باستخدام الإسفار خلية المنشط الفرز لفحص الخلية من نوع محدد التعبير الجيني في الأنسجة دماغ الفئران

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو استخدام تقنية فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) لفرز أنواع معينة من الخلايا العصبية للتحليل اللاحق للتعبير الجيني الخاص بنوع الخلية ، وعلامات الوراثة اللاجينية ، و / أو التعبير عن البروتين.

Abstract

يتكون الدماغ من أربعة أنواع الخلايا الأولية بما في ذلك الخلايا العصبية، الخلايا النجمية، الخلايا الدبقية الصغيرة و oligodendrocytes. على الرغم من أنها ليست هي نوع من الخلايا الأكثر وفرة في الدماغ، الخلايا العصبية هي درس على نطاق واسع من هذين النوعين من الخلايا نظرا لدورها المباشر في التأثير على السلوكيات. أنواع الخلايا الأخرى في الدماغ تؤثر أيضا على وظيفة الخلايا العصبية والسلوك عبر الجزيئات يشير التي تنتجها. يجب أن علماء الأعصاب على فهم التفاعلات بين أنواع الخلايا في الدماغ لفهم أفضل لكيفية هذه التفاعلات تؤثر وظيفة العصبية والأمراض. حتى الآن، والأسلوب الأكثر شيوعا لتحليل البروتين أو التعبير الجيني يستخدم تجانس عينات الأنسجة كلها، وعادة مع الدم، ودون مراعاة لنوع من الخلايا. هذا النهج هو نهج إعلامي لدراسة التغيرات العامة في الجين أو البروتين التعبير التي قد تؤثر على وظيفة العصبية والسلوك. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب من التحليل لا تصلح لفهم أكبر من الخلايامن نوع محددة التعبير الجيني وتأثير الاتصالات خلية إلى خلية على وظيفة العصبية. وقد تم تحليل علم التخلق السلوكية مساحة التركيز المتزايد الذي يدرس كيفية إدخال تعديلات على الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) تأثير بنية التعبير الجيني على المدى الطويل والسلوك. ومع ذلك، قد تكون هذه المعلومات ذات صلة بالموضوع إلا إذا حللت بطريقة خلية من نوع معين بالنظر إلى النسب التفاضلية وبالتالي علامات جينية التي قد تكون موجودة في جينات معينة من أنواع الخلايا العصبية الفردية. خلية الإسفار المنشط الفرز (FACS) تقنية الموضحة أدناه يوفر وسيلة بسيطة وفعالة لعزل الخلايا العصبية الفردية للتحليل لاحقة في التعبير الجيني، والبروتين التعبير، أو تعديلات جينية من الحمض النووي. ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذه التقنية لعزل أكثر أنواع محددة الخلية العصبية في الدماغ لتحليلها خلية من نوع معين لاحق.

