مقالة منهجية

تحديد غشاء طوبولوجيا البروتين عن طريق الإسفار البروتياز الحماية (FPP)

DOI:

10.3791/52509

⸱

أبريل 20, 2015

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Chicago Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا لتحديد اتجاه وطوبولوجيا بروتينات الغشاء المتكاملة في الخلايا الحية. يعتمد هذا البروتوكول البسيط على حساسية البروتياز الانتقائية للوهم بين البروتين المعني و GFP.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الطوبولوجيا الصحيحة وتوجيهها لبروتينات الغشاء المتكاملة ضروريين لوظيفتها الصحيحة ، ومع ذلك لم يتم إنشاء مثل هذه المعلومات للعديد من بروتينات الغشاء. يتم تقديم تقنية بسيطة تسمى حماية البروتياز الفلوري (FPP) ، والتي تسمح بتحديد طوبولوجيا البروتين الغشائي في الخلايا الحية. تتمتع هذه التقنية بمزايا عديدة مقارنة بالطرق الأخرى لتحديد طوبولوجيا البروتين ، حيث أنها لا تتطلب توافر أجسام مضادة متعددة ضد مجالات مختلفة من بروتين الغشاء ، ولا تتطلب كميات كبيرة من البروتين ، ويمكن إجراؤها على الخلايا الحية. تستخدم طريقة FPP الإجراءات المحصورة مكانيا للبروتياز على تدهور بروتينات الغشاء الموسومة بالبروتين الفلوري الأخضر (GFP) لتحديد طوبولوجيا الغشاء واتجاهها. ينطبق هذا النهج البسيط على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، ويمكن استخدامه لتحديد اتجاه البروتين الغشائي في عضيات مختلفة تحت الخلوية مثل الميتوكوندريا ، جولجي ، الشبكة الإندوبلازمية ومكونات نظام التدوير. يتم التعبير عن بروتينات الغشاء ، الموسومة إما على N-termini أو C-termini مع اندماج GFP ، في خلية ذات أهمية ، والتي تخضع للنفاذية الانتقائية باستخدام ديجيتونين المنظف. الديجيتونين لديه القدرة على اختراق غشاء البلازما ، مع ترك العضيات داخل الخلايا سليمة. يمكن أن تتحلل شقوق GFP المعرضة للعزل الخلوي بشكل انتقائي من خلال تطبيق البروتياز ، في حين أن شقوق GFP الموجودة في تجويف العضيات محمية من البروتياز وتظل سليمة. اختبار FPP مباشر ، ويمكن الحصول على النتائج بسرعة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أغشية البلازما، فضلا عن العديد من الأغشية داخل الخلايا، بمثابة الحواجز التي تفصل اثنين من مقصورات المائية. في حالة غشاء البلازما، والفصل هو بين الخارج والداخل من الخلية؛ لعضيات داخل الخلايا ومن بين السيتوبلازم والتجويف عضية. على سبيل المثال، غشاء الشبكة الإندوبلازمية (ER) يفصل بيئة المؤكسدة داخل تجويف ER من عصاري خلوي خفض البيئة 1. ويتم تخليق البروتينات الغشاء على ريبوسوم المرتبط ER، وتحقيق طوبولوجيا النهائي داخل غشاء ER 2. الاستيلاء على التوجه غشاء المناسب وطوبولوجيا للبروتينات هو أمر حاسم لوظيفتها الطبيعية. طوبولوجيا الصحيح يسمح المجالات ذات الصلة للبروتينات غشاء للتفاعل مع الشركاء ملزمة لها، لأنها تتيح التعديلات بعد متعدية حاسمة لتحدث، وذلك في حالة من البروتينات غشاء البلازما، بما يسمح للخلية للتفاعل مع ويستجيب رس بيئته. لنقدر تماما وظيفة بروتين الغشاء، لا بد من الواضح أن تعرف كيف يتم توجيه هذا البروتين فيما يتعلق غشاء من خلاله أنه يقيم، أي طوبولوجيا غشاء لها. بالإضافة إلى اكتساب المعرفة العلمية الأساسية، فهم طوبولوجيا من بروتين الغشاء والتي يتعرض لها جوانب سطح البروتين لبيئات مختلفة ميزت الآثار السريرية منذ تتكون البروتينات الغشاء غالبية أهداف الدوائية 3. حتى وقت قريب، يقترب إلى تحديد بروتين الغشاء طوبولوجيا كان يتطلب استثمارات كبيرة في الوقت والمال أو كان يتطلب الكواشف التي يصعب الحصول عليها.

