مقالة منهجية

اختبار لرائحة التمييز والتعويد في الفئران

18.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52615

⸱

مايو 5, 2015

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Studies, Baylor University, 2Department of Psychology and Neuroscience, Baylor University

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لفحص النظام الشمي للقوارض. سيسمح اختبار التعود الشمي / التخلي عن الرائحة للمحققين بتحديد ما إذا كان الفأر يعتاد على رائحة معروضة بشكل متكرر وما إذا كان الفأر يظهر التخلي عن الرائحة عند تقديم رائحة جديدة.

الملخص

يوضح هذا الفيديو تقنية لإثبات وجود نظام شمي يعمل بشكل طبيعي في الماوس. يساعد الاختبار في تحديد ما إذا كان الفأر يمكنه التمييز بين الروائح غير الاجتماعية والروائح الاجتماعية ، وما إذا كان الفأر يعتاد على رائحة تظهر بشكل متكرر ، وما إذا كان الفأر يظهر التخلي عن العرف عندما تظهر عليه رائحة جديدة. نظرا لأن العديد من اختبارات السلوك الاجتماعي تقيس استجابة التجريبي للفأر المألوف أو الجديد ، يمكن تجنب الإيجابيات الخاطئة من خلال إثبات أن يمكنها اكتشاف الروائح الاجتماعية والتمييز بينها. هناك اعتبارات مماثلة في اختبارات التعلم مثل تكييف الخوف الذي يستخدم الرائحة لخلق بيئة جديدة أو إشارات شمية كمحفز ترابطي. من شأن العجز في الجهاز الشمي أن يضعف القدرة على التمييز بين السياقات وتكوين ارتباط مع إشارة حاسة الشم أثناء تكييف الخوف.

في اختبار سكن / تفجير الرائحة ، يتم تقديم العديد من الروائح على الماوس بشكل متكرر. يتم تقديم كل رائحة ثلاث مرات لمدة دقيقتين. يسجل المحقق وقت الاستنشاق الموجه نحو الرائحة كقياس للاستجابة الشمي. يظهر الماوس النموذجي انخفاضا في الاستجابة للرائحة على العروض المتكررة (التعود). ثم يقدم المجرب رائحة جديدة تثير زيادة الاستنشاق نحو الرائحة الجديدة (التخلي). بعد تكرار عرض من الرواية رائحة يظهر ثانية تعوية. يتضمن هذا البروتوكول عرض الماء ، واثنين أو أكثر من الرائحتين غير الاجتماعيتين ، ورائحتين اجتماعيتين. بالإضافة إلى تقليل الخلط التجريبي ، يمكن أن يوفر هذا الاختبار معلومات عن وظيفة الأنظمة الشمية لخطوط الفأر الجديدة بالضربة القاضية والضربة القاضية والمشروطة.

المقدمة

الفئران هي التي تعتمد على حاسة الشم لتبحر بيئات جديدة، وإيجاد الطعام، للاعتراف أفراد آخرين، والسلوك الجنسي 1-3. فمن الضروري أن المحققين تحديد ما إذا أم لا حيوانات التجارب لديهم شعور سير رائحة قبل إدارة الاختبارات السلوكية التي تشمل المواد الغذائية والتفاعل الاجتماعي، أو أي الروائح تهدف للحصول على رد من الماوس. الشم أو عدم القدرة على التمييز بين الروائح المختلفة، يمكن أن يؤدي إلى ايجابيات كاذبة أو السلبيات في طائفة واسعة من النماذج السلوكية، لذلك ينبغي إنشاء قدرة الماوس على اكتشاف وتمييز الروائح قبل أن يتم إجراء أنواع أخرى من الاختبارات السلوكية.

وكان أول وصف حاسة الشم اختبار التعود / إزالة التعود في 1980s 4. وقد تم تكييف الاختبار لاستخدامها في الفئران عن طريق الدكاترة. مو يانغ وجاكلين كراولي 5. هذا اختبار بسيط وغير مكلف الذي يسمح للمحقق تهتblish أن الفأر يمكن الكشف عن والتفريق بين الروائح. بالإضافة إلى اختبار الشم، وهذا الاختبار يسمح للمحقق لمراقبة السلوك العام للفأرة وينبغي أن يتم في نظام الاختبار في وقت مبكر. ملاحظات نوعية على صعيد الحركة الماوس، وعلامات القلق، ومستوى النشاط، وردا على الروائح الاجتماعية مقابل الروائح الغذائية قد يشير المجالات الجديدة التي يمكن إجراء الاختبار تنفيذها.

في هذا الاختبار، يتم تقديم قطعة قطن مغموسة في مختلف الروائح لماوس ثلاث مرات على التوالي. مع كل عرض المتكرر للرائحة، والماوس روض إلى قطعة من القطن، وإنفاق وقت أقل التحقيق مع كل عرض لاحق. عند عرض رائحة جديدة، يحدث إزالة التعود، وسوف ماوس نموذجي قضاء المزيد من الوقت في التحقيق المسحة، مشيرا إلى أنه يمكن التمييز بين الروائح الحالية والسابقة 5. ويدير هذا الاختبار لفأر واحد في وقت واحد، وتشمل لجنة التنسيق الإدارية 45 دقيقةفترة معدن limation تليها 45 دقيقة من التجارب.

على الرغم من أن هذا الاختبار هو من السهل القيام بها يمكن استخدامها لتحقيق الأسئلة متطورة حول نظام الماوس حاسة الشم. اختبارات شعبية أخرى من الشم، مثل اختبار المواد الغذائية دفن، ببساطة تحديد وجود أو عدم وجود الشم. ومع ذلك، فإن التمييز والتعود حاسة الشم الاختبار يسمح للمحقق لتحديد أن الفأر ليس فقط لديه القدرة على اكتشاف الروائح ولكن يمكن التمييز بين الروائح المختلفة. وقد استخدم هذا النمط من التعود وإزالة التعود لإثبات أن طفرات جديدة يمكن التمييز بين الروائح 6،7. في دراسة مثيرة للدهشة، وتستخدم Fadool وزملاؤه مخاليط معقدة من الروائح تبين أن الفئران مع حذف استهداف الجين من قناة Kv1.3 هي "smellers السوبر" التي يمكن أن تميز الروائح مشابهة جدا أفضل من الفئران العادية 8.

عند النظر في نموذج الماوس خروج المغلوب جديد من المفيد أن تأسيس العهدح وجود السلوك العادي للمهام الحسية الأساسية. عند الانتهاء في وقت مبكر في نظام الاختبار، وتمييز رائحة واختبار التعود يعطي محقق الفرصة لمراقبة أي سلوكيات غريبة. يمكن لهذه الملاحظات يمنع نتائج إيجابية أو سلبية كاذبة في التجارب اللاحقة التي يمكن أن تنسب إلى التباس خصائص متحولة. وبينما يستمر الباحثون إلى السلوك الاجتماعي الحاجة للتحقق من وظيفة حاسة الشم الأساسية يصبح ذات أهمية متزايدة. بالإضافة إلى دراسة الشم في خطوط متحولة، وهذا الاختبار يمكن أن تستخدم لمعالجة مسائل محددة مثل ما إذا كان العلاج الدوائي يزيد خصيصا استجابة الحيوان للمؤثرات رائحة الاجتماعية أو في حالة زيادة استجابتها لجميع المحفزات رائحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد ولدت الفئران الذكور البالغين المستخدمة في التجربة التالية ويضم في جامعة بايلور في درجة الحرارة المحيطة 22 ° C، مع ضوء 14 ساعة و 10 ساعة الظلام (20:00 حتي 06:00 ساعة) دورة نهاري. أعطيت الفئران الإعلان بالمال وبالشهرة أيضا الحصول على الغذاء والماء. وكانