توضح مقالة الفيديو هذه بروتوكولا شاملا لاكتشاف وتحديد جميع مراحل تكوين الخلايا العصبية للحصين البالغين داخل نفس قسم الأنسجة. لقد وضعنا طريقة للتغلب على قيود التألق المناعي المتعدد غير المباشر التي تنشأ عندما لا تتوفر أجسام مضادة مناسبة من أنواع مضيفة مختلفة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
المناعية وصفها متعددة مع الأجسام المضادة من نوع المضيف نفسه لدراسة الكبار الحصين تكوين الخلايا العصبية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تكوين الخلايا العصبية الكبار هو عملية متعددة المراحل ينظم للغاية التي يتم إنشاؤها خلايا عصبية جديدة من الخلايا الجذعية العصبية تفعيلها عبر ملتزمة بشكل متزايد فرعية السلف وسيطة. كل من هذه الأنواع الفرعية عن مجموعة من الواسمات الجزيئية محددة، جنبا إلى جنب مع معايير شكلية محددة، ويمكن استخدامها للتعرف عليها. عادة، يتم تطبيق تقنيات مناعي التي تنطوي على الأجسام المضادة نوع فرعي معين في تركيبة مع علامات exo- أو الذاتية انتشار الأسلحة النووية. وصفنا هنا immunolabeling طرق للكشف النوعي والكمي لجميع مراحل تكوين الخلايا العصبية الحصين الكبار. تضم هذه تطبيق النظير ثيميدين، نضح transcardial، معالجة الأنسجة واسترجاعها حاتمة الناجم عن الحرارة، ABC المناعية، متعددة المناعي غير المباشر، الفحص المجهري متحد البؤر النوعي والكمي الخلية. وعلاوة على ذلك فإننا نقدم متتابعة متعددة بروتوكول المناعي التي تلتف مشاكل شالناشئة يو sually من الحاجة لاستخدام الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في الأنواع المضيفة نفسها. انها تسمح لتحديد دقيق لجميع أنواع فرعية السلف قرن آمون معا مع علامة الانتشار داخل قسم واحد. هذه التقنيات هي أداة قوية لدراسة تنظيم أنواع فرعية مختلفة السلف في موازاة ذلك، مشاركتهم في أمراض الدماغ ودورها في وظائف محددة في الدماغ.
المقدمة
مناطق الدماغ اثنين توليد جوهري خلايا عصبية جديدة في جميع مراحل الحياة، ومنطقة subventricular من البطينات الجانبية ومنطقة جزئي التحبب (SGZ) من التلفيف المسنن قرن آمون (DG). الخلايا العصبية حديثي الولادة مستمدة من الخلايا الاصلية العصبية وتذهب من خلال مراحل مختلفة من التنمية المورفولوجية والفسيولوجية قبل أن تصل إلى مرحلة النضج 1،2. من تقسيم ببطء شعاعي تشبه الخلايا الجذعية الدبقية (نوع 1) مراحل متتالية العبور تضخيم الخلايا الاصلية المتوسطة تنشأ. أكثر الأنواع الفرعية غير متمايزة (نوع 2A و 2B نوع) لها شكل غير منتظم مع العمليات عرضية قصيرة. أنها تولد neuroblasts (نوع 3) أن الخروج تدريجيا دورة الخلية لتصبح خلايا عصبية غير ناضجة (مع التشعبات امتدت نحو الطبقة الجزيئية) ودمج أخيرا في شبكة الحصين الخلايا الحبيبية ناضجة كما. بسبب الخصائص الفسيولوجية الخاصة بها وتوفر هذه الخلايا الدوائر مع تعزيز اللدونة 3 suggesتينغ دورا فريدا في وظيفة قرن آمون. في الواقع، ولدت الدراسات في العقد الأخير أدلة قوية على تكوين الخلايا العصبية الكبار يساهم في الذاكرة المكانية، ونمط الانفصال والسلوك العاطفي 4،5.