على حد سواء قد استخدمت النهج التجريبية وفي سيليكون لتحديد طوبولوجيا غشاء البروتينات المقيمين داخل غشاء البلازما. منذ التنبؤات الأولى من المجالات الغشاء الذي يمتد على أساس للا مائية تقييمها من indiviالأحماض الأمينية المزدوجة 3، والعديد من خوارزميات التنبؤ متوفرة الآن على شبكة الإنترنت، وببساطة تتطلب معرفة تسلسل الأحماض الأمينية والبروتين. ومع ذلك، غالبا ما تكون الافتراضات المركزية لمثل هذه البرامج النمذجة، والافتراضات التي يمكن أن تؤدي إلى مهام غير صحيحة طوبولوجيا 4،5. وعلاوة على ذلك، في حين يمكن لهذه التنبؤات القائمة على الحاسوب بتعيين مبدئيا المناطق التي تغطي الغشاء، أنها لا تحدد دائما ما إذا كان الأمينية أو مصطلحات كربوكسي البروتينات هي في السيتوبلازم، التجويف عضية أو الخارجي الخلية. حتى مع زيادة القوة الحسابية، واستخدام آلة التعلم خوارزميات 6، مثل هذه البيانات لا تزال نموذجا، ويجب التحقق من صحة باستخدام البيانات التي حصل عليها تجريبيا. تم إجراء تقرير التجريبي المباشر للطوبولوجيا الغشاء باستخدام لوحات من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مع الحواتم المعروف توزع في جميع أنحاء البروتين، حيث أحرز تقييم مناعية، قبل وبعد permeabilization الخلية. هذاالنهج يتطلب مجموعة من الأجسام المضادة، التي قد لا تكون متاحة للبروتين من الفائدة.

استراتيجية بديلة هو مهندس علامات حاتمة مثل MYC أو هيماغلوتينين (HA) في مواقع مختلفة في جميع أنحاء البروتين، ثم مرة أخرى عن طريق تحديد مناعية قبل وبعد permeabilization الغشاء. بالإضافة إلى علامات المناعية، كلها قد استخدمت علامات الأنزيمية (بما في ذلك الفوسفاتيز القلوية، β -galactosidase، أو β -lactamase) والتعديلات الكيميائية مثل مسح السيستين لتحديد بروتين الغشاء طوبولوجيا 7،8. طريقة إضافية تستخدم لرسم الخرائط الطوبوغرافية للبروتينات غشاء البلازما يعتمد على مقاربة مختلفة قليلا إلى علامات حاتمة. في هذه الطريقة تسلسل العلامة هو N-ربط تسلسل إجماع بالغليكوزيل NXS / T. منذ بالغليكوزيل يحدث فقط عندما مثل هذا التسلسل هو موجود في تجويف مسار السكروز، فإن وجود علامة في اللمعية مقابلويلاحظ حجرة عصاري خلوي بسهولة كما تحول الشامل على المواد الهلامية SDS-PAGE. وقد تم تطبيق هذا النهج إلى multispanning القناة الايونية CFTR 9. في حين استخدمت كل هذه الأساليب، فمن الواضح أنهم جميعا تتطلب استثمارات كبيرة في مجال البيولوجيا الجزيئية لتوليد وتسلسل بنيات متعددة.

لتحديد المعلومات الطوبوغرافية المتعلقة البروتينات عبر الغشاء الموجود داخل عضيات داخل الخلايا وقد ثبت أن أكثر تحديا. تطبيق التكنولوجيات القائمة مضان ومع ذلك، جعلت تحديد الغشاء طوبولوجيا أبسط كثيرا. تقنية ثنائي الجزيء تكامل مضان (BiFC) تعتمد على التفاعل بين اثنين من شظايا غير الفلورية من بروتين فلوري، واستعادة خصائص الفلورسنت من أن البروتين 10. على الرغم من وصف في البداية لتحديد تفاعلات البروتين البروتين في الجسم الحي 10، كما تم استخدام هذا النهجلتحديد بروتين الغشاء طوبولوجيا في الخلايا النباتية 11. ولكن هذا النهج هو أيضا الوقت المكثف لأنه يتطلب الجيل ليس فقط من البروتينات الانصهار مع بروتين من الفائدة ولكن أيضا مجموعة متنوعة من البروتينات الانصهار تستهدف العصارة الخلوية أو عضية التجويف، ويتطلب المعرفة التي بين الخلايا الأغشية البروتين من الفائدة تكمن في .

وقد وصفت نهج بديل أبسط لتحديد بروتين الغشاء طوبولوجيا 12. الفحص، الإسفار البروتياز الحماية (FPP) يتطلب توليد البروتين الانصهار بين GFP والجينات في المصالح. ويستند هذا النهج على إمكانية الوصول النسبي للالبروتياز غير محددة لشاردة GFP. اعتمادا على ما إذا GFP محمي من التحلل البروتيني من قبل المقيمين في لمعة من العضيات داخل الخلايا أو يتعرض لالتحلل البروتيني من خلال كونها موجودة في العصارة الخلوية. وهكذا، إذا شاردة GFP على البروتين من الفائدة تواجه السيتوبلازم، فانها ستكون معرضة لنشاط الأنزيم البروتيني وإشارة مضان خسر. على العكس، إذا شاردة GFP على البروتين من الفائدة تواجه بيئة 'محمية' من البروتيني (مثل التجويف جولجي) ثم فإن إشارة مضان تستمر.

للسماح البروتياز لدخول الخلية، ولكن لا تدخل مقصورات غشاء الخلايا ويستخدم الكوليسترول ملزمة ديجيتونين المخدرات. الكولسترول هو ستيرول المهيمن في الفقاريات، وإثراء تحديدا في غشاء البلازما نسبة إلى المقصورات داخل الخلايا. السم غليكوزيدات، ديجيتونين، يستخرج من نبات الديجيتال الأرجواني. ديجيتونين يتعاطف مع الكولسترول أغشية الغنية، حيث أنه يؤدي إلى غشاء انتقائي permeabiliztion 14،16 (الشكل 1). بالإضافة إلى السماح بخروج عناصر عصاري خلوي صغيرة، يسمح permeabilization ديجيتونين أيضا دخول جزيئات الخارجية، مثل K بروتين أو التربسين. بروتوكول FPP يستفيد من القوات المسلحة الكونغوليةر التي تحتوي على غشاء البلازما تصل إلى 80٪ من الكولسترول الخلوي 17، في حين العضيات الأخرى، مثل ER، جولجي، الإندوسومات، الميتوكوندريا، والتي تحتوي على محتوى الكولسترول منخفض جدا، لا تزال سليمة 14. وقد لوحظ إدراج الانتقائي للالكولسترول في غشاء البلازما في العديد من الخلايا حقيقية النواة، السماح باستخدام تعتمد على ديجيتونين permeabilization غشاء البلازما في مثل هذه الأنواع حقيقية النواة متنوعة مثل S. الخباز لالبشري 14،18. يوفر الفحص FPP وسيلة بسيطة وسريعة وقوية نسبيا من تحديد (أ) ما إذا كان البروتين هو غشاء ملزمة / اسوشيتد أو إنتشاري بحرية في العصارة الخلوية و (ب) والذي المجال من البروتين غشاء يواجه العصارة الخلوية أو عضية التجويف. يجب أن بروتين الغشاء لديها توجهات متعددة، فإن إشارة تنشأ من النموذج المهيمن، ولن يتم الكشف عن أشكال طفيفة. في حين يمكن أن يكون هناك بعض القلق من أن إضافة شاردة GFP للبروتين على الفائدة قد تؤثر على وظيفة، و/ أو توطين التحت خلوية، وهذا هو في الواقع أكثر من النظري الفعلية. في الواقع العديد من الدراسات قد أظهرت بوضوح أن العلامة GFP لا يغير خصائص البروتين 19،20.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الجيل والتحقق من الوهم بروتين فلوري

  1. إلحاق البروتين الفلوري الأخضر (GFP) إلى الأمينية أو الكربوكسيل مصطلحات من البروتين ذات الاهتمام باستخدام استراتيجيات الحمض النووي المؤتلف القياسية 13.
    ملاحظة: على الرغم من أننا قد استخدمت على نطاق واسع GFP، متغيرات أخرى مثل البروتين سماوي نيون (CFP)، والأصفر البروتين الفلوري (YFP)، DsRed وmCherry يمكن استخدام. يجري باستمرار تحسينات في fluorophore للطي الكفاءة والسطوع وصمود، ويجب أن المحققين الاستفادة من أحدث البنى جيل.
    1. تأكيد تسلسل DNA الصحيح والتأكد من أن شاردة GFP هي في الإطار مع البروتين من الفائدة. أداء التسلسل باستخدام استراتيجيات الحمض النووي المؤتلف القياسية 21.
      ملاحظة: العديد من المؤسسات لديها مرافق DNA الأساسية، التي شجعت المحقق في الاتصال للحصول على معلومات إضافية.
    2. للبروتينات غشاء تمريرة واحدة أو مزدوجة، وتوليدكلا الإصدارين محطة جذر الأمينو والكربوكسيل من البروتينات الانصهار 19.
    3. للبروتينات والتي تمتد متعددة إدراج GFP داخل حلقات extramembrane المفترضة، فضلا عن مصطلحات. عناية خاصة عند إنشاء الوهم عبر الغشاء مع انصهار بروتين فلوري تعلق على محطة الأمينية من البروتين الهدف وغالبا ما المشقوق متواليات إشارة من التحلل البروتيني مرة واحدة وقد مرت البروتين من خلال translocon ER.
    4. في حالة تسلسل إشارة موجودة، إدراج البروتين الفلوري الانصهار القاصي الى الموقع الانقسام وذلك لتوليد البروتين ناضجة تحتوي على الأمينية محطة بروتين فلوري الموسومة سليمة. توظيف استراتيجيات الدنا القياسية لتوليد الوهم 21.
  2. تحديد وجود ما يكفي من إشارة الفلورسنت المترجمة بشكل مناسب في خط خلية من الفائدة.
    1. مراقبة الخلايا تحت المجهر epifluorescence باستخدام مضان لا يتجزأ من GFP تحت appropriأكل مرشح تضع شروطا. لمجموعات مرشح GFP التي تشمل 510-560 نانومتر، تأكد من أن يتم استخدام مرشحات الصحيحة لfluorophore المستخدمة.
      ملاحظة: يتم تحقيق إشارة كافية عند تقييم بالعين تقدم إشارة قوية بما فيه الكفاية أن الهيكل الخلوي داخل التي تكمن في إشارة وحلها بسهولة فوق الخلفية. وبالإضافة إلى ذلك يجب أن يكون نمط تلطيخ من GFP البروتين يتسق مع أن من علامات لعضية المناسبة، ويفضل أن يكون متطابقة إلى أن من البروتين غير محدد الأصلي.
  3. تحديد ما إذا كان سيتم استخدام نهج ترنسفكأيشن مستقرة أو عابرة بناء على بروتين يجري تقييمها.
    ملاحظة: transfectants مستقرة تحمل عموما انخفاض مستويات التعبير من أنظمة عابرة. على الرغم من أن التعبير عابرة ينتج التعبير مستوى عال من البروتينات وشدة زيادة إشارة (~ 5-24 ساعة بعد ترنسفكأيشن اعتمادا على البروتين)، فإنه يمكن أن يؤدي أيضا إلى القطع الأثرية overexpression مثل البروتين aggregation أو تشبع البروتين استهداف الممرات، مما يؤدي إلى توطين التحت خلوية الخاطئ.

2. ترنسفكأيشن من خلايا والثقافة خلية

ملاحظة: مجموعة متنوعة من خلايا قابلة للتحليل FPP، بما في ذلك HEK293، هيلا، COS-7 والخلايا CHO 14. ويستند الوصف التالي على التعبير عن البروتينات في خلايا الغشاء HEK293.

