مقالة منهجية

فسيفساء اسماك الزرد Transgenesis لتحليل الجينوم الوظيفي للجينات التعاونية المرشح لورم إمراض

DOI:

10.3791/52567

⸱

مارس 31, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Pharmacology & Experimental Therapeutics, Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine, 2Tufts University School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذه الدراسة هو توضيح كيف يمكن استخدام استراتيجية التحول الفسيفسائي في أسماك الزرد لتقييم المساهمات النسبية للجينات المسرطنة المتعددة بسرعة وكفاءة في بدء الورم وتطوره في الجسم الحي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كشف التحليل الجينومي الشامل عن أعداد كبيرة بشكل مدهش من التغيرات الجينية في أنواع مختلفة من السرطانات. إن تحديد "الدوافع" المسرطنة بقوة وكفاءة بين هذه الأورام وتحديد علاقاتها المعقدة مع التغيرات الجينية المتزامنة أثناء التسبب في الورم لا يزال مهمة شاقة. في الآونة الأخيرة ، برزت أسماك الزرد كنموذج حيواني مهم لدراسة الأمراض التي تصيب الإنسان ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى سهولة صيانتها ، وخصوبتها العالية ، والمزايا الواضحة للتصوير في الجسم الحي ، والحفظ العالي للجينات المسرطنة ومساراتها الجزيئية ، والقابلية لتكوين الأورام ، والأهم من ذلك ، توافر التقنيات المعدلة وراثيا المناسبة للاستخدام في الأسماك. تم استخدام نماذج الزرد المعدلة وراثيا للسرطان على نطاق واسع لتشريح المسارات المسرطنة في أنواع مختلفة من الأورام. ومع ذلك ، فإن تطوير نموذج أسماك معدلة وراثيا مستقر أمر شاق ويستغرق وقتا طويلا ، بل إنه أكثر صعوبة وأكثر استهلاكا للوقت لتشريح تعاون الجينات المتعددة في التسبب في المرض باستخدام هذا النهج ، والذي يتطلب توليد خطوط متعددة معدلة وراثيا مع الإفراط في التعبير عن الجينات الفردية ذات الأهمية متبوعا بالتكاثر المعقد لهذه الخطوط المعدلة وراثيا المستقرة. ومن ثم ، فإن استخدام نهج الفسيفساء العابر المعدل وراثيا في أسماك الزرد يوفر مزايا فريدة للتحليل الجيني الوظيفي في الجسم الحي. باختصار ، يمكن تزوين الجينات المعدلة وراثيا المرشحة في أجنة من النوع البري أو المعدل وراثيا من مرحلة الخلية الواحدة والسماح لها بالاندماج معا في كل خلية جسدية في نمط فسيفساء يؤدي إلى أنماط وراثية مختلطة في نفس المحقون في المقام الأول. هذا يسمح للمرء بالتحقيق بطريقة أسرع وأقل تكلفة فيما إذا كان بإمكان الجينات المرشحة التعاون مع بعضها البعض لدفع تكوين الأورام وكيف يمكن أن تتعاون معها. من خلال الإفراط العابر في التعبير عن ALK المنشط في الأسماك المعدلة وراثيا التي تفرط في التعبير عن MYCN ، نوضح هنا تعاون هذين الجينات المسرطنة في التسبب في سرطان الأطفال ، الورم الأرومي العصبي الذي قاوم معظم أشكال العلاج المعاصر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السرطان هي أمراض التقدمية والتي تمثلت في تراكم الطفرات المرضية والحذف ومكاسب الكروموسوم مع مرور الوقت. ويمكن لهذه التشوهات الجينية تؤثر على العمليات الخلوية متعددة بدءا من دورة الخلية، موت الخلايا، والتمثيل الغذائي حيوية وتجميع الهيكل الخلوي للتأكيد الردود مثل نقص الأكسجة. وبالتالي، تكون الأورام يعكس الإجراءات الجماعية من الانحرافات الجينية المتعددة عبر مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية. وقد حددت الجهود الأخيرة التكاملية بحوث الجينوم، بما في ذلك كله تسلسل الجينوم، exome التسلسل، والتسلسل المستهدف، تسلسل عميق والدراسات رابطة الجينوم على نطاق، فإن عددا متزايدا من تغيرات جينية جديدة في الأساس جميع أنواع الأورام 1-4. في كثير من الحالات، تحدث الآفات الوراثية معا بطريقة غير عشوائية 5-8، مما يشير إلى تعاونهما في إمراض المرض. تشريح الأدوار أنكجنيك من مجموعة كبيرة من الجينات وأعرب aberrantly الناتجة وROM هذه الآفات الجينومية هو ضروري لوضع استراتيجيات علاجية جديدة وفهم استجابات الخلايا السرطانية لهذه العوامل، ولكن ثبت أن يكون مهمة شاقة، تتطلب أنظمة نموذج حيواني قوية للغاية لإجراء الإنتاجية العالية التحليل الجيني وظيفية في الجسم الحي.

وعلى الرغم من الثدييات، وخاصة القوارض، هي نماذج المفضلة في بيولوجيا السرطان، بدأت الزرد لجذب اهتماما كبيرا. وقد استخدم الزرد مكتملة العظام (داريو rerio) كما كائن نموذج لدراسة التنمية منذ 1960s و تم تطبيق أول لدراسة الورم المرضية في عام 1982 9-11. سهولة الصيانة، وحجم الجسم صغيرا، وخصوبة عالية تجعل من الزرد نموذج قوي للشاشات الوراثية إلى الأمام على نطاق واسع لتحديد الطفرات التي تمنح الظواهر الشاذة والمرضية 10. الشفافية البصرية من الأجنة الزرد هي سمة رئيسية أخرى دعم التوسع في استخدام هذا النموذج السرطان، كماأنه يسمح في مجال التصوير فيفو التي ستجرى لتحديد موقع الورم تنمية في الوقت الحقيقي 9، أحد التطبيقات التي يصعب نسبيا في القوارض 12. كشفت مؤخرا تحليل الجينوم النسبية للجينوم إشارة الزرد (Zv9) 26206 الجينات المكودة للبروتين، مع 71٪ ذات orthologues الإنسان، والتي ترتبط 82٪ مع الجينات المرتبطة بالمرض في الميراث المندلية اون لاين في مان (OMIM) قاعدة بيانات 13، 14. ونتيجة لذلك، تم استخدام الزرد لنموذج مختلف أنواع السرطانات البشرية، بما في ذلك العصبية 8، T-خلية سرطان الدم الليمفاوي الحاد (T-ALL) 15،16، 17،18 سرطان الجلد، ساركومة يوينغ 19، 20،21 العضلية المخططة، وسرطان البنكرياس 22، سرطان الكبد 23 و النخاعي الأورام الخبيثة 24،25، وقد تم اختيار كنموذج السرطان لزرع الأعضاء يدرس 11،26.

والمعدلة وراثيا مستقرةويستخدم النهج في الزرد عادة لدراسة تأثير مكسب من وظيفة الجينات في التطور الطبيعي أو المرضية المرض 27،28. لتطوير مثل هذا النموذج (الشكل 1A)، واحد يضخ بناء الحمض النووي الذي يحتوي على الجينات في المصالح يقودها المروج الأنسجة محددة في خلية واحدة من النوع البري الأجنة. بعد ثلاثة إلى أربعة أشهر الحقن، وعندما تصل الأجنة حقن النضج الجنسي، وoutcrossed أنهم مع من النوع البري الأسماك للكشف عن تلك التي تبين تكامل DNA بناء في سلالة الجرثومية، والتي ترخص لهم من الأسماك مؤسس. هناك العديد من العوامل، مثل عدد النسخ والموقع التكامل من التحوير، تؤثر تعبير عن التحوير في خطوط المعدلة وراثيا مستقرة. وهكذا، لتطوير نموذج الورم المعدلة وراثيا، متعددة خطوط المعدلة وراثيا مستقرة overexpressing على الجين الورمي واحد يجب أن تكون ولدت أولا وفرزهم للخط التعبير عن التحوير على المستوى قد يؤدي إلى ورم الاستقراء. ومع ذلك، إذا overexpression من وس المرشحncogene غير سامة للخلايا الجرثومية، فإنه من الصعب لتوليد خط المعدلة وراثيا مستقر من قبل overexpressing مباشرة التحوير 29. وبالتالي، يمكن أن يكون هذا النهج تستغرق وقتا طويلا، مع ارتفاع مخاطر الفشل في توليد نموذج سرطان مناسب.

