزالتها.
  21. بعد إزالة جميع الأعضاء، قم بتنظيف محطة العمل والعودة إلى مقاعد البدلاء.
  22. إعداد مجموعة من 5 أنابيب لاستخدامها لتنظيف وتعقيم المتجانس لكل مجموعة من الأجهزة من خمسة فئران (أي أنبوب واحد 5 مجموعة ل5 كبد، 5 أنابيب ل5 الطحال، و 5 أنابيب لقلوب 5). أربعة من كل من أنابيب ينبغي أن تملأ مع 30 مل ddH2 0معقمة، وينبغي ملء واحد مع 30 مل 90٪ EtOH.
  23. باستخدام TissueMaster (أو ما يعادلها من التجانس) ، تراجع المتجانس (أثناء التشغيل) في الأنابيب المعدة في الخطوة 7.21 على النحو التالي لتنظيف المسبار:
  24. أنبوب 1 (ddH2O)
    5 ثوان في أنبوب 2 (ddH2O)
    5 ثوان في الأنبوب 3 (EtOH)
    5 ثوان في أنبوب 4 (ddH2O)
    5 ثوان في أنبوب 5 (ddH2O)
  25. تجانس كبد واحد باستخدام المتجانس لمدة 2 دقيقة على الأقل ، أو حتى لا تبقى أجزاء مرئية من الجهاز. استخدام ملاقط لإزالة أي حطام كبير من المسبار.
  26. كرر عملية التنظيف الموضحة في الخطوة 7.22
  27. كرر عملية التجانس للكبد الأخرى، مع التأكد من غسل المسبار بين كل كبد باستخدام العملية الموضحة في الخطوة 7.22.
  28. بعد أن تكون جميع الكبد متجانسة تماما ، تجاهل أنابيب الغسيل (1-5) للكبد.
  29. كرر عملية التجانس / نظيفة لكل من الطحال والقلوب كذلك، مع التأكد من استخدام مجموعة جديدة من أنابيب الغسيل لكل سلسلة من الأجهزة. إذا أصبحت أنابيب الغسيل عكرة في أي وقت، فتخلص منها واستبدلها بأنابيب جديدة لإنهاء السلسلة.
  30. بعد أن تم تجانس جميع الأعضاء ، قم بدورة تنظيف أخيرة على المتجانس وجففها جيدا للتخزين.
  31. ضع ما يقرب من 200 ميكرولتر من كل عضو في بئر فردي من لوحة 96 بئرا.
  32. إجراء تخفيفات متسلسلة على عينات الأعضاء عن طريق تخفيف 1:10 في سلسلة تصل إلى تخفيف 1:10،000 (الكبد والطحال) أو ما يصل إلى تخفيف 1:1،000 (القلب).
  33. لوحة بقعة سلسلة التخفيف على أجار LB مسبقا الدافئة. أيضا إزالة 20 ul من كل جهاز غير مخفف ولوحة على لوحات أجار LB منفصلة من أجل تعداد CFU من الأعضاء المستعمرة بشكل سيئ.
  34. تجاهل أنابيب الصقر التي تحتوي على الأعضاء المتجانسة، والتفاف لوحات 96 جيدا تحتوي على سلسلة التخفيف مع البارافيلم ووضعه في مربع التجميد في -80 درجة مئوية.
  35. السماح للبقع لتجف. يتم تسريع هذه العملية عن طريق وضع لوحات في غطاء محرك السيارة وإزالة الأغطية.
  36. بعد أن تجف البقع، ضع اللوحات في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  37. عد عدد المستعمرات في كل بقعة في صباح اليوم التالي واستخدام سلسلة التخفيف لحساب العدد الإجمالي للبكتيريا لكل عضو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

إن عزلات مختارة من أحاديات الخلايا L. تظهر غزوا معززا لخلايا القلب في ثقافة الخلايا وفي نماذج الماوس للعدوى. ويبين الشكل 1 مثالا على كيفية ظهور المستعمرات البكتيرية بعد طلاء بقعة من تعليق على وسائل الإعلام أجار. تسمح هذه الطريقة بتقييم دقيق ل CFUs داخل العينة دون استخدام أعداد كبيرة من لوحات وسائط أجار. ويبين الشكل 2 مثالا على إجراء فحص قائم على زراعة الأنسجة يقارن قدرة السلالة 10403S على غزو خلايا القلب مع قدرة السلالة 07PF0776. يمكن استرداد أكثر من ضعف عدد 07PF0776 البكتيري CF...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

L. monocytogenes هو مسببات الأمراض البشرية واسعة الانتشار وتتميز بشكل جيد، وقادرة على التسبب في عدد من مظاهر المرض المختلفة15. وقد وصفت البكتيريا في وقت سابق لقدرتها على نقل عبر الحواجز، مثل حاجز الدم في الدماغ وحواجز المشيمة والجنين، من أجل الوصول واستعمار الجهاز العصبي المركزي والجنين النامية، على التوالي. غالبا ما تكمل قدرة الكائن الحي على استعمار هذه الأنسجة بقدرة في المختبر على غزو الخلايا التمثيلية في الثقافة التي تشكل الأعضاء المستهدفة. على سبيل المثال ، ارتبط غزو الخلايا الظه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يبلغ المؤلفان عن وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل منح دائرة الصحة العامة منظمة العفو الدولية 41816 وAI099339 (N.E.F.) وF31AI094886-01 (P.D.M.) من المعهد الوطني للتنمية الدولية. وتقع المحتويات على عاتق المؤلفين فقط ولا تمثل بالضرورة الآراء الرسمية لمصادر التمويل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DifcoBHI Broth Base2372002 كجم من مسحوق تسريب القلب للدماغ (بدون أجار)
DifcoAgar2145102 كجم من حبيبات أجار
DifcoBHI Agar2418102 كجم من مسحوق تسريب قلب الدماغ مع 7.5٪ أجار
في vitrogenLB مرق القاعدة12975-0842 كجم من مسحوق قاعدة مرق لوريا (بدون أجار)
فيشرجلاس أغطية12-545-80أغطية زجاجية مقاس 12 مم Falcon
24-well لوحة زراعة الأنسجة35-304724 بئر ، لوحة زراعة الأنسجة المعالجة بالبلازما
Falcon14 مل أنبوب البوليسترين35205114 مل أنابيب البوليسترين
Falcon96-well U-bottom الصفيحة35-3077غير مزرعة الأنسجة المعالجة 96 بئر
لوحة Corning0.05٪ تريبسين ، 0.53 ملي مولار EDTA (1X)25-052-CIمحلول مخزون التربسين EDTA لزراعة الأنسجة
CorningDMEM (نسبة عالية من الجلوكوز ، البيروفات العالي)15-013-CUDMEM الوسائط بدون FBS أو الجلوتامين أو المضادات الحيوية
CorningPen / Strep / Glut Solution30-009-CIخليط مخزون من البنسلين والستربتومايسين و L-glutamine لزراعة الأنسجة
CorningGentamicin30-005-CR50 مجم / مل محلول مخزون من الجنتاميسين لزراعة الأنسجة
Cellgro (Corning)L-Glutamine25005197Stock محلول L-glutamine بدون مضادات حيوية
Denville75cm ^ 2 قارورةT122575 سم 2< / sup> قارورة معالجة لزراعة
الأنسجة دنفيل1.5 مل أنابيب الطرد المركزي20130041.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيق
ATCCH9c2 القلب الأرومات العضليةCRL-1446الأرومات العضلية القلبية للفئران مصل
هيكلونالجنين البقريSH30070.63مصل الأبقار الجنيني
الدقيقة

المراجع

  1. Freitag, N. E. From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression. Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).
  2. Drevets, D. A., Bronze, M. S. Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion. FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).
  3. Farber, J. M., Peterkin, P. I. Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen. Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).
  4. Lecuit, M. Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers. Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).
  5. Lecuit, M. Human listeriosis and animal models. Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).
  6. Bou Ghanem, E. N., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathog. 8, e1003015(2012).
  7. Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs. Infect Immun. 80, 720-732 (2012).
  8. Alonzo, F. 3rd, Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells. J Med Microbiol. , (2011).
  9. Adler, A., et al. Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection. J Infect. 58, 161-163 (2009).
  10. Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature. Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).
  11. Brouqui, P., Raoult, D. Endocarditis due to rare and fastidious bacteria. Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).
  12. Brusch, J. L. Cardiac infections in the immunosuppressed patient. Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).
  13. McCue, M. J., Moore, E. E. Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct. Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).
  14. Menard, C., et al. Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells. J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).
  15. Czuprynski, C. J. Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science. Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).
  16. Grundler, T., et al. The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).
  17. Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes. PLoS Pathog. 7, e1002005(2011).
  18. Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).
  19. McMullen, P. D., et al. Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain. J Bacteriol. 194, 3552(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

زراعة الأنسجةنموذج فأرمقايسة الحماية بالجنتاميسينطريقة التبزيغ النقطيالحقن في وريد الذيلتجنيس الأعضاء
تقييم الغزو البكتيري لخلايا القلب في الثقافة والاستعمار القلب في الفئران المصابة باستخدام monocytogenes الليستيريا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.