  1. تنمو خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK293)، والطبقات الوحيدة ملتصقة في 6 مل من Dulbecco لتعديل النسور المتوسطة (DMEM)، على أن تستكمل مع المصل 5٪ بقري جنيني (FBS)، 1٪ البيروفات الصوديوم، و 250 ميكروغرام / مل البنسلين / الستربتومايسين على 37 درجة C مع 5٪ CO 2. أداء جميع الأعمال مع الخلايا في تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة. تنمو الخلايا في مستنبت حتى ~ 80٪ متكدسة في T-75 قارورة.
  2. خلايا بالنقل باستخدام أي معيار الكفاءة العالية، وانخفاض السمية طريقة ترنسفكأيشن، بما في ذلك lipid- والتكنولوجيات viral- أو القائم على Electroporation لللتوليد transienر أو التعبير مستقر. عادة 2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد في 1 × 10 6 خلايا يعطي جيد استنساخه التعبير البروتين. الحفاظ على خلايا ل5-48 ساعة في مناسبة وسائل الإعلام زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية في CO 2 قادرة حاضنة زراعة الأنسجة.
  3. مراقبة الخلايا للتعبير عن البروتين GFP الانصهار باستخدام المجهر epifluorescence، وذلك باستخدام إشارة مضان الجوهرية للGFP، وذلك باستخدام مجموعات مرشح المناسبة وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. إشارة مضان عادة تصل كحد أقصى في غضون 24-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن. استخدام الخلايا عندما تصل إشارة مضان أقصى مستوى. رصد مستويات البروتين التعبير من خلال تحليل طخة مناعية باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد أي من البروتين من الفائدة أو شاردة GFP.
  4. للخلايا لوحة تحليل التجريبية coverslips على المغلفة. عرض إما تحت تكوين الخلية الحية أو تثبيت التالية وجبل على الشرائح المجهر. خلايا لوحة لتحقيق 60٪ -80٪ ​​التقاء ضمن 24-48 ساعة.
    1. coverslips معطف مع حل بولي يسين (0.1 ملغ / مل)، بحيث يتم تغطية السطح بأكمله. احتضان لمدة 30 دقيقة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في درجة حرارة الغرفة، تليها 60 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية. إزالة الزائد بولي يسين وشطف لل coverslips في برنامج تلفزيوني 3 مرات.
    2. بدلا من ذلك، لوحة الخلايا على غرف غطاء من الزجاج يتكون من لوحات ثقافة الخلية مع أسفل الزجاج البصري للسماح التصوير المباشر مع الأهداف النفط الغمر. الإعداد المجهر الفعلي يعتمد على المعدات المتاحة للمحقق، ولكن ينبغي أن تكون قادرة على حل التغيرات السريعة. اعتمادا على نوع من الخلايا والخلايا الشكل، يجب أن تكون الخلايا حول 60-90٪ متكدسة في وقت الفحص FPP.

3. إعداد المجهر مضان

  1. استخدام الفتحة العددية (NA) هدف عالية للنفط غمر لجمع إشارة القصوى والقرار المكانية، مثل 60X، NA 1.42 هدف الغمر النفط. استخدام عشرالبريد التالية الليزر لتحفيز fluorophores: غاز الأرجون 488 نانومتر (GFP وYFP) و 561 الصمام الثنائي (RFP، mCherry).
  2. تحديد التعريض الضوئي، وزيادة والتقاط الأمثل معدل من الصور لكل بناء. ضبط كثافة الليزر وزمن التعرض لتقليل photobleaching من (راجع الخطوة 7.1.2).
  3. للدراسات باستخدام fluorophores متعددة (على سبيل المثال، علامة قابلة للذوبان لpermeabilization غشاء بالتنسيق مع غشاء البروتين علامة)، واختيار مرشح مناسب يحدد لتقليل إشارة عبر الحديث وتعظيم نسب الإشارة إلى الضوضاء.