هنا، نحن لتوضيح استراتيجية بديلة تقوم على transgenesis عابرة الفسيفساء (الشكل 1B) التي توفر مزايا فريدة على transgenesis مستقر التقليدي للدراسة الجينوم وظيفية في الجسم الحي. في هذا النهج، يتم حقن واحد أو أكثر من يبني التحوير في مرحلة خلية واحدة من المعدلة وراثيا أو من النوع البري الأجنة. يبني DNA حقن تحتوي على الجينات المحورة ثم يتم دمجها mosaically وبشكل عشوائي في الأسماك حقن الأولية، مما أدى إلى الأنماط الجينية مختلطة داخل السكان الخلية متعددة في الأسماك الفردية 30. وعلاوة على ذلك، coinjection من DNA متعددة يبني في الأجنة خلية واحدة يؤدي إلى التكامل المشترك في نفس الخلية في مواقع عشوائية، مما يسمح احد لهيئة تنظيم الاتصالاتCE الخلايا مع التعبير عن الجينات المحورة واستكشاف التفاعلات بين الجينات المختلفة خلال المرضية المرض في الحيوانات الفسيفساء 31. وكدليل على المبدأ، ونحن overexpressed عابر ALK تنشيط mutationally (F1174L) مع mCherry مراسل الجينات في الجهاز العصبي الودي المحيطي (PSNS) تحت سيطرة هيدروكسيلاز الدوبامين بيتا (د βh) المروج في البرية من نوع السمك والأسماك المعدلة وراثيا overexpressing MYCN. ALK، الذي يشفر مستقبلات التيروزين كيناز، هو الجين المتحور الأكثر تواترا في العصبية عالية المخاطر 5-7،32،33. ALK (F1174L)، باعتبارها واحدة من الطفرات الجسدية تفعيل الأكثر شيوعا وقوية، غير ممثلة تمثيلا زائدا في MYCN- تضخيم المرضى العصبية عالية المخاطر والتآزر مع MYCN overexpression لتسريع العصبية تكون الأورام في كل من الفئران المعدلة وراثيا مستقرة ونماذج الزرد المعدلة وراثيا 8،34،35. بواسطة فسيفساءoverexpression عابر ALK (F1174L) مع mCherry في الأسماك المعدلة وراثيا MYCN، ونحن لخص تسارع ظهور الورم لوحظ في الأسماك المعدلة وراثيا مستقرة overexpressing كلا ALK (F1174L) وMYCN، مما يشير إلى أن الاستراتيجية transgenesis الفسيفساء يمكن استخدامها لبسرعة وكفاءة تقييم المساهمات النسبية من الجينات المسرطنة متعددة في بدء الورم في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: جميع الدراسات الزرد وصيانة الحيوانات تم القيام به في اتفاق مع وافق IACUC-معهد مايو كلينيك بروتوكول # A41213.