Introduction

الغرض من البروتوكول الموضح أدناه هو عزل أنواع الخلايا الفردية عن مجموعة غير متجانسة من الأنسجة العصبية للتحليل اللاحق للتعبير الجيني الخاص بنوع الخلية أو التعبير البروتيني أو حتى العلامات اللاجينية يتكون الدماغ من العديد من أنواع الخلايا المشتقة من خلايا سلفية مميزة والتي لها خصائص ووظائف خاصة بنوع الخلية. على الرغم من هذه الاختلافات ، يمكن لأنواع الخلايا العصبية المتميزة هذه التعبير عن مستقبلات وجزيئات إشارات داخل الخلايا متشابهة مما يجعل من الصعب قياس تحليل هذه البروتينات في كل مكان أو تفسيرها بطريقة خاصة بنوع الخلية باستخدام الطرق التقليدية. يجب على علماء الأعصاب تحديد وظيفة وتنشيط هذه الأنواع المتميزة من الخلايا في الدماغ وكيف يمكن أن تؤثر بشكل فردي على السلوك لأن هذه ستكون في النهاية الخطوة الأولى لتحديد أدوية وأهداف علاجية أكثر تحديدا للأمراض العصبية والنفسية. على الرغم من هذا الهدف الشامل لأبحاث علم الأعصاب ، قد يكون من الصعب عزل أنواع الخلايا العصبية الفردية عن الدماغ لتحليل التعبير الجيني أو البروتيني ، أو تنشيط جزيئات الإشارات ، أو تعديل العلامات اللاجينية على الحمض النووي. من بين التقنيات المستخدمة حاليا ، يمكن للكيمياء النسيجية المناعية تحديد التعبير عن البروتينات بطريقة خاصة بنوع الخلية عند دمجها مع تلطيخ إضافي لعلامة خاصة بنوع الخلية ، على الرغم من أن هذا يعتمد على أجسام مضادة محددة يمكن أن تلطخ بشكل صحيح للبروتينات ذات الأهمية وقد يكون من الصعب تحديدها كميا. يمكن أن يحدد التهجين الموضعي التوطين المحدد للحمض النووي الريبي المرسال (mRNA) في الخلايا الفردية في الدماغ ، ولكن هذه عملية شاقة تحد أيضا من التحليل المشترك لأنواع معينة من الخلايا وتسمح فقط بتحليل واحد أو ربما عدد قليل من الجينات ذات الأهمية. يستخدم التشريح الدقيق لالتقاط الليزر الليزر لعزل مجموعات سكانية فرعية من الخلايا التي يتم تصورها عبر الفحص المجهري. ومع ذلك ، فإن الطبيعة التي تستغرق وقتا طويلا لهذه العملية والعائد المنخفض نسبيا يمكن أن تحد بشكل كبير من التحليل اللاحق للبروتينات أو مستويات الرنا المرسال ، خاصة إذا كان التعبير عن هذه الجزيئات منخفضا في البداية. فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) هو تقنية جديدة نسبيا في مجال علم الأعصاب لعزل أنواع الخلايا الفردية من الدماغ للتحليل اللاحق للتعبير الجيني¹ و / أو الأهداف اللاجينية². يمكن أيضا استخدام هذه العملية لفرز أنواع معينة من الخلايا العصبية للتحليل اللاحق للتعبير الجيني الخاص بنوع الخلية أو التعبير البروتيني أو العلامات اللاجينية تم استخدام FACS في عدد من مجالات البحث الطبي مثل السرطان والمناعة لعقود من الزمن لحساب وفرز الخلايا المختلفة بناء على الخصائص الفيزيائية أو الكيميائية^{الحيوية 3}. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي بشكل كلاسيكي لتحليل تعبير البروتين على أساس كل خلية ، باستخدام أجسام مضادة محددة. يستفيد الإجراء الموضح أدناه من تقنيات قياس التدفق الخلوي الكلاسيكية لعزل أنواع الخلايا الفردية للتحليل اللاحق لنقاط نهاية البيولوجيا الجزيئية. يمكن لمقياس التدفق الخلوي تحليل عدة آلاف من الخلايا في الثانية ، مما يجعله بديلا سريعا وفعالا للتقنيات الموضحة أعلاه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن عزل الخلايا بناء على التعبير الخلوي لبروتين معين (على سبيل المثال مستقبل ناقل عصبي) أو مزيج من بروتينين أو أكثر (تحديد موقع بروتينات متعددة في نوع معين من الخلايا). وهذا يسمح للمستخدم بعزل أنواع الخلايا العصبية الانتقائية جدا بناء على خصائصها الجزيئية لتحديد وظيفتها في الدماغ.

