نحن هنا وصف الإجراء لتثبيط وظيفة الجينات في البعوض ناقلات الأمراض من خلال استخدام الشيتوزان / التدخل النانوية RNA التي يتم تناولها من قبل يرقات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الشيتوزان / التدخل RNA الجسيمات النانوية وساطة جين إسكات في الأمراض ناقل يرقات البعوض
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
البعوض الحامل للمرض إلحاق المزيد من المعاناة البشرية من أي كائن حي آخر - وتقتل أكثر من مليون شخص كل عام. مشاريع الجينوم البعوض سهلت البحث في جوانب جديدة من البعوض البيولوجيا، بما في ذلك الدراسات الجينية وظيفية في الابتدائي متجه الأفارقة الملاريا الأنوفيلة الغامبية وحمى الضنك والحمى الصفراء ناقلات الزاعجة المصرية. وقد استخدم RNA interference- (RNAi-) بوساطة إسكات الجينات لاستهداف الجينات في المصالح في كل من هذه الأنواع من البعوض ناقلات الأمراض. هنا، نحن تصف الإجراء لإعداد الشيتوزان / التدخل النانوية RNA التي يتم جنبا إلى جنب مع المواد الغذائية وتناولها من قبل يرقات. هذا واضحة من الناحية الفنية، الإنتاجية العالية، ومنهجية غير مكلفة نسبيا، والذي يتوافق مع طويلة RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الرنا المزدوج الجديلة) أو التدخل RNA (سيرنا) جزيئات صغيرة، وقد استخدمت لضربة قاضية ناجحة لعدد من الجينات المختلفة في A. الغامبية وA. الزاعجة المصريةاليرقات. وبعد الوجبات اليرقات، ضربة قاضية، والتي يتم التحقق منها من خلال QRT-PCR أو التهجين في الموقع، يمكن أن تستمر على الأقل خلال مرحلة العذراء في وقت متأخر. قد تكون هذه المنهجية تنطبق على مجموعة متنوعة واسعة من البعوض والحشرات الأخرى، بما في ذلك الآفات الزراعية، وكذلك الكائنات غير نموذج الأخرى. وبالإضافة إلى فائدتها في مختبر أبحاث، في المستقبل، الشيتوزان، وهو بوليمر غير مكلفة، وغير سامة وقابلة للتحلل، يحتمل أن تستخدم في هذا المجال.
المقدمة
البعوض التغذية ناقلات دماء أنوفيلي وAedine أجناس تنقل العوامل المسببة للمرض مسؤولة عن العديد من أسوأ الآفات البشرية. ما يقدر بنحو 3.4 مليار شخص معرضون لخطر الإصابة بالملاريا ل، وهو المسؤول عن أكثر من نصف مليون حالة وفاة سنويا في جميع أنحاء العالم. النتائج الملاريا من العدوى عن طريق المتصورة ليرة سورية. الطفيليات، والتي تنتقل إلى البشر من خلال لدغات البعوض الحامل للجنس الأنوفيليس، بما في ذلك ناقلات الأفارقة الرئيسي الأنوفيلة الغامبية ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ ، 2014) 1. الزاعجة المصرية هي البعوض الناقل الرئيسي لفيروس ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. أنواع البعوض وتربية
- الحفاظ A. الغامبية G3 وA. سلالات بعوض ليفربول IB12 (المستخدمة في الدراسات تمثيلية أدناه) أو سلالات أخرى من الفائدة وفقا للممارسة المختبر القياسية أو كما هو موضح سابقا 23،24.
2. الرنا المزدوج الجديلة وسيرنا التصميم والإنتاج
- الاشعال تصميم لبناء قوالب الرنا المزدوج الجديلة طويلة محددة لهذا الجين من الفائدة. استخدام أدا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
A. الغامبية:
تتشكل جزيئات الشيتوزان / الرنا المزدوج الجديلة بسبب التفاعل الكهربائي بين المجموعات الأمينية من الشيتوزان ومجموعات الفوسفات من الرنا المزدوج الجديلة. كفاءة الرنا المزدوج الجديلة إدماجها النانوية هي عادة فوق 90٪ مقاسا استنزاف الرنا المزدوج الجديلة من الحل. تظهر الصور مجهر القوة الذرية التي الشيتوزان-الرنا المزدوج الجديلة المتوسطات حجم الجسيمات 140 نانومتر في القطر، تترا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد استخدم / التدخل منهجية جسيمات متناهية الصغر RNA الشيتوزان الموصوفة هنا لاستهداف الجينات بشكل فعال خلال نمو اليرقات في A. الغامبية (أرقام 2 و 3) وA. الزاعجة المصرية (أرقام 4، 5، 6، الجدولين 1 و 2). الشيتوزان النانوية يمكن أن تكون على استعداد مع إما طويلة الرنا المزدوج الجديلة أو سيرنا، وكلاهما قد استخدمت بنجاح في البعوض كما يتضح من نتائج ممثلة الموصوفة هنا. توليف الرنا المزدوج الجديلة هو اقل كلفة من شراء سيرنا، ولكن هو أكثر كث.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
