هنا نصف مقايسة جين المراسل القائم على الخلية كأداة قيمة لفحص المكتبات الكيميائية بحثا عن المركبات التي تعدل آليات التحكم بعد النسخ التي تمارس من خلال 3 'UTR.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كلا النسخي والتنظيم بعد النسخي يكون لها تأثير عميق على الجينات التعبير. ومع ذلك، تركز اعتمدت عادة خلية مقرها المقايسات الفرز على تنظيم النسخي، ويجري تهدف أساسا في تحديد جزيئات استهداف المروج. ونتيجة لذلك، يتم كشف آليات ما بعد النسخي إلى حد كبير من التعبير الجيني تطوير الأدوية المستهدفة. نحن هنا وصف فحص خلية القاعدة التي تهدف إلى التحقيق في دور 'المنطقة غير مترجمة (3' 3 UTR) في التشكيل مصير مرنا لها، وإلى تحديد مركبات قادرة على تعديله. ويستند هذا الفحص على استخدام بناء luciferase المراسل تحتوي على "UTR 3 من الجينات في المصالح المتكاملة ثابت في خط الخلية الأمراض ذات الصلة. وينقسم البروتوكول إلى قسمين، مع التركيز في البداية على غربلة أولية تهدف إلى التعرف على الجزيئات التي تؤثر luciferase النشاط بعد 24 ساعة من العلاج. الجزء الثاني من البروتوكوليصف ضرورية لتمييز المركبات تحوير luciferase النشاط على وجه التحديد من خلال UTR 3 'الفرز مضادة. بالإضافة إلى بروتوكول مفصلة ونتائج ممثلة، ونحن نقدم اعتبارات هامة عن تطور الفحص والتحقق من ضرب (ق) على الهدف الذاتية. فإن وصفه خلية مقرها مراسل فحص الجينات تسمح للعلماء لتحديد جزيئات تحوير مستويات البروتين عن طريق آليات ما بعد النسخي تعتمد على "UTR 3.
المقدمة
لتنظيم النسخي فترة طويلة من التعبير الجيني كان يعتقد أن تلعب الكبرى إن لم يكن دور الحصري في السيطرة على إنتاج البروتين. تراكم الأدلة، ومع ذلك، يشير إلى أن التنظيم بعد النسخي يساهم بقدر ما، إن لم يكن أكثر من والتنظيم النسخي لتحديد البروتين الخلوي وفرة 1،2. السيطرة بعد النسخي في التعبير الجيني هو أكثر تعقيدا وتفصيلا مما كان يعتقد في البداية. في الواقع، ظهرت جميع مراحل مختلفة من السيطرة ما بعد النسخي إلى أن ينظم، بما في ذلك تجهيز مرنا، التعريب، والدوران، والترجمة 3 فضلا عن وصفه حديثا عكسها RNA مثيلة 4. من عدد من عمليات التنظيم بعد النسخي يحتمل أن تتأثر، ووصف الفحص أدناه يركز على تلك التي تنطوي على ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: إنتاجية هذه النظم الفحص تعتمد على معدات المختبرات المتاحة HTS. ومما يسهل هذا البروتوكول من قبل TECAN الحرية EVO 200 الروبوت، الذي يؤدي التعامل مع السائل في شكل 96-جيدا. التصغير إلى تنسيق 384 جيدا هو ممكن أيضا. يتم وضع نظام مناولة السائل الروبوتية تحت غطاء تدفق الصفحي من أجل الحفاظ على ظروف معقمة خلال جميع الخطوات التجريبية. إذا لم يكن هناك أتمتة معالجة السائل هو متاح، بروتوكول يمكن تكييفها بسهولة إلى تنسيق منخفضة الإنتاجية.
الفحص الأولي
1. يوم 1: إعداد وخلايا البذور
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام نهج وصفها، وفرز مكتبة 2،000 مركبة لجهري المحتملة لآليات الرقابة في مرحلة ما بعد النسخي المبذولة من خلال 'UTR 3 من الجين MYCN الشكل 3 يصور نتائج الفرز الأولية يتضح من لوحة مكتبة واحدة. تم الحصول على إشارة luciferase المراسل عرض كنسبة مئوية من الضوابط المعالجة السيارة عن طريق قياس luciferase النشاط في لوحات ثلاث نسخ من خلايا CHP134-mycn3UTR تعامل مع المركبات من لوحة مكتبة واحدة. كما هو متوقع، كان غالبية المركبات أي تأثير على luciferase النشاط ك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول مقايسة جين المراسل المستندة إلى الخلية التي تهدف إلى تحديد المعدلات التي تستهدف عمليات ما بعد النسخ المعتمدة على UTR مقاس 3 بوصات. ويشمل الفحص الأولي والفحص المضاد ، وإذا لزم الأمر ، يمكن أن يكون مصحوبا بمقايسة السمية الخلوية. نتيجة الفحص الأولي هي عدد من المركبات المرشحة القيمة ، والتي يتم التحقق من قابليتها للتكرار وخصوصيتها بشكل أكبر في الفحص المضاد.
يعتمد تحديد الضربات الأولية على اختلافات نشاط لوسيفيراز عند علاج الخلايا التي تعبر عن نسخة خيمرية من المراسل -3 'UTR. تسمح .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
نشكر المؤسسة الإيطالية للورم الأرومي العصبي على الدعم المالي الكامل لهذا المشروع.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| لوحة ثقافة 96 بئر بيضاء | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U قاع (لوحة تخفيف) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 مل حوض يمكن التخلص منه للكواشف | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 مل خزان آلي يمكن التخلص | VWR | PB12001301 | |
| نصائح روبوت DITI 50 & nbsp; مو ل نصائح | 30038607 | ||
| Tecan DITI 200 & nbsp ؛ مو ل مصفوفة | 30038617 | معقمة Tecan | |
| 1.4 مل 2D باركود ث ، أنابيب مسطحة | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System ؛ | Promega | E6120 | |
| RPMI | لونزا | BE12-918F | |
| PBS-1x, ث / س Ca2+, ملغ2+ | Lonza | BE17-516F | |
| L-الجلوتامين 200 mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| مجموعة الطيف (مكتبة مركبة) | MicroSource Discovery Systems | N / A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N / A | |
| Tecan F200 قارئ متعدد الألواح ; | تيكان | غير متاح |
المراجع
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalia....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