4. إنشاء الظروف المثلى لغشاء البلازما Permeabilization

  1. إزالة مستنبت خلية من خلايا يعبر فقط عن البروتينات الفلورية القابلة للذوبان (مثل EGFP، DsRed). غسل الخلايا 3 مرات (1 دقيقة لكل منهما) في KHM عازلة (110 ملي خلات البوتاسيوم، 3 ملي MgCl 2 و 20 ملي HEPES-هيدروكسيد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.2). إجراء تجارب على خلايا وجميع الكواشف في درجة حرارة الغرفة.
  2. مكان الخلايا سن coverslips (انظر الخطوة 2.4) في المخزن KHM على مرحلة مضان المجهر وجمع الصورة الأولى، التي تمثل السيطرة "غير permeabilized" المرحلة.
  3. لpermeabilize انتقائي غشاء البلازما، إضافة ديجيتونين (30 ميكرومتر) في المخزن KHM إلى الخلايا. يروي الخلايا مع عازلة (عازلة + ديجيتونين) بمعدل 5 مل / دقيقة لل10-60 ثانية.
  4. تحديد تركيز ديجيتونين الأمثل تدريجيا عن طريق زيادة تركيز ديجيتونين. ويتحقق تركيز ديجيتونين الأمثل عندما يكون هناك فقدان كامل للإشارة مضان من EGFP للذوبان داخل 10-60 ثانية من تطبيق ديجيتونين. بالنسبة لكثير من خلايا تطبيق 10-50 ميكرومتر ديجيتونين يكفي لpermeabilize غشاء الخلية.
    1. للاستخدام في جميع التطبيقات أدنى تركيز ممكن من ديجيتونين. جمع الصور بعد ديجيتونين permeabilization للإشارة الخلفية permeabilized.
  5. تأكد من أن الوهم GFP البروتين من الفائدة هو الغشاء فيو tegrated بتأكيد الاحتفاظ الخلوي للإشارة مضان التالية permeabilization ديجيتونين من غشاء البلازما 16.
    1. إبداء عضية محددة البروتين الفلوري 23. بروتينات الميتوكوندريا تعمل بشكل جيد في هذا الصدد 16، على سبيل المثال، pDsRed2-ميتو النواقل. تحديد الظروف المثلى التعبير كما هو موضح في الخطوة 2.1.
    2. تأكد من أن تركيز ديجيتونين مناسب لنوع من الخلايا المستخدمة عن طريق ضمان أن مورفولوجية العضيات داخل الخلايا يبقى ثابتا على مدى فترات طويلة (تصل إلى 60 دقيقة) التعرض لديجيتونين.
      ملاحظة: استخدام البروتوكولات القياسية المناعي المجهري باستخدام الأجسام المضادة ضد مختلف مقصورات الخلوية، مثل الجسيمات الحالة (على سبيل المثال، LAMP1)، جولجي (على سبيل المثال، TGN38)، الشبكة الإندوبلازمية (على سبيل المثال، calnexin)، الإندوسومات (على سبيل المثال، Rab5)، الميتوكوندريا (على سبيل المثال، السيتوكروم ج). إذا عضية داخل الخلايا تغيرات مورفولوجية / سلامة اوفه بشكل كبيرص 60 دقيقة، فإنه من المرجح أن تركيز ديجيتونين كان مرتفعا للغاية، ويتطلب حدوث انخفاض في تركيز ديجيتونين و / أو وقت التعرض.
      ملاحظة: ديجيتونين سامة عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE).

5. البروتياز علاج نيون البروتينات

  1. غسل الخلايا في المخزن KHM ثم قم بإضافة البروتيني (بروتين K و 50 ميكروغرام / مل في المخزن KHM) مباشرة على الخلايا. يروي الخلايا بمعدل تدفق 5 مل / دقيقة باستخدام الجاذبية تغذية نظام نضح لحمام باستمرار التحضير.
    1. متجر الحلول في 50 مل المحاقن وأنابيب البولي ايثيلين إتصال خزانات مستقلة لمشعب مع منفذ واحد في الحمام (5 مل / دقيقة معدل التدفق). ضع ماصة شفط للحفاظ على ثابت (0.5 مل) حجم حمام وتحقيق التبادل حل عن طريق التحول يدويا بين الخزانات الارواء.
  2. جمع الصور لتحديد ما إذا كان فلورياستمرت إشارة escent أو يحط. خسارة من> 90٪ من كثافة إشارة أولية على 30-60 ثانية تتفق مع تدهور بروتين من الوهم GFP البروتين (انظر ممثل النتائج).
  3. إذا لوحظ أي تدهور إشارة مع بروتين K، عندما يتوقع هذه الخسارة، استبدال بروتين K حل مع التربسين (4-8 ملم) في المخزن KHM. إذا لزم الأمر، واستخدام خليط من بروتين K والتربسين. ليست هناك حاجة لإخماد نشاط الأنزيم البروتيني.