لإجراء FACS ، يتم تحضير الخلايا العصبية في معلق أحادي الخلية يتم تمريره عبر خلية تدفق تحمل الخلايا ومحاذاة الخلايا بحيث تمر بملف واحد عبر شعاع ضوئي وأشعة ليزر للتحليل. يحصل الكمبيوتر على البيانات من كل خلية ويرسمها على رسم بياني لتحليل المعلمات المحددة (الحجم والحبيبة والفلورة). بناء على هذه المعلمات ، يمكن فرز الخلايا على الفور في أنابيب منفصلة لتذكرها وتحليلها لاحقا لأي نقطة نهاية مطلوبة. يستخدم البروتوكول الموضح أدناه ثلاثة أجسام مضادة لفرز الخلايا العصبية (باستخدام مستضد الخلايا الزعترية 1 ، الجسم المضاد Thy1) ، والخلايا النجمية (باستخدام ناقل الغلوتامات الدبقية ، والجسم المضاد GLT1) ، والخلايا الدبقية الصغيرة (باستخدام مجموعة من جزيء التمايز 11B ، الجسم المضاد CD11b). يمكن استخدام هذا البروتوكول كما هو موضح أدناه أو تعديله بأجسام مضادة مختلفة اعتمادا على نوع الخلية التي يرغب المرء في عزلها لتجاربه الخاصة.

هناك بعض المحاذير التي يجب مراعاتها عند تحديد ما إذا كان هذا البروتوكول مناسبا لتجارب محددة. قد يتعلق أحد التحذيرات الرئيسية بنوع الخلية المحدد الذي يرغب المرء في عزله. في هذا البروتوكول ، الأجسام المضادة الثلاثة المستخدمة هي أجسام مضادة خارج الخلية ، والتي تسمح للمجرب بالحفاظ على أنواع الخلايا سليمة أثناء إجراء التلوين ، وبالتالي الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتينات بالداخل. من الممكن أن يرغب المرء في عزل نوع معين من الخلايا العصبية باستخدام جسم مضاد يحدد البروتين الذي يتم التعبير عنه فقط داخل تلك الخلية المعينة. على سبيل المثال, قد يرغب المرء في عزل الخلايا العصبية الدوبامين باستخدام جسم مضاد لهيدروكسيلاز التيروزين أو عزل الخلايا العصبية أستيل كولين باستخدام جسم مضاد للكولين أسيتيل ترانسفيراز. هذه البروتينات داخل الخلايا وبالتالي تتطلب تثبيت ونفاذية غشاء الخلية للتلوين اللاحق بالأجسام المضادة المناسبة. في حين تم القيام بذلك قبل ^4،5 ، فإن هذه العملية قد تقلل بشكل كبير من إنتاجية الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي من هذه الخلايا المنفذة. قد يكون التحذير الآخر هو أنه ليست كل الأجسام المضادة مناسبة ل FACS. على سبيل المثال ، يمكن للمرء حاليا استخدام جسم مضاد يعمل بشكل جيد للغاية مع اللطخة الغربية ، وهي تقنية تتطلب تمسخ البروتينات. قد لا يكون هذا الجسم المضاد مناسبا بالضرورة لتحديد أنواع الخلايا هذه باستخدام FACS نظرا لأن البروتينات لا يتم تغييرها في أي وقت من هذا البروتوكول ، وبالتالي قد لا يكون للجسم المضاد طريقة للارتباط بمستضد متأصل. تقدم الشركات أوراق المواصفات التي تحدد التطبيقات التي تمت الموافقة على الجسم المضاد لها. إذا لم تتم الموافقة على الجسم المضاد لقياس التدفق الخلوي ، فلا ينبغي أن يثني المرء عن تجربة هذا البروتوكول بجسم مضاد معين. ومع ذلك ، يجب على المرء أن يدرك أنه ليس من المضمون العمل لدى FACS. التحذير الثالث لهذا البروتوكول يتعلق بعدد الخلايا التي يحاول المرء عزلها. FACS هي تقنية ممتازة لإنتاج أكبر عدد ممكن من الخلايا حتى من قطعة صغيرة من الأنسجة ، ولكن من الممكن أيضا أنه إذا رغب المرء في عزل مجموعة متفرقة نسبيا من الخلايا من منطقة دماغية صغيرة نسبيا ، فسيكون العائد من واحد منخفضا بطبيعته. في هذه الحالة ، قد يكون من الضروري تجميع أنسجة المخ من عدد قليل من في نفس مجموعة العلاج من أجل الحصول على عدد الخلايا اللازمة للتحليل اللاحق. ومع ذلك ، فقد استخدم منشور حديث التضخيم المسبق المستهدف للجينات ل (كدنا) للتحليل اللاحق للتعبير الجيني من عدد صغير من الخلايا العصبية المنشطة (5-6٪) من مجموعة أكبر من الخلايا العصبية المصنفة ، مما يشير إلى أنه من الممكن تحليل التعبير الجيني حتى من مجموعات فرعية صغيرة من الخلايا العصبية دون تجميع أعداد كبيرة من⁶التحذير الأخير لهذه التقنية هو أنه يجب على المرء الوصول إلى فارز الخلايا الذي ليس بعيدا جدا. فارز الخلايا هو آلة معقدة تتطلب تدريبا كبيرا من أجل استخدامها بشكل صحيح. وبالتالي ، غالبا ما يتم تشغيل هذه الآلات بواسطة فني مؤهل في منشأة أساسية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الهدف من هذا الإجراء هو فصل الأنسجة العصبية ، وتلطيخها بأجسام مضادة معينة ، وأخذ هذه العينات على الفور إلى فارز في غضون فترة زمنية قصيرة (ربما نصف يوم). سيساعد هذا الإطار الزمني على زيادة بقاء الخلايا المعزولة وإنتاجيتها والحفاظ على سلامة الخلايا للمعالجة والتحليل اللاحقين. إذا تم استيفاء جميع هذه المعلمات الموضحة أعلاه ، فإن FACS هي طريقة ممتازة لتحليل التعبير المحدد من نوع الخلية للجينات والبروتينات من الأنسجة العصبية.

تم إجراء جميع التجارب وفقا للجنة رعاية واستخدام المؤسسية (IACUC) التابعة لجامعة ديلاوير ودليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. التحضير لجمع الأنسجة (15 - 30 دقيقة)

1. تلميع الحرائق ثلاث مجموعات من ماصات باستور الزجاجية بأقطار متناقصة وترقيمها "1" = قطرها حوالي 1 مم ، و "2" = قطرها حوالي 0.75 مم ، و "3" = قطرها حوالي 0.50 مم.
2. أعد تعليق الإنزيم A المجفف بالتجميد مع كل المخزن المؤقت A وفقا للبروتوكول المقدم مع مجموعة التفكك العصبي (انظر جدول المواد). لا تدوام. اقتبس المحلول في 50 ميكرولتر وقم بتخزينه في -20 درجة مئوية لاستخدامه لاحقا.
3. اصنع 1 لتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين وفلتر الفراغ للتعقيم [المخزن المؤقت لإزالة المايلين = 1,000 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 0.1 M (PBS) ، 2 مل من 500 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، و 10 جم من ألبومين مصل الأبقار (BSA)].
4. قم بتقطيع لوح النايلون الشبكي إلى مربعات صغيرة مقاس 1 × 1 بوصة (2.5 × 2.5 سم) سيتم استخدامها لتصفية الحطام الخلوي والأوتوكلاف في دورق صغير مغطى بورق الألمنيوم.
5. قم بإعداد 1 لتر من مخزن الغسيل [مخزن الغسيل = 1,000 مل من 0.1 M PBS ، 2 مل من 500 ملي مولار EDTA ، و 10 جم BSA].

فئة

2. جمع الأنسجة

1. قم بتشغيل الحمام المائي إلى 37 درجة مئوية.
2. قم بإعداد Buffer X من مجموعة التفكك العصبي عن طريق إضافة بيتا ميركابتو إيثانول إلى Buffer X إلى تركيز نهائي يبلغ 0.067 ملي مولار (بالنسبة ل 4 عينات ، أضف 13.5 ميكرولتر من 50 ملي مولار بيتا ميركابتو إيثانول إلى 10 مل من Buffer X).
3. تحضير مزيج الإنزيم 1 عن طريق خلط 50 ميكرولتر من إنزيم P مع 1,900 ميكرولتر من Buffer X لكل عينة كما هو موضح في بروتوكول مجموعة التفكك العصبي على سبيل المثال ، بالنسبة ل 4 عينات ، امزج 200 ميكرولتر من إنزيم P مع 7,600 ميكرولتر من Buffer X.
4. ضع Buffer X في الحمام المائي عند 37 درجة مئوية.
5. ضع 2 مل من محلول الملح المخزن البارد من هانك (HBSS) (بدون Ca ⁺⁺ و Mg ⁺⁺) في بئر واحد من صفيحة ثقافة معقمة مكونة من 6 آبار لكل عينة سيتم جمعها والاحتفاظ بها على الجليد لتشريح الأنسجة.