1. التركيبات DNA لTransgenesis

  1. تضخيم 5.2 كيلوبايت الدوبامين بيتا هيدروكسيلاز (د βh) منطقة المروج 8 باستخدام استنساخ CH211-270H11 BAC (من مركز الموارد BACPAC (BPRC)) كنموذج DNA. استخدام نظام الاقتضاء PCR لفترة طويلة ودقيقة التضخيم PCR من قوالب DNA طويلة والبرامج دورة التالية لPCR: 94 ° C لمدة 2 دقيقة و 10 دورات (94 ° C، 15 ثانية، 50 ° C، 30 ثانية، 68 ° C، 8 دقيقة)، تليها 30 دورات (94 ° C، 15 ثانية، 53 ° C، 30 ثانية، 68 ° C، 8 دقيقة)، 68 ° C، 4 دقيقة (التمهيدي إلى الأمام 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 " والتمهيدي العكسي 5'- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
  2. إنشاء د βh -pDONRP4-P1R دخول اومهشمال شرق 8 باستخدام نظام تجاري الاستنساخ المؤتلف مثل بوابة متعددة المواقع. مزيج 1 ميكرولتر من dβh تنقيته PCR المنتج (172 نانوغرام / ميكرولتر)، 1 ميكرولتر (150 نانوغرام / ميكرولتر) pDONRP4-P1R ناقلات المانحة (جنبا إلى جنب مع ناقلات بوابة أخرى هي هدايا سخية من الدكتور تشي بن شين، جامعة. يوتا) و 4 ميكرولتر من TE العازلة (درجة الحموضة 8.0) مع 2 ميكرولتر من BP انزيم clonase المزيج، احتضان لمدة 1 ساعة على 25 درجة مئوية ومن ثم تحول إلى طلقة واحدة TOP10 المختصة E. القولونية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  3. توليد د βh: المعدلة وراثيا EGFP-MYCN بناء من 8 باستخدام نظام الاستنساخ المؤتلف المذكورة في الخطوة 1.2. مزيج 1 ميكرولتر من كل استنساخ الدخول (150 نانوغرام / ميكرولتر) بما في ذلك 5.2 كيلو بايت dβh المروج (dβh -pDONR P4-P1R بناء)، EGFP تفتقر إلى رامزة توقف (PME-EGFP بناء)، والبشرية MYCN كدنا] (هدية سخية من الدكتور Hogarty في مستشفى الأطفال في ولاية بنسلفانيا، MYCN-pDONRP2R-P3 بناء)، 1 ميكرولتر (150 نانوغرام / ميكرولتر) من متجه جهة المعدلة تحتوي على مواقع الاعتراف I-SCEI (هدية سخية من الدكتور C. غرابر Grabher، معهد كارلسروه للتكنولوجيا، كارلسروه، ألمانيا)، 4 ميكرولتر من TE العازلة ( درجة الحموضة 8.0) مع 2 ميكرولتر من LR Clonase انزيم المزيج، احتضان لمدة 1 ساعة على 25 درجة مئوية ومن ثم تحول إلى المختص كيميائيا E. القولونية مثل طلقة واحدة أعلى 10 واتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
  4. جعل MITF: المعدلة وراثيا MITF بناء من 8 من هضم ناقلات PNP-MITF مع NOTI وسالي أنزيمات التقييد لمدة 2 ساعة عند RT، واستنساخ فرعي صدر 2.65 كيلو بايت (هدية سخية من الدكتور D. Raible، جامعة واشنطن). جزء DNA الذي يحتوي على المروج MITF وتسلسل ترميز الجين MITF الزرد في مواقع NOTI وMluI من متجه pBluescript المعدلة تحتوي على المرافقة المواقع الاعتراف I-SCEI (هدية سخية من الدكتور هوى الحديدنانوغرام، جامعة بوسطن)، وذلك باستخدام T4 DNA يغاز وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    ملاحظة: لزيادة كفاءة توليد MYCN -expressing خطوط مستقرة، د βh: EGFP-MYCN وMITF: يتم coinjected يبني DNA MITF في خلية واحدة الأجنة مرحلة الصدف الصدف يعين نوع من الأسماك متحولة تفتقر إلى العصبية قمة تستمد- للخلايا الميلانية خلال تطوير 36. وهكذا، وظهور الخلايا الصبغية في الأجنة حقن يوحي دمج MITF: DNA MITF يبني في الجينوم. وقد ثبت أن اثنين أو ثلاثة يبني DNA coinjected يمكن cointegrated في الجينوم الأسماك 31. وهكذا، يمكن أن تصبغ الناجمة عن التعبير MITF بمثابة علامة للتكامل dβh: التحوير EGFP-MYCN، ولتحديد أسهل من MYCN خط المعدلة وراثيا مستقر.
  5. خلط د βh: EGFP-MYCN وMITF: DNA MITFيبني في 3: نسبة 1 في إجمالي حجم رد فعل 15 ميكرولتر مع 1 ميكرولتر من I-SCEI الإنزيم و 0.75 ميكرولتر من العازلة. تأكد من أن المبلغ الإجمالي من الحمض النووي في رد فعل لا يتجاوز 750 نانوغرام.
  6. تنفيذ عملية الهضم I-SCEI في RT لمدة 4 ساعة أو O / N. في اليوم الثاني، هضم I-SceI- السلطات الوطنية المعينة على استعداد ل microinjection أو يمكن تخزينها في -20 ° C للحقن في المستقبل. تخزين الإنزيم I-SCEI في -80 درجة مئوية في مأخوذة صغيرة للحفاظ على كفاءة إنزيم لها.
  7. Subclone في ALKF1174L البشرية والبرية من نوع ALK الجينات من متجه PCDNA3 (هدية سخية من الدكتور جورج في معهد دانا فاربر للسرطان) 7 في EcoRI وNOTI مواقع متجه pENTRY1A (هدية سخية من الدكتور C. غرابر Grabher، معهد كارلسروه للتكنولوجيا، كارلسروه، ألمانيا) باستخدام يغاز DNA T4 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  8. توليد د βh: ALKF1174L </ م> أو dβh: يبني المعدلة وراثيا ALKWT باستخدام نظام المؤتلف كما هو مذكور في بروتوكول 1.2. لفترة وجيزة، والجمع بين ثلاثة استنساخ الدخول، dβh -pDONRP4-P1R، ALKF1174L- pENTRY1A (أو ALKWT -pENTRY1A) وP3E-بوليا، في ناقلات جهة المعدلة تحتوي على مواقع الاعتراف I-SCEI (هدية سخية من الدكتور C. غرابر Grabher، كارلسروه معهد التكنولوجيا، كارلسروه، ألمانيا)، وذلك باستخدام LR Clonase انزيم ميكس، وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
  9. خلط د βh: ALKF1174L (أو dβh: ALKWT) وdβh: mCherry DNA يبني في 3: 1 نسبة وخطي لهم I-SCEI انزيم كما هو موضح في بروتوكول 1،5-1،6.