6. نهج بديل لالبلازما غشاء البروتينات مع المجالات الخارجية

  1. للبروتينات غشاء البلازما، وإجراء فحص للبروتينات الفلورسنت الخارجية الوهم قبل ديجيتونين permeabilization. غسل الخلايا coverslips على العازلة في KHM (5 مل / دقيقة × 3 دقيقة)، والتقاط صورة للعلاج قبل الأنزيم البروتيني وقياس ما قبل الأنزيم البروتيني إشارة مضان كما في الخطوة 7.
  2. كشف الخلايا لالبروتيني (بروتين K و 50 ميكروغرام / مل أو التربسين 4-8 ملم في المخزن KHM) في ركان غياب ديجيتونين التي كتبها perfusing الخلايا مع KHM وسائل الإعلام التي تحتوي على الأنزيم البروتيني (معدل تدفق 5 مل / دقيقة). جمع الصور من بروتين فلوري، لتحديد كيفية بسرعة يختفي إشارة أو كم من الوقت استمرت إشارة.
  3. قبل permeabilization ديجيتونين، ويشفي كل نشاط الأنزيم البروتيني، عن طريق غسل الخلايا ثلاث مرات (1 دقيقة لكل منهما) في الخلية سائل الإعلام والثقافة التي تحتوي على 10٪ مصل (FBS).
  4. غسل الخلايا عن طريق perfusing مع KHM عازلة (معدل التدفق من 5 مل / دقيقة) لمدة 2 دقيقة. الحصول على صورة ما قبل permeabilization. Permeabilize غشاء الخلية كما هو موضح في الخطوة 4.
  5. جمع الصور التالية الأنزيم البروتيني إضافة إلى ذلك كما هو موضح في الخطوة 5.

7. تحليل صورة

  1. استخدام مجهر مقلوب قادرة على "العيش خلية" التسجيل، الذي فقدان إشارة مضان يمكن رصدها في الوقت الحقيقي. للمراقبة المستمرة، وتوظيف المعلمات متطابقة (زمن التعرض، وزيادة وكثافة الليزر، الخ).
    1. تحديد والخبيرالمعلمات imental من خلال مراقبة إشارة مضان من GFP البروتين الفائدة في ظل ظروف السيطرة (أي KBH العازلة وحدها). ضبط إعدادات مكاسب، وكثافة الليزر والتعرض الوقت على المجهر يحركها الكمبيوتر لضمان عدم وجود أي خسائر ملموسة من كثافة إشارة على مدى فترة 10-20 دقيقة.
      ملاحظة: شدة الإشارة ليست قيمة مطلقة، ولكن على أساس نظام المجهر والإعدادات المتاحة لكل PI. رصد التغيرات في كثافة مضان النسبية.
  2. بدلا من ذلك، علاج الخلايا في مجموعة نقاط الوقت في ديجيتونين تليها الأنزيم البروتيني، وإصلاح الخلايا قبل تصاعد coverslips على للتصوير. تحديد نقاط زمنية وفقا للإجراءات في الخطوتين 4 و 5. للحصول على التحقيق الأولي تجريبيا، وبدء في 0، 30، 60، 120 و 300 بالإضافة آخر ثانية من ديجيتونين أو البروتيني.
    1. إصلاح الخلايا (20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) باستخدام كمية كافية من تثبيتي (3.7٪ امتصاص العرق في PBS) لغمر عشر بالكاملخلايا البريد.
    2. إخماد امتصاص العرق المتبقي قبل الشطف الخلايا مع PBS تحتوي على 20 ملي الجلايسين (3 × 5 دقائق).
    3. جبل coverslips عن طريق إزالة السائل الزائد من ساترة وعكس ساترة على 50 ميكرولتر وسائل الاعلام المتزايدة على المجهر الشرائح الزجاجية للتصوير. تسمح الشرائح لتجف بين عشية وضحاها قبل التصوير.
  3. جمع الصور مضان المجهر (تحت الفلاتر المناسبة يحدد متوافق مع fluorophore المستخدمة) باستخدام وظيفة التقاط صورة الفيديو على الكمبيوتر التي تسيطر عليها المجهر مضان.
  4. قياس شدة إشارة الفلورسنت بوصفها وظيفة من حالة الحضانة. الحصول على كثافة بكسل يعني داخل المنطقة ذات الاهتمام (ROI) ان يرفق خلية فردية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلازما غشاء Permeabilization