< p class = "jove_title" >3. تشريح الأنسجة (45 دقيقة - 1 ساعة)

1. حقن بكمية مناسبة من محلول القتل الرحيم (محلول الباربيتورات التجاري ، على سبيل المثال ، Euthasol) ، وفقا لإرشادات اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) ، وقم بإخراج كل الدم بمحلول ملحي بارد 0.9٪.
   1. قم بإعطاء الفئران بجرعة زائدة من محلول القتل الرحيم.
   2. مراقبة التخدير عن طريق التنفس وعن طريق قرص إصبع القدم. عندما يتم تخدير بشكل كاف (لا توجد استجابة لقرصة إصبع القدم والتنفس العميق والبطيء) ، يمكن أن يتدفق الفئران.
   3. لاختراق الفئران ، اقطع تجويف الصدر بمقذر شديد التحمل. قم بقص الحجاب الحاجز للسماح بالوصول إلى القلب. اقطع الضلوع على طول كلا الجانبين حتى أعلى الصدر ، للسماح بالوصول الكامل إلى القلب. في هذه المرحلة ، يمكن تثبيت القفص الصدري على الجانب باستخدام زوج من مرقئ.
   4. قم بإجراء التروية القلبية عن طريق إدخال إبرة 18 جم (للفئران البالغة) متصلة بمضخة كهربائية في البطين الأيسر للقلب. تقوم المضخة بسحب محلول ملحي بارد بنسبة 0.9٪.
   5. ثم افتح الأذين الأيمن بمقص صغير للسماح بتصريف الدم والسائل من الجسم.
   6. الفئران Perfuse مع ما يقرب من 10 مل (للفئران البالغة) من محلول ملحي 0.9٪ لإزالة جميع الخلايا والعوامل المناعية الطرفية.
2. قم بتشريح الجزء المطلوب من منطقة الدماغ باستخدام شفرات الحلاقة المعقمة والتشريح المناسب ، ثم ضع قطع الأنسجة في HBSS البارد بدون Ca²⁺ و Mg^{2 +} .
   ملاحظة: يتطلب البروتوكول HBSS بدون Ca²⁺ و Mg²⁺ في الخطوات الأولى من البروتوكول حيث قد تتداخل هذه الأيونات مع الإنزيمات المطلوبة للتفكك العصبي.
3. بعد جمع جميع عينات الأنسجة ، ارجع إلى المقعد النظيف أو غطاء المزرعة المعقم لمعالجة الأنسجة.

< p class = "jove_title" >4. التفكك العصبي (1 ساعة)

1. قم بتقطيع كل عينة من الأنسجة إلى قطع صغيرة باستخدام شفرات حلاقة معقمة على غطاء لوحة الثقافة المكونة من 6 آبار. تم استخدام هذا البروتوكول لعينات الأنسجة التي تتراوح من حوالي 30 - 100 مجم ، ولكن تمت الموافقة عليه لعينات الأنسجة التي تصل إلى 400 مجم. بالنسبة لعينات الأنسجة التي يزيد حجمها عن 400 مجم ، يجب زيادة أحجام الكاشف بشكل مناسب.
2. استخدم 1 مل من HBSS الطازج بدون Ca²⁺ و Mg²⁺ لنقل قطع الأنسجة المقطعة بماصة إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 2 مل. كرر الخطوتين 4.1 و 4.2 لجميع العينات حتى يتم نقل جميع العينات إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل.
3. الطرد المركزي للعينات عند 300 × جم لمدة دقيقتين في RT وشفط الطاف.
4. أضف 1,900 ميكرولتر من مزيج الإنزيم الدافئ 1 ، كما هو محضر في الخطوتين 2.2 و 2.3 ، إلى كل عينة وأغلق الأنابيب.
5. احتضان العينات لمدة 15 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية ، مع قلب الأنابيب عدة مرات كل 5 دقائق لإعادة تعليق قطع الأنسجة المستقرة.
6. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد مزيج الإنزيم 2 عن طريق خلط 20 ميكرولتر من العازلة Y مع 10 ميكرولتر من الإنزيم A المذاب (ل 4 عينات ، اخلطي 80 ميكرولتر من Buffer Y مع 40 ميكرولتر من الإنزيم A المذاب).
7. أضف 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم 2 إلى كل عينة واقلبها برفق. لا تدوام.
8. افصل كل عينة من الأنسجة بماصة باستور "1"، مع التكرار لأعلى ولأسفل 30 مرة.
9. احتضان العينات لمدة 15 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية ؛ اقلب الأنابيب عدة مرات كل 5 دقائق لإعادة تعليق قطع الأنسجة المستقرة.
10. افصل كل عينة من الأنسجة بماصة باستور "2"، مع المحاولة لأعلى ولأسفل 30 مرة. تجنب توليد الفقاعات.
11. افصل كل عينة من الأنسجة بماصة باستور "3"، مع التخلي لأعلى ولأسفل 30 مرة. تجنب توليد الفقاعات.
12. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية ؛ اقلب الأنابيب عدة مرات كل 5 دقائق لإعادة تعليق الخلايا المستقرة.
13. ضع معلق أحادي الخلية على سلالة خلية 80 ميكرون موضوعة فوق أنبوب صقر سعة 15 مل لإزالة أي قطع كبيرة من الحطام وغسل الفلتر والخلايا ب 10 مل من HBSS (مع Ca²⁺ و Mg²⁺) لإيقاف تفاعلات الإنزيم. كرر حتى يتم نقل كل عينة إلى أنبوب صقر نظيف سعة 15 مل.
قم
14. بالطرد المركزي للعينات عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في RT وشفط المادة الطافية.

< p class = "jove_title" >5. استنفاد المايلين (45 دقيقة)

1. أعد تعليق حبيبات الخلايا تماما باستخدام 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين.
2. أضف كمية محددة من حبات إزالة المايلين والماصة لأعلى ولأسفل لخلطها جيدا.
   ملاحظة: يعتمد حجم حبات إزالة المايلين المستخدمة على حجم الأنسجة وعمر وكمية المايلين المتوقعة في تلك المنطقة المعينة من الدماغ. على سبيل المثال ، بالنسبة لعينة الحصين للفئران البالغة (حوالي 300 مجم) ، احتضن العينة ب 100 ميكرولتر من حبات إزالة المايلين.
3. احتضن لمدة 15 دقيقة في الثلاجة عند 4 درجات مئوية.
4. اغسل كل عينة ب 5 مل من محلول إزالة المايلين.
5. الطرد المركزي للعينات عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في RT.
6. أثناء الطرد المركزي للعينات ، ضع عمودا واحدا لكل عينة في المجال المغناطيسي للفارز المغناطيسي وضع مرشحا نظيفا 80 ميكرون أعلى كل عمود.
7. قم بإعداد الأعمدة والتصفية عن طريق شطف كل عمود ب 1 مل من المخزن المؤقت لإزالة المايلين ، 3 مرات (إجمالي 3 مل). اجمع كل التدفق في حاوية نفايات مثل قاع صندوق الأطراف الفارغ.
8. ضع أنبوب سفلي دائري من البوليسترين سعة 5 مل أسفل كل عمود مباشرة استعدادا لجمع العينات.
9. عندما تنتهي الخلايا من الطرد المركزي ، قم بشفط الطاف وأعد تعليقه تماما في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة المايلين. ضع تعليق الخلية على الفور على العمود واجمع الخلايا في الأنبوب أدناه.
10. اغسل الفلتر والعمود بمخزن مؤقت لإزالة المايلين 1 مل ، 4 مرات (إجمالي 4 مل).
11. جهاز الطرد المركزي لمجموعة الخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في RT.
12. استنشق المادة الطافية والخلايا جاهزة الآن للتلطيخ.