ويمكن دراسة تكوين الخلايا العصبية الكبار باستخدام أساليب مختلفة. النظير ثيميدين تتضمن في الحمض النووي خلال المرحلة S من دورة الخلية وتسمح الولادة التي يرجع تاريخها، الكمي ومصير تحليل خلايا حديثي الولادة 6-8. تطبيق متتابعة من النظير ثيميدين مختلفة (على سبيل المثال، CldU، EDU أو إيدو) يمكن استخدامها لدراسة دوران خلية أو السكان الخلية ولد في نقاط زمنية مختلفة خلال تجربة 9. بديل، علامة الذاتية لتكاثر الخلايا هو Ki67. يتم التعبير عن ذلك في تقسيم الخلايا خلال جميع مراحل دورة الخلية (G1، S، G2، M) باستثناء مرحلة الراحة (G0) وبداية G1 10،11. لتحليل النمط الظاهري من السكان الخلية حديثي الولادة في الكبار dentatالبريد التلفيف عدة الواسمات الجزيئية مرحلة محددة يمكن استخدام مثل GFAP، nestin، DCX وNeuN 1،6. GFAP هو علامة من الخلايا النجمية الناضجة ولكن يتم التعبير أيضا في خلايا تشبه الخلايا الدبقية شعاعي في الدماغ الأمامي الكبار. Nestin هو خيوط وسيطة محددة لخلايا تشبه الخلايا الدبقية شعاعي والخلايا الاصلية المتوسطة في وقت مبكر. DCX هو بروتين المرتبط أنيبيب المعبر عنها في الأسلاف وسيطة، neuroblasts والخلايا العصبية غير ناضجة. وبناء على (المشارك) التعبير عن هذه العلامات الثلاث والميزات المورفولوجية من الخلايا المسمى ويمكن تحديد أربعة أنواع فرعية خلية سلفية متميزة: نوع 1 (GFAP +، nestin +، DCX -)، نوع 2A (GFAP -، nestin + ، DCX -)، نوع 2B (GFAP -، nestin +، DCX +) ونوع 3 (GFAP -، nestin -، DCX +) 1. شارك في وضع العلامات على DCX جنبا إلى جنب مع NeuN، وهو ما يعبر عنه في الخلايا العصبية تالية للتفتل، يسمح للتمايز immaturه (DCX +، NeuN +) وناضجة (DCX -، NeuN +) الخلايا العصبية الحبيبية.
وكثيرا ما تستخدم علامات المذكورة أعلاه لمناعي شارك في وضع العلامات واللاحق متحد البؤر المجهري لتحليل عدد وهوية الخلايا حديثي الولادة. وهذا يتطلب عادة الأجسام المضادة من الأنواع المضيفة مختلفة لمنع الأجسام المضادة غير مرغوب فيها عبر التفاعل. ومع ذلك، تربى معظم الأجسام المضادة الأولية المناسبة للبحوث الخلايا العصبية إما في الأرانب أو الفئران (على سبيل المثال، والماوس α-BrdU، والماوس α-NeuN، أرنب α-Ki67، أرنب α-GFAP). وهذا يؤدي إلى فرض قيود خطيرة على عدد ومجموعة من مولدات المضادات التي يمكن تقييمها في شريحة واحدة. وهذا بدوره لا يزيد فقط الجهد تلطيخ، كما stainings متعددة يجب أن يؤديها، ولكن يمكن أيضا تؤثر سلبا على مصداقية النتائج. وعلاوة على ذلك، فإن بعض المستضدات عرضة للالفورمالين التي يسببها تثبيت حاتمة اخفاء (على سبيل المثال، Ki67، nestin). وصفنا هنا التعديلات من البروتوكولات immunolabeling أحادية ومتعددة الكلاسيكية (على سبيل المثال، استرجاع حاتمة، متعددة المناعية متتابعة، واستخدام nestin-GFP الفئران المعدلة وراثيا 12) أن التغلب على الكثير من هذه القضايا. على وجه الخصوص، وبروتوكول المناعي متعددة متتابعة يسمح تلطيخ ضد ما يصل إلى أربعة مستضدات مختلفة حتى لو مشتق جزء من الأجسام المضادة من نفس المضيف. وهذا يتيح للكشف في وقت واحد من نوع 1، نوع 2A، 2B نوع ونوع الخلايا 3 السلف، وكذلك النشاط التكاثري في غضون مقطع واحد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات التي تعيش بها وفقا للتوجيه EC 86/609 / EEC المبادئ التوجيهية على رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية والتي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات المحلية (Thüringer Landesamt FÜR Lebensmittelsicherheit اوند Verbraucherschutz).