يتم تحديد كفاءة permeabilization غشاء البلازما عن طريق استخدام البروتينات الفلورية القابلة للذوبان (على سبيل المثال، GFP، DsRed) (الخطوة 4). هذه البروتينات، عندما أعرب في الخلايا، أحرار في نشر في العصارة الخلوية، وتضيع عند permeabilized غشاء البلازما باستخدام ديجيتونين (الشكل 2). واختفاء كامل للإشارة الفلورسنت يجب أن يحدث في غضون 10-60 ثانية من تطب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التوجه الصحيح وطوبولوجيا من بروتينات الغشاء أمر ضروري لوظيفتها المناسبة. وعلى الرغم من أهمية فهم بروتين الغشاء طوبولوجيا، هناك العديد من البروتينات التي مثل هذه البيانات غير موجودة تماما. يوفر FPP طريقة سهلة وفعالة لتحديد بروتين الغشاء طوبولوجيا، واحد التي يمكن القيام بها من قبل معظم المختبرات. النهج FPP يتيح مزايا هامة على الطرق السابقة لتحديد بروتين طوبولوجيا. على سبيل المثال، ليست هناك حاجة إلى وجود فريق من الأجسام المضادة الموجهة متعددة المجالات مرة أخرى مختلفة من البروتين من ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر المرفق الأساسي لتصوير الكالسيوم في CMS على مساعدتهم وتوجيههم في التقاط الصور وتحليلها. تم دعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (NIH) HL102208 إلى NAB. كان هذا النهج رائدا في الأصل من قبل هولجر لورينز وجنيفر ليبينكوت شوارتز في المعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DigitoninCalbiochem300410
Proteinase KSigmaP2308
TrypsinSigmaT3924
Cav1-GFPAddgene44433
pAcGFP-1 GolgiClontech632464
PolylysineSigmaP4707
تصاعد وسائل الإعلامداكوسي إس 704

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sevier, C. S., Kaiser, C. A. Formation and transfer of disulphide bonds in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).
  2. Brodsky, J. L., Skach, W. R. Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems. Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).
  3. Kyte, J., Doolittle, R. F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).
  4. Ott, C. M., Lingappa, V. R. Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict. J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).
  5. Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins. The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).
  6. Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method. Protein Eng. 10, 673-676 (1997).
  7. Geest, M., Lolkema, J. S. Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).
  8. Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis. Methods. 36, 148-171 (2005).
  9. Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion. J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).
  10. Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
  11. Zamyatnin, A. A., et al. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
  12. Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization. Nat Methods. 3, 205-210 (2006).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning. a Laboratory Manual. , 2nd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
  14. Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. Do you know the sex of your cells? American journal of physiology. Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).
  15. Wang, H., Brautigan, D. L. A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2. J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).
  16. Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2). Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).
  17. Tagawa, A., et al. Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters. J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).
  18. Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).
  19. Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Curr Biol. 5, 635-642 (1995).
  20. Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases. J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).
  21. Ben-Gedalya, T., et al. Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments. J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).
  22. Rogers, M., et al. Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system. J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).
  23. Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER. Traffic. 4, 491-501 (2003).
  24. Brandee, A. P., et al. Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).
  25. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GFP

مقالات ذات صلة