دعم التمويل من محطة التجارب الزراعية في كانساس ومركز جينوم المفصليات في ولاية K-State إلى KYZ التطوير الأصلي لإسكات الجينات بوساطة الشيتوزان / dsRNA في A. gambiae19. تم دعم عمل A. gambiae الموصوف هنا جزئيا من خلال R01-AI095842 من المعاهد الوطنية للصحة / NIAID إلى KM. تطوير إسكات الجينات بوساطة الشيتوزان / siRNA في A. aegypti20،21 تم دعمه من قبل جائزة NIH / NIAID R01-AI081795 إلى MDS. محتويات هذه الدراسة هي مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.02 مل ماصة | Rainin | PR20 | لإعادة تعليق الحمض النووي الريبي المتداخل |
| 0.2 مل ماصة | Rainin | PR200 | لإعادة تعليق الحمض النووي الريبي المتداخل وتحضير الحمض النووي الريبي / الجسيمات النانوية المتداخلة |
| 0.5 مل أنبوب متدرج ؛ | Fischer Scientific | 05-408-120 | لنقل الحمض النووي الريبي المعلق |
| 1 مل ماصة | Rainin | PR1000 | لإعادة تعليق الحمض النووي الريبي المتداخل وتحضير الحمض النووي الريبي / الجسيمات النانوية المتداخلة |
| 1.5 مل أنبوب متدرج ؛ | فيشر ساينتواليك | 05-408-046 | لتحضير الحمض النووي الريبي / الجسيمات النانوية المتداخلة |
| 1M أسيتات الصوديوم ، درجة الحموضة 4.5 | TEKnova | S0299 | لتحضير عازلة أسيتات الصوديوم |
| حمض الخليك ، AIRSTAR. ACS ، USP ، FCC درجة | BDH | VWR BDH3092-500MLP | لإعداد عازلة أسيتات الصوديوم |
| Agarose Genetic Technology Grade | MP Biomedicals LLC. | 800668 | لطلاء الحمض النووي الريبي / الجسيمات النانوية المحضرة |
| المحضرة للطرد المركزي | Eppendorf AG | 5415D | إلى الحبيبات المتداخلة في الحمض النووي الريبي / الجسيمات النانوية |
| شيتوسان ، من قشور الجمبري | Sigma-Aldrich | C3646-25G | للاندماج مع الحمض النووي الريبي المتداخل لتحضير الحمض النووي الريبي / الجسيمات النانوية المتداخلة |
| الخميرة | الجافة Universal Food Corp | NA | لإعداد طعام يرقات البعوض مع الحمض النووي الريبي المتداخل / الجسيمات النانوية |
| أداة E-RNAi | مركز أبحاث السرطان الألماني | NA | لتصميم dsRNA ؛ http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3// |
| طعام السمكة الذهبية | Wardley | Goldfish FLAKE FOOD | لإعداد طعام يرقات البعوض مع الحمض النووي الريبي / الجسيمات النانوية المتداخلة |
| حمام مائي ساخن | 51221048 علمي حراري | لتسخين الحمض النووي الريبي / الجسيمات النانوية المتداخلة عند 55o< / sup>C | |
| الجليد | غير قابل للتطبيق | غير قابل للتطبيق | على ذوبان الجليد والريبي المتداخل وتحضير الحمض النووي الريبي / الجسيمات |
| [header] | |||
| دلو الثلج | فيشر Scientific | 02-591-44 | لتخزين الثلج المستخدم أثناء الإجراء مسحوق |
| الكبد | MP Biomedicals LLC. | 900396 | لتغذية يرقات البعوض بعد معالجة الحمض النووي الريبي / الجسيمات النانوية |
| فرن الميكروويف | مجموعة متنوعة من البائعين | غير قابلة للتطبيق | لتحضير محلول الاغاروز 2٪ |
| بتريديش (100 × 15 مم) | غرفة تغذية Fischer Scientific | 875713 | المتداخلة في الحمض النووي الريبي / الجسيمات النانوية |
| لمقياس الأس الهيدروجيني | Mettler Toledo | S220 | لتحضير المخازن المؤقتة |
| شفرة الحلاقة | فيشر ساينتواليك | 12-640 | لتقسيم الحبيبات الحمض النووي الريبي / الجسيمات النانوية المتداخلة للتغذية |
| siRNA | Thermo Scientific / Dharmacon | مخصص | لتحضير siRNA / الجسيمات النانوية |
| كبريتات الصوديوم ، اللامائية (Na 2< / sub>SO4< / sub>) | BDH / موزعة بواسطة VWR | VWR BDH0302-500G | لتحضير محلول كبريتات الصوديوم 50 ملي مولار الذي سيكون فيه الحمض النووي الريبي المتداخل |
| ميزان الحرارة | VWR | 61066-046 | لقياس درجة حرارة الحمام المائي |
| يختار الأسنان | VWR | 470146-908 | للتحريك أثناء تحضير الطعام في الحمض النووي الريبي / الجسيمات النانوية المتداخل وقطع كريات الجل |
| فريزر منخفض للغاية | مجموعة متنوعة من البائعين | غير قابلة للتطبيق | على تخزين حصص الحمض النووي الريبي المتداخلة والحمض النووي الريبي / الجسيمات النانوية المتداخلة عند -80o< / sup>C |
| خلاط دوامة | فيشر Scientific | 02-216-108 | لتحضير ورق الكيتوزان / الحمض النووي الريبي المتداخل |
| NC9798735 | فيشر Scientific | لتقسيم الحبيبات الحمض النووي الريبي / الجسيمات النانوية المتداخلة للتغذية | |
المراجع
- Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
- Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
- Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organizat....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