2. حقن مكروي

  1. استخدام بال micropipettes الزجاج مع 1.0 مم لجميع الحقن 37. قطع غيض من بال micropipettes الزجاج بشفرة حلاقة قبل الحقن. معايرة حجم الحقن عن طريق حقنH 2 O جي إلى قطرة من الزيوت المعدنية. قياس قطرها من قطرات الناتجة عنها، وضبط microinjector (الضغط أو مدة ضغط النبض) للتأكد من أن حجم الحقن هو أقل من 10٪ من حجم الخلية الكلي للواحد الأجنة مرحلة الخلية.
  2. إضافة 0.5 ميكرولتر إضافية من جديد I-SCEI انزيم (5 وحدة / ميكرولتر) في 5 ميكرولتر من محلول الحقن التي تحتوي على الحمض النووي يبني الحق قبل حقن لزيادة كفاءة transgenesis 38. حقن 50-80 خريج من يبني DNA خطي في سيتوبلازم الخلية واحد الأجنة المرحلة. لضمان نجاح الحقن، وخلط العينة مع 0.25٪ الفينول الأحمر للالتصور. إذا خلايا تتحول حمراء بعد الحقن، وهذا يشير الى وحقن مكروي الناجحة. لضمان نسبة نجاح عالية لتوليد الأسماك المعدلة وراثيا، ونحن عادة حقن ما يصل الى 500 الأجنة.
  3. لتوليد الأسماك المعدلة وراثيا معربا عن ستابلي MYCN، coinject على خطي د βh: EGFP-MYCN وMITF: يبني DNA MITF (في 3: نسبة 1) في أجنة من تصبغ متحولة الصدف الزرد في مرحلة خلية واحدة. التعبير عن MITF بمثابة مراسل لإدماج بنيات المعدلة وراثيا في الجينوم الأسماك.
  4. لoverexpression فسيفساء من ALK في البرية من نوع أو MYCN الأجنة وراثيا، وشارك في حقن خطي د βh: ALK F1174L (أو dβh: ALKWT) مع dβh: mCherry DNA يبني (في 3: نسبة 1) في خلية واحدة الأجنة الناتجة عن تربية من F1 متخالف تيراغرام (dβh: EGFP-MYCN) الأسماك المعدلة وراثيا مع البرية من نوع AB الأسماك. وهكذا، فإن نصف النسل هم المعدلة وراثيا لMCYN ونصف هي من النوع البري.