1. حقن داخل الصفاق من ثيميدين النظير
- وزن الحيوانات قبل يوم واحد الحقن. حساب كمية ثيميدين التناظرية المطلوبة لجميع الحقن المخطط لها في اليوم التالي، وكذلك كميات حقن تعديل الوزن الفردية من 10 ملغ / مل محلول المخزون.
- إعداد 10 ملغ / مل حل الأسهم ثيميدين. (تنبيه! النظير ثيميدين سامة. اتبع أوراق بيانات سلامة المواد المحددة (MSDS) المقدمة من قبل الموردين، أي ارتداء معطف المختبر والقفازات، واستخدام غطاء الدخان الكيميائي).
- خذ ثيميدين التناظرية من الفريزر وإحضاره إلى RT، تقريبا. 21 ° C. تزن 10 ملغ و إضافةملحي معقم (لBrdU وCldU) أو 0.04 N هيدروكسيد الصوديوم (في المياه المالحة عقيمة، لإيدو)، دوامة. وضع لا يقل عن 10 - 15 دقيقة في 50 ° C حمام الماء ودوامة كل 2 - 3 دقائق لإذابة مسحوق.
ملاحظة: استخدام الحلول لمدة تصل إلى 24 ساعة عند تخزينها في RT لعدة أسابيع في -20 ° C. حماية حلول من الضوء (غطاء مع رقائق الألومنيوم). تحقق دائما للرواسب وإعادة حل إذا لزم الأمر.
- خذ ثيميدين التناظرية من الفريزر وإحضاره إلى RT، تقريبا. 21 ° C. تزن 10 ملغ و إضافةملحي معقم (لBrdU وCldU) أو 0.04 N هيدروكسيد الصوديوم (في المياه المالحة عقيمة، لإيدو)، دوامة. وضع لا يقل عن 10 - 15 دقيقة في 50 ° C حمام الماء ودوامة كل 2 - 3 دقائق لإذابة مسحوق.
- كبح الماوس من القفا وحقن داخل الصفاق و، المعدلة الوزن حجم مناسب من محلول المخزون (في RT) باستخدام حقنة الدواء مع غرامة 30 G الإبرة.
ملاحظة: في حالة CldU وإيدو يجب أن تدار بشكل تسلسلي ضمن نفس الحيوان، والنظر لحقن تركيزات متساوي المولية (على سبيل المثال، 42.5 ملغ / كغ CldU و57.5 ملغ / كغ عن طريق حقن المخدرات، والتي تتوافق إلى 50 مغ / كغ BrdU). لذلك، وضبط كميات حقن الحلول 10 ملغ / مل الأسهم وفقا لذلك.
2. إعداد الأنسجة
- Prepaإعادة 4٪ الفورمالديهايد في 0.1 M عازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4 قبل يوم التروية. تخزينها في 4 ° C.
- Transcardially يروي الفئران تخدير عميق (3.5٪ الأيزوفلورين) عن طريق البطين الأيسر مع PBS 10 مل الجليد الباردة، ثم مع 40 مل الفورمالديهايد الجليد الباردة (معدل تدفق 5 مل / دقيقة). تشريح الدماغ وما بعد الإصلاح في نفس تثبيتي لمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية.
- نقل أدمغة التوالي إلى 10٪ (24 ساعة في 4 درجات مئوية) و 30٪ سكروز (حتى المصارف الدماغ، تقريبا 48 ساعة). لتجميد، يغرق ببطء أدمغة cryoprotected إلى -25 ° C isopentane حتى عدم وجود فقاعات على الخروج من الأنسجة. تخزين في -80 ° C.
- قطع أقسام الاكليلية من 40 ميكرون سمك على مشراح التجمد (درجة حرارة كتلة في -25 إلى -16 ° C). أقسام نقل بالتتابع في حل التجمد التي تحتوي على الآبار من 24 بئر لوحة زراعة الخلايا (انظر الشكل 1). تخزين في -20 ° C.
الشكل 1. توضيح تخطيطي لنقل شرائح مبضع للفحص المجهري في لوحة 24-جيدا. ابدأ في A1 ووضع شرائح لاحقة في صف وA، بعد A6 الذهاب إلى الصف التالي وباء وهكذا دواليك. عند الوصول إلى D6، والعودة إلى A1 ومتابعة. هذا الترتيب من شرائح يسمح لتقدير حجم كل n عشر الجزء من الدماغ بأكمله. لتقدير حجم الخلايا حديثي الولادة اتخاذ كل 6 تشرين قسم الدماغ (أي ما يعادل محتوى عمود واحد)، لالمناعي phenotyping اتخاذ كل قسم 12 عشر (ما يعادل محتوى الصفوف 2 بالتناوب من عمود واحد).
3. المناعية
تتم معالجة أقسام التعويم الحر، وعادة في 6 لوحات مجهزة تجهيزا جيدا مع لوحة الناقل وشبكة إدراج: ملاحظة. كاستثناء، ومنع، تتم حضانات الأجسام المضادة ورد فعل ABC في 12- أو 24-جيدا لوحات من دون إدراج شبكة (0،5-1 مل لكل ثالذراع يكفي، اعتمادا على عدد من شرائح التي يجب أن تكون ملطخة). خلال هذه الخطوات، نقل أقسام بمساعدة فرشاة غرامة (شطف مع كل حل جديد). تتم جميع حضانات مع التحريض المستمر (بحد أقصى 150 دورة في الدقيقة).
- المناعية (طريقة ABC)
- نقل أقسام من التجمد في TBS وشطف جيدا (مرة واحدة O / N عند 4 درجات مئوية، و 5 مرات في RT لمدة 10 دقيقة لكل منهما) لإزالة التجمد تماما.
- احتضان لمدة 30 دقيقة في 1.5٪ H 2 O 2 في TBS-T لإرواء النشاط البيروكسيداز الذاتية. إيلاء الاهتمام لمحتدما وإعادة غمر-أقسام إذا لزم الأمر. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- اختياري: في هذه الأثناء سخن مجلس الوزراء التدفئة و2 N حمض الهيدروكلوريك إلى 37 درجة مئوية. احتضان أقسام لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 2 N حمض الهيدروكلوريك لتفسد DNA. بلطف أقسام منفصلة بمساعدة فرشاة.
- اختياري: تحييد أقسام لمدة 10 دقيقة في 0.1 M بورات عازلة درجة الحموضة8.5، RT. في حين نقل، مسحة لفترة وجيزة على إدراج شبكة تحتوي على أقسام على منشفة ورقية لإزالة رواسب حمض الهيدروكلوريك. شطف 2 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- احتضان في TBSplus إلى permeabilize الأنسجة والأجسام المضادة ملزمة لمنع المواقع غير محددة، 1 ساعة على RT.
- احتضان في الأجسام المضادة الأولية مخففة في TBSplus، O / N عند 4 درجات مئوية. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- احتضان في الضد الثانوية المعقدة البيروكسيديز مخففة في TBSplus، 3 ساعة على RT. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما. وفي الوقت نفسه ...
- إعداد مجمع ABC وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (1٪ A + 1٪ B في TBS-T). السماح للوقوف لمدة 30 دقيقة في RT قبل الاستخدام. احتضان المقاطع في AB كاشف لمدة 1 ساعة على RT. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- تجهيز 50 مل 0.5 ملغ / مل DAB في TBS-T في 6- أو 12-جيدا لوحة، وانقسم إلى نصفين وماصة 4 مل أو 2 مل لكل بئر، على التوالي. أقسام نقل إلى DAB الحل (تنبيه! DAB سامة اتبع specifi.ج MSDS المقدمة من قبل المورد، أي ارتداء معطف المختبر وقفازات، واستخدام غطاء الدخان الكيميائي).
- إضافة 0.5 مل 1٪ H 2 O 2 إلى 25 مل من محلول DAB المتبقية، ومزيج حجم ماصة ما يعادلها على النحو الوارد أعلاه إلى كل بئر لبدء رد فعل الغلوثانيون. احتضان لمدة 12 دقيقة. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- جبل أقسام إلى الشرائح في الجيلاتين، والهواء الجاف O / N. ساترة مع دائم المتوسطة المتزايدة.
- اختياري: مباين قبل وضع ساترة (انظر القسم 3.5).
ملاحظة: إذا كان نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة بسبب خلفية عالية، كرر H 2 O 2 العلاج بعد الحضانة مع AB كاشف (الخطوة 3.1.8).
- متعددة المناعي
- واحد في وقت واحد أو متعددة المناعي
- نقل أقسام من التجمد في TBS وشطف جيدا (مرة واحدة O / N عند 4 درجات مئوية، و 5 مرات في RT لمدة 10 دقيقة لكل منهما) لإزالة تماما لtifreeze.
- اختياري: كما الخطوات 3.1.3 - 3.1.4.
- احتضان في TBSplus إلى permeabilize الأنسجة ومنع الأجسام المضادة ملزمة مواقع غير محددة، 1 ساعة على RT.
- احتضان في كوكتيل الأجسام المضادة الأولية (مثل الفئران α-BrdU، خنزير غينيا α-DCX، الماعز α-GFP) المخفف في TBSplus، O / N عند 4 درجات مئوية. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- احتضان في مزيج من الأجسام المضادة الثانوية تألقي مترافق (على سبيل المثال، رودامين الأحمر α-الفئران، اليكسا-647 α-خنزير غينيا،-488 اليكسا α-الماعز، وكلها مستمدة في حمار) المخفف في TBSplus، 3 ساعة على RT أو O / N في 4 درجات مئوية. من الآن على حماية أقسام من الضوء. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
- جبل أقسام إلى الشرائح في الجيلاتين، والهواء الجاف O / N. ساترة مع مائي المتوسطة المتزايدة.
- متسلسل المناعي متعددة مع الأجسام المضادة الأولية من الأنواع المضيفة نفسها
- كما الخطوات 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
- احتضان في فايRST الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال، α مستضد أرنب A)، O / N عند 4 درجات مئوية. شطف 3 مرات في TBS ومرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
- احتضان في أول الأجسام المضادة تألقي مترافق الثانوية (على سبيل المثال، رودامين الأحمر-حرف عطف حمار α-أرنب)، 3 ساعة RT. من الآن على حماية أقسام من الضوء. شطف 3 مرات في TBS ومرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
- احتضان في 10٪ مصل طبيعي من نفس المضيف مثل الأجسام المضادة الأولية (مثل مصل الأرنب) لمدة 3 ساعة RT لتشبع paratopes مفتوحة على أول الضد الثانوية. شطف 3 مرات في TBS ومرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
- احتضان في TBSplus مع 50 ميكروغرام / مل أحادي التكافؤ اللامقترن شظايا فاب موجهة ضد مجموعة من الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال، α-أرنب مفتش (H + L)) لتغطية الحواتم التي يمكن المعترف بها من قبل الضد الثانوية الثانية، O / N في 4 ° C.
- شطف 3 مرات على الأقل في TBS ومرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما. في حين نقل، لفترة وجيزة SWAب يدرج شبكة تحتوي على أقسام على منشفة ورقية لإزالة أي رواسب فاب.
- احتضان في الأجسام المضادة الأولية الثاني (على سبيل المثال، أرنب α-المستضد B)، O / N عند 4 درجات مئوية. شطف 3 مرات في TBS ومرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
- احتضان في ثاني الأجسام المضادة تألقي مترافق الثانوية (على سبيل المثال، اليكسا-488-حرف عطف حمار α-أرنب)، 3 ساعة RT. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما، وجبل ساترة على النحو الوارد أعلاه.
ملاحظة: لتسمية مستضدات مع الأجسام المضادة من الأنواع المضيفة مختلفة إضافتها إلى الخطوة 3.2.2.2 والأجسام المضادة الثانوية منها إلى الخطوة 3.2.2.3.
- واحد من الأجسام المضادة الثانوية من الأنواع نفسها كواحدة من الأجسام المضادة الأولية
ملاحظة: هذا البروتوكول هو مناسبة للالرباعي تلطيخ ضد BrdU أو Ki67 جنبا إلى جنب مع GFAP، nestin-GFP وDCX.- تتبع بدقة بروتوكول الخطوات 3.2.1.1 - 3.2.1.5. حتى هذه النقطة استخدام المصل حمار الوحيد في TBSplus.
- احتضان في TBSplus تحتوي على 3٪ مصل الماعز لمدة 1 ساعة على RT. هذا يغطي paratopes مفتوحة على الضد الثانوية-α الماعز. شطف 3 مرات في TBS ومرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
- احتضان في AMCA-حرف عطف. الماعز α-أرنب مخففة في TBSplus، RT 3 ساعة أو O / N 4 ° C. شطف ثلاث مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما، وجبل ساترة على النحو الوارد أعلاه.
- CldU، إيدو شارك في تلطيخ
- شطف، تفسد وتحييد أقسام كما هو موضح في القسم 3.2.1 (الخطوات 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
- احتضان مع 20 ميكروغرام / مل شظايا فاب اللامقترن α الفأر مفتش (H + L) في TBSplus، 1 ساعة على RT. شطف 4 مرات في TBS ومرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
- احتضان في كوكتيل الأجسام المضادة الأولية التي تحتوي على الفئران α-BrdU (1: 400، تنقية IgG2) والفأرة α-BrdU (1: 350) المخفف في TBSplus، O / N عند 4 درجات مئوية. شطف 3 مرات في TBS ومرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
- احتضان في كوكتيل الضد الثانوية التي تحتوي على حمار المعقدة البيروكسيديز α-الفئران (1: 500) وFITC-حرف عطف. حمار α الفأر شظايا فاب (1: 100). شطف 3 مرات في TBS ومرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
- احتضان في رودامين الأحمر-حرف عطف. Streptavidin، 2 ساعة على RT. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما، وجبل ساترة على النحو الوارد أعلاه.
- التضخيم من إشارة مضان في الفئران nestin-GFP
- إضافة الماعز α-GFP إلى كوكتيل الأجسام المضادة الأولية.
- إضافة الضد الثانوية مترافق تألقي مع الخصائص الطيفية مماثلة لGFP (مثل اليكسا 488 حرف عطف الحمار α-الماعز) إلى كوكتيل الضد الثانوية.
- واحد في وقت واحد أو متعددة المناعي
- استرجاع حاتمة
- تنفيذ استرجاع حاتمة بعد الشطف من التجمد. باخرة سخن مع 6- أو 12-جيدا لوحات تحتوي على 0.1 M سيترات عازلة 6.0 درجة الحموضة to 95-99 ° C (حوالي 25 دقيقة).
- نقل أقسام في المخزن المؤقت سترات الساخن والبخار لمدة 30 دقيقة (تغطية لوحات مع رقائق الألومنيوم كما البلاستيك لهويات لا للحرارة مقاومة).
- وضع على الفور لوحات في حمام الثلج حتى يبرد. وهذا يساعد على حماية التشكل الأنسجة، والتي هي ذات أهمية خاصة عند العمل مع أقسام الدماغ من الحيوانات بعد الولادة.
- شطف 3 مرات في TBS لمدة 10 دقيقة كل لشطف خارج وتحييد سترات ومواصلة تلطيخ.
- الماوس الأجسام المضادة في الأنسجة الماوس
- إضافة 20 ميكروغرام / مل أحادي التكافؤ شظايا فاب α الفأر مفتش (H + L، نفس الأنواع المضيفة من الأجسام المضادة الثانوية) إلى الخطوة حجب الأولى (على سبيل المثال، خطوة 3.1.5 أو 3.2.1.3).
- شطف 4 مرات في TBS ومرة واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما، والمضي قدما في البروتوكول المعني.
- بنفسجية الكريزيل counterstaining
- سخن حل بنفسجية الكريزيل إلى 60 درجة مئوية (في جرة الزجاج). احتضان الشرائح في حل الساخن لمدة 3 دقائق.
- شطف في عبد القدير. دست. ويذوى 2 مرات لمدة 1 دقيقة في كل من 70٪، 96٪ و 100٪ الأيزوبروبانول.
- واضح عن 5-6 دقائق في الزيلين أو بديلا الزيلين وساترة مع دائم المتوسطة المتزايدة متوافق.
4. تحليل البيانات
- عدد الخلايا حديثي الولادة ملطخة الغلوثانيون في كل قسم ال 6 على طول كامل مدى rostrocaudal من التلفيف المسنن. استخدام المجهر الضوئي في 400X التكبير.
- مضاعفة أعداد الخلايا الناتجة مع الفاصل تقاطع للحصول على تقدير الأعداد الإجمالية للخلايا حديثي الولادة.
- صورة مضان صفت أقسام مع المجهر ليزر متحد البؤر مجهزة الليزر المناسبة وأنظمة التصفية. خذ مداخن صورة على مواقع عشوائية على طول مدى كامل من التلفيف المسنن في 400X التكبير وتحليلها لا يقل عن 50 خلايا تم اختيارها عشوائيا من الفائدة لكل نصف الكرة للمشاركة في وضع العلامات مع علامات أخرى.
- مضاعفة النسب المئوية الناتجة من الخلايا المسمى المشترك (٪ / 100) مع الأرقام الإجمالية لخلايا حديثي الولادة لحساب مطلقةأرقام من فئات معينة من السكان خلية حديثي الولادة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
طبقنا الأساليب المذكورة أعلاه لتحديد وتوصيف الخلايا حديثي الولادة في بعد الولادة وتعليم الكبار الحصين. لذلك، كنا wildtype وتكوين الخلايا العصبية نقص السيكلين D2 تدق من أصل (Ccnd2 KO) الفئران الموجودة في ظل ظروف المعروفة بتأثيرها على معدل تكوين الخلايا العصبية (أي بيئة المخصب، EE) 13،14. المناعى تلطيخ DAB ضد أي Ki67، BrdU، CldU أو إيدو كشفت باستمرار الاختلافات في أعداد الخلايا بين الأطفال حديثي الولادة wildtype وCcnd2 KO الفئران (الشكل ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الكمي وتحديد المجموعات السكانية الفرعية الخلايا حديثي الولادة هو القضية المركزية في مجال البحوث تكوين الخلايا العصبية الكبار. الجمع بين علامات انتشار الأسلحة النووية والأجسام المضادة ضد البروتينات التي أعرب عنها خلال مراحل معينة من الخلايا العصبية الكبار يسمح كشف المناعى من هذه القطعان. بعض الأجسام المضادة أو مزيج الأجسام المضادة تتطلب الظروف تلطيخ محددة.
وضع العلامات تقسيم الخلايا مع النظير ثيميدين الاصطناعية لا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون S. Tausch على المساعدة الفنية الممتازة. تم دعم العمل من قبل BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) و DFG (FOR1738).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
Immunohistochemistry< / em>الحاتمة < td colspan = "4" > الأجسام المضادة الثانوية < / em>< td colspan = "4" > blocking< / em> تركيب دائم الفحص
td colspan = "4" >
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الإدارة التناظرية للثيميدين < / em> | |||
| 5-Bromo-2 & prime ؛ -deoxyuridine ، BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | سامة (مطفرة ، ماسخة) |
| 5-Chloro-2 & prime ؛ -deoxyuridine ، CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | سامة (مطفرة ، ماسخة) |
| 5-Chloro-2 & prime ؛ -deoxyuridine ، CldU | MP Biomedicals | 2105478 | سامة (مطفرة ، مسخة) |
| 5-Iodo-2 & prime ؛ -deoxyuridine ، IdU | MP Biomedicals | 2100357 | سامة (مطفرة ، ماسخة) |
| إعداد الأنسجة< / em> | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| مسحوق بارافورمالديهايد (PFA) | Riedel-De H & auml; en | 16005 | مضخة نضح سامة وقابلة للاشتعال |
| PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| أنابيب مختبر Masterflex Tygon ، & 0.8 مم | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| إبرة تغذية ، مستقيمة ، 21 جم ، طرف زيتون 1.75 مم ، 40 مم | Agnthos | 1036 | |
| تجميد ميكروتوم ميكروم HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24 بئر لزراعة الخلايا لوحات متعددة الآبار | Greiner Bio-One | 662160< | |
| Tefal vitacuisine steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24 مم إدراج غشاء شبكي بوليستر | Corning | 3479 | محملة مسبقا في ألواح ثقافة 6 آبار Netwell |
| 15 مم إدراج غشاء شبكي بوليستر | Corning | 3477 | محملة مسبقا في ألواح ثقافة 12 بئرا مجموعة |
| حاملة من البلاستيك Netwell 6 آبار | Corning | 3521 | لإدراج غشاء شبكي بوليستر 24 مم طقم |
| ناقل بلاستيك Netwell 12 بئرا | Corning | 3520 | لإدراج غشاء شبكي بوليستر 15 مم مجموعة |
| Vectastain Elite ABC | Vector | Laboratories PK-6100 | |
| DAB (3،3 & prime;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | مادة مسرطنة وحساسة للضوء |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| الأجسام المضادة الأولية< / em> | |||
| Rabbit IgG1 &alpha ;-Ki67 | Novocastra / Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400 / IF 1:100 ؛ يتطلب استرجاع |
| أرنب & alpha ؛ -GFAP ، AS-3-GF | أنظمة Synaptic | 173 002 | 1:500 |
| Goat IgG (H + L) &alpha ؛ -GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| Mouse IgG1 &alpha ؛ -nestin | Abcam | ab6142 | 1:200 ؛ يتطلب استرجاع الخنزير الغيني |
| IgG (H + L) &alpha ؛ -Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1: 500 |
| Rat IgG2a &alpha ؛ - BrdU (ascites) AbD | Serotec / Bio-Rad | OBT0030CX | للكشف عن BrdU ؛ DAB 1:500/IF 1:400 |
| Rat IgG2a α-BrdU (purified)AbD | Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | للكشف عن CldU ؛ DAB 1: 500 / IF 1: 250-400 |
| Mouse IgG1 &alpha ؛ -NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1: 500 |
| ماوس IgG1 &# 954; &# 945 ؛ -BrdU | BD Biosciences | 347580 | للكشف عن IdU ؛ DAB 1: 500 / IF 1: 350 |
| حمار & alpha خنزير غينيا IgG (H + L) - البيوتين | ديانوفا | 711-065-152 | 1:500 |
| حمار & ألفا ؛ الفئران IgG (H + L) - البيوتين | ديانوفا | 712-065-150 | 1:500 |
| حمار & ألفا ؛ فأر IgG (H + L) - البيوتين | ديانوفا | 715-065-151 | 1:500 |
| الماعز & ألفا الفئران IgG (H + L) - Alexa Fluor 488 | المجسات الجزيئية | A11006 | 1: 250 |
| حمار ألفا الماعز IgG (H + L) - Alexa Fluor 488 | المجسات الجزيئية | A11055 | 1: 250 |
| حمار ألفا فأر IgG (H + L) - FITC ، Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| حمار ألفا ؛ - فأر IgG (H + L) - Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1: 250 |
| حمار & ألفا ؛ خنزير غينيا IgG (H + L) - Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| حمار & alpha ; -rat IgG (H + L) - Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| حمار &alpha ؛ - أرنب IgG (H + L) - Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| حمار & - خنزير غينيا IgG (H + L) - Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| ستربتافيدين رودامين ريد-إكس | ديانوفا | 016-290-084 | 1:500 |
| الماعز & ألفا ؛ - الأرنب IgG (H + L) - AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250 ، يعمل فقط مع الأرانب & alpha ؛ -GFAP |
| Hoechst 33342 | المجسات الجزيئية | H3570 | 1: 1000 |
| DAPI | المجسات الجزيئية | D1306 | 1: 1000 |
| حمار شظية Fab & alpha ؛ -mouse IgG (H + L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| حمار شظية Fab & alpha & -rabbit IgG (H + L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| مصل حمار عادي | Merck Millipore | S30 | |
| مصل أرنب عادي | Dianova | 011-000-010 | |
| مصل الماعز العادي | Dianova | 005-000-001 | |
| ألبومين مصل الأبقار | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology< / em> | |||
| Cresyl البنفسجي | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 بديل | الزيلين غير السام |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | وسط |
| المجهر< / em> | |||
| Axioskop 2 | المجهري Carl Zeiss | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss المجهر | ||
المراجع
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
- Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
- Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
- Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
- Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
- Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
- Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
- Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
- Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46(2012).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
- Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