< p class = "jove_title" >6. تلطيخ الخلايا الحية ل FACS (1 ساعة للتلطيخ)

1. دوامة لفترة وجيزة (2 ثانية) الخلايا لفصل الحبيبات وإضافة 5 ميكرولتر على الفور من كتلة Fc (مضادة- مجموعات التمايز 32 ، CD32) ، الدوامة مرة أخرى ، واحتضانها في الثلاجة عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
2. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد خليط الأجسام المضادة الأولية عن طريق إضافة الأجسام المضادة الأولية الثلاثة في مخزن الغسيل على النحو التالي: 0.125 ميكرولتر من الجسم المضاد المترافق CD11b (1: 800) ، 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد ل GLT1 (1: 100) ، و 0.4 ميكرولتر من الجسم المضاد Thy1 المترافق Thy1 (1: 250) لكل 100 ميكرولتر من محلول الغسيل. ستتلقى كل عينة 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الأولية للحضانة ؛ ومع ذلك ، إذا كانت عينتك أكبر بكثير من 400 مجم من الأنسجة ، فقد ترغب في التفكير في زيادة حجم خليط الأجسام المضادة الأولية وفقا لذلك
3. قم بإعداد الأنابيب لأدوات التحكم في التلوين الفردية عن طريق إزالة 2 ميكرولتر فقط من الخلايا من كل أنبوب عينة وإضافتها إلى كل أنبوب تحكم في البقع. تشمل عناصر التحكم في "البقعة الواحدة": APC-CD11b فقط ، و GLT1 فقط ، و FITC-Thy1 فقط ، و PE الثانوي المضاد فقط ، والتحكم "الفارغ" أو غير الملطخ><. ملاحظة: يجب تمثيل جميع العينات في جميع أدوات التحكم في التلوين ، وبالتالي يجب إضافة 2 ميكرولتر من الخلايا من كل عينة إلى كل أنبوب تحكم في التلوين.
قم
4. بدوامة الأنابيب لفترة وجيزة (2 ثانية) وأضف 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الأولية إلى كل أنبوب عينة و 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المناسب لكل أنبوب تحكم في التلوين ، وقم بتدوير الأنابيب مرة أخرى ، وقم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لحماية الأجسام المضادة الفلورية من أي ضوء ، واحتضان الأنابيب في الثلاجة عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. يجب أن تبقى العينات باردة (عند 4 درجات مئوية) لبقية الإجراء للحفاظ على سلامة العينات والأجسام المضادة.
قم
5. بدوامة الأنابيب لفترة وجيزة وأضف 2 مل من محلول الغسيل إلى كل أنبوب.
6. أنابيب الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
7. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد خليط الأجسام المضادة الثانوية عن طريق إضافة 0.2 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المضاد للأرانب المترافق ب PE لكل 100 ميكرولتر من محلول الغسيل. ستحصل كل عينة على 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الثانوية. ومع ذلك ، إذا كانت عينتك أكبر بكثير من 400 مجم من الأنسجة ، فقد ترغب في التفكير في زيادة حجم خليط الأجسام المضادة الأساسي وفقا لذلك.
8. عند اكتمال الطرد المركزي ، قم بتفريغ المادة الطافية من كل عينة في الحوض وامسح الأنابيب رأسا على عقب على منشفة ورقية.
قم
9. بدوامة الأنابيب لفترة وجيزة وأضف 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الثانوية إلى كل أنبوب عينة والجسم المضاد الثانوي المناسب لكل عنصر تحكم في التلوين ، وقم بتدوير الأنابيب مرة أخرى ، وقم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم ، واحتضان الأنابيب في الثلاجة عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة < / > ملاحظة: يجب أن يحصل أنبوب التحكم في التلوين GLT1 فقط على خليط الأجسام المضادة الثانوية.
10. بعد الحضانة ، قم بدوامة الأنابيب لفترة وجيزة وأضف 2 مل من محلول الغسيل إلى كل أنبوب.
11. الطرد المركزي الأنابيب عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
12. عند اكتمال الطرد المركزي ، قم بتفريغ المادة الطافية من كل عينة في الحوض وامسح الأنابيب رأسا على عقب على منشفة ورقية.
13. دوامة الأنابيب وإضافة 0.25 مل من PBS المعقم إلى كل أنبوب. العينات جاهزة للفرز.
    ملاحظة: قد تتطلب المزيد من الخلايا 0.5 مل من PBS المعقم. ومع ذلك ، فمن الأفضل أن تبدأ بحجم أقل حيث يمكن دائما تخفيف العينة إذا كانت مركزة جدا مع الخلايا.
    ملاحظة: أضف DNase اختياريا إلى الأنبوب لمنع تكتل الخلايا وبالتالي انسداد آلة الفرز. يمكن أيضا تصفية العينات باستخدام مرشح معقم 80 ميكرون قبل الفرز مباشرة لتجنب انسداد آلة الفرز.
14. خذ الخلايا إلى فارز على الجليد. اجمع مجموعات الخلايا في أنابيب طرد مركزي خالية من النوكلياز سعة 2 مل مع 0.5 مل من PBS المعقم في كل أنبوب.
15. بعد الفرز ، قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 300 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.

Results

p class = "jove_content" >أهمية استنفاد المايلين وتروية الأنسجة

يوضح الشكل 1 أهمية استنفاد المايلين. يحدث استنفاد المايلين (الخطوات من 5.1 إلى 5.12 من البروتوكول أعلاه) عندما يتم تحضين المعلق أحادي الخلية في حبات إزالة المايلين ، وغسله ، ثم تمريره لاحقا عبر العمود الموجود على الفرز المغناطيسي. الغرض من هذه الخطوات هو تقليل كمية الحطام الخلوي الموجود في كل عينة. نظرا لأن الخلايا العصبية تنفصل ومزعجة ، فإنها يمكن أن تقص العمليات التي عادة ما تكون مخارقة ، وبالتالي قد تلطخ إيجابية بالجسم المضاد ...

Discussion

على غرار العديد من الأنسجة والأنظمة الأخرى ، يتكون الدماغ من مجموعة خلايا غير متجانسة تعمل معا للتأثير على السلوك. إن تحليل التعبير الجيني أو تعبير البروتين أو التعديلات اللاجينية من الخلايا الفردية داخل تلك المجموعة غير المتجانسة لديه القدرة على الكشف عن معلومات حول وظيفة النظام ككل ، وتحديد العمليات الخلوية التي تنظم كل من السلوك الطبيعي وعمليات المرض ، وتوفير أهداف خاصة بنوع الخلية للعلاجات المحتملة. من الممكن في المستقبل أن يؤدي تعديل وظيفة نوع خلية واحدة داخل الدماغ إلى فتح مفتاح علاج الاضطرابات التنكسية العصبية أو ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
طقم التفكك العصبي (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
حبات إزالة المايلين II	Miltenyi Biotec	130-096-733
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
فاصل QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
ورقة شبكة النايلون	أمازون	CMN-0074-10YD	40 بوصة العرض ، 80 ميكرون حجم شبكة
Fc Block / anti-CD32	BD Biosciences	BDB550270	التفاعل للفئران
CD11b المترافق مع APC		201809	التفاعل للفئران
الأرنب المضاد ل GLT1	Novus Biologicals	NBP1-20136	التفاعل للفئران أو الإنسان
المترافق PE مضاد للأرانب الجسم المضاد الثانوي	eBioscience	1037259	الجسم المضاد الثانوي للجسم
المضاد للفأر المضاد للفئران CD90 (Thy1) المضاد ل GLT1 FITC CD90 (Thy1)	Biolegend	202504	للفئران