3. الشاشة لمستقر أو الفسيفساء المعدلة وراثيا السمك

  1. لزيادة كفاءة تحديد MYCN -expressing خطوط مستقرة، تخدير الأجنة الصدف حقن في المقام الأول مع تريكين (0.02٪) لتي أيام 3-5 من postfertilization والشاشة لتصبغ. نقل الأجنة مع تصبغ إلى طبق بتري جديد مع المياه العذبة البيض ورفعها إلى مرحلة النضج الجنسي لمزيد من الفحص للأسماك مؤسس، والتي تحمل د βh: التحوير EGFP-MYCN في الخلايا الجرثومية.
  2. للتعرف على مؤسس مع انتقال سلالة الجرثومية من EGFP-MYCN، تهجين المصطبغة الأسماك F0 الكبار مع البرية من نوع AB الأسماك والشاشة لأجنة-EGFP إيجابية في 1-2 أيام بعد الإخصاب لمزيد من التنميط الجيني. ضع-EGFP إيجابي واحد F1 الجنين في أنبوب PCR، وإزالة جميع السائل. إضافة 50 ميكرولتر من gDNA استخراج العازلة التي تحتوي على 12.5 ميكرولتر من 4X العازلة تحلل، 35 ميكرولتر H 2 O و 2.5 ميكرولتر بروتين K (10 ملغ / مل) إلى الجنين واحد. احتضان رد فعل لمدة 2-3 ساعة عند 55 ° C، تليها 10 دقيقة من الحضانة في 98ºC لإبطال نشاط بروتين K. لجعل 50 مل من 4X تحلل العازلة، إضافة 500 ميكرولتر من 1M تريس (الرقم الهيدروجيني 8.4)، و 2.5 مل من 1M بوكل رس 47 مل من H 2 O. ملاحظة: بعد تربى F0 MYCN الأسماك المعدلة وراثيا مستقرة مع البرية من نوع AB الأسماك، كل من نسل هي المصطبغة. وبالتالي، وتصبغ لا يمكن أن تكون علامة لتحديد من الأسماك إيجابية MYCN-. بينما في الأسماك المعدلة وراثيا MYCN، يتم التعبير عن بروتين الانصهار EGFP MYCN في PSNS، بما في ذلك الخلايا العصبية متعاطفة من العقد عنق الرحم متفوقة ومتتابعة العقدة قطعي من سلسلة متعاطفة وPSNS غير الخلايا العصبية الدوبامين، مثل النخاع المستطيل و العقد الجمجمة 8. وهكذا، والتعبير عن EGFP يمكن أن تكون بمثابة علامة للحصول على التعرف على MYCN الأجنة وراثيا مستقرة.
  3. استخدام 2 ميكرولتر من gDNA المستخرجة من جنين F1 المصطبغة كقالب، الاشعال MYCN -test F1: 5'-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 '؛ MYCN -R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 '، وخفة دم البرنامج التاليح GC-RICH نظام PCR: 1 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، 25 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. نحن عادة التركيب الوراثي 14-16 الأجنة المصطبغة من التزاوج واحد لتأكيد وجود متكاملة التحوير MYCN في الأجنة المصطبغة، تم تحديد أكثر من 6 مؤسس الأسماك overexpressing MYCN MITF وبواسطة هذه الطريقة.
  4. رفع ما تبقى من الأجنة F1-EGFP إيجابي. كليب الزعانف وراثى لهم في 2-3 أشهر من العمر باستخدام بروتوكول أعلاه لمزيد من تأكيد تكامل MYCN التحوير في الأسماك. تولد F1 MYCN الأسماك المعدلة وراثيا مستقرة مع البرية من نوع AB الأسماك. شارك في حقن خطي د βh: ALK F1174L (أو dβh: ALKWT) مع dβh: mCherry DNA يبني في الأجنة خلية واحدة كما هو موضح في بروتوكول 2.4.
  5. فرز MYCN -expressing الأجنة في التجربة وصفها في بروتوكول 2.4 باستخدام فلوري مجسمةالمجهر escence وفحص الأجنة المحقونة في المقام الأول إلى أيام 1-3 من postfertilization للتعبير عن EGFP-MYCN في PSNS. ثم، خلال الأيام 2-5 من postfertilization، تخدير الأجنة مع تريكين (0.02٪) وفرز تلك الأجنة MYCN- إيجابية أو سلبية مرة أخرى على أساس التعبير عن mCherry في PSNS باستخدام مجهر مضان مجسمة. التعبير عن mCherry بمثابة علامة للcoexpression من ALK في أنسجة الحيوانات فسيفساء الابتدائي حقن.
    ملاحظة: ~ 600 ذرية الناتجة عن تربية الأسماك المعدلة وراثيا MYCN مستقرة مع من النوع البري الأسماك تم حقن كل مجموعة مع يبني DNA خطي، بما في ذلك د βh: ALK F1174L وdβh: mCherry، dβh: ALKWT وdβh: mCherry، أو dβh : mCherry وحدها، على التوالي. ويمكن ملاحظة التعبير فسيفساء من mCherry في 70-90٪ من الأسماك حقن في المقام الأول. نصف واحد الى واحدة-ثلث السمك حقن نجا من خلال مرحلة اليرقات لمراقبة الورم.
  6. رفع كل من mCherry + + MYCN وmCherry + MYCN - الأجنة وفقا للبروتوكولات القياسية من الكتاب الزرد 39 ورصد ظهور الورم تبدأ في 5 أسابيع postfertilization.

4. ورم ووتش في الفسيفساء المعدلة وراثيا السمك

  1. مراقبة mCherry- الإيجابية الأسماك حقن في المقام الأول كل 2 أسابيع ابتداء من الساعة 5 أسابيع postfertilization عن أدلة على ظهور الورم.
  2. تخدير الأسماك مع تريكين (0.02٪)، وشاشة لوجود mCherry - وEGFP -expressing الأورام في PSNS تحت نيكون SMZ-1500 مضان المجهر مجسمة مجهزة مشهد كاميرا رقمية DS-U1.
  3. لتأكيد ما إذا كانت الأورام يعبرون عن التحوير ALK، عزل mCherry- والجماهير-EGFP إيجابي لALK التنميط الجيني PCR.
  4. باستخدام PCR، تضخيم الحمض النووي الجينيالمستخرجة من الأورام المتقدمة مع الاشعال التالية: ALK P7: 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 "وALK P18: 5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3" ورد فعل PCR التالية: 1 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 30 دورات (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية). ثم، وتسلسل المنتج PCR مع ALK P7 التمهيدي لزيادة تأكيد وجود متحولة أو البرية من نوع ALK في الأورام mCherry إيجابية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للتحقيق في ما إذا كانت overexpression من تنشيط mutationally F1174L ALK أو من النوع البري ALK أن تتعاون مع MYCN في الحث العصبية، ونحن overexpressed إما تنشيط ALK البشري أو من النوع البري ALK البشري تحت سيطرة المروج د βh في PSNS من الأسماك المعدلة وراثيا overexpressing MYCN. تم coinjected ALKWT، مع dβh - - إما من بنيات التالية، dβh - ALKF1174L أو dβh mCherry في خلية واحدة من ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة التمثيلية، كنا coinjection عابرة وcoexpression من ALK تفعيلها مع مراسل الجينات mCherry في MYCN -expressing الأسماك المعدلة وراثيا لإظهار أن هذه الجينات تتعاون لتسريع ملحوظ بداية العصبية، بما يتفق مع النتائج السابقة لدينا في مجمع مستقرة coexpressing الأسماك المعدلة وراثيا كلا تنشيط ALK وMYCN 8. هذا النهج المعدلة وراثيا الفسيفساء تمتلك عدة مزايا واضحة على الطريقة التقليدية. الأهم من ذلك، أنها تمكن الفحص السريع للآثار coex...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدر الدكتور جيونغ سو لي لمشاركة الأسماك المعدلة وراثيا Tg (dbh: EGFP-MYCN) معنا في دراستنا. تم دعم هذا العمل بمنحة 1K99CA178189-01 من المعهد الوطني للسرطان ، وزمالة من مؤسسة Pablove و Friends for Life ، وجوائز الباحثين الشباب من مؤسسة Alex's Lemonade Stand Foundation و CureSearch for Children's Cancer Foundation.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
توسيع نظام PCR القالب الطويل روش للعلوم التطبيقية ، IN11681834001
pCR-TOPO vector   ؛Invitrogen ، CA451641
T4 DNA ligaseNew England Biolabs ، MAM0202M
Gateway LR Clonase II إنزيم
Mix		Invitrogen ، CA11791-100
Gateway & reg ؛ BP Clonase® II مزيج الإنزيمInvitrogen ، CA11789-020
نظام PCR الغني GC   ؛Roche Applied Science, IN12 140 306 001
Meganuclease I-SceI نيو إنجلاند بيولابز ، MAR0694S
نيكون SMZ-1500 مجهر مضان مجسمة   ؛نيكون ، نيويورك
كاميرا نيكون الرقمية DS-U1نيكون ، نيويورك

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).
  2. Maher, B. Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling. Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).
  3. Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
  4. Chung, C. C., Chanock, S. J. Current status of genome-wide association studies in cancer. Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).
  5. Mosse, Y. P., et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).
  6. Janoueix-Lerosey, I., et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).
  7. George, R. E., et al. Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).
  8. Zhu, S., et al. Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
  9. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  10. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  11. Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
  12. Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  13. Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
  14. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  15. Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
  16. Feng, H., et al. T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation. Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).
  17. Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).
  18. Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).
  19. Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).
  20. Le, X., et al. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
  21. Langenau, D. M., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Genes & development. 21 (11), 1382-1395 (2007).
  22. Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
  23. Zheng, W., et al. Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma. PLoS One. 9 (3), e91179(2014).
  24. Forrester, A. M., et al. NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis. British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).
  25. Alghisi, E., et al. Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway. Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).
  26. Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).
  27. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).
  28. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  29. Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification. Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).
  30. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
  31. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  32. Chen, Y., et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).
  33. Pugh, T. J., et al. The genetic landscape of high-risk neuroblastoma. Nature genetics. , (2013).
  34. Berry, T., et al. The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma. Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).
  35. Heukamp, L. C., et al. Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191(2012).
  36. Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
  37. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  38. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  39. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  40. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  41. Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. Intercellular bridges in vertebrate gastrulation. PLoS One. 6 (5), e20230(2011).
  42. Ivics, Z., Izsvak, Z. The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering. Mob DNA. 1 (1), 25(2010).
  43. Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
  44. Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. Emerging patterns of somatic mutations in cancer. Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).
  45. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  46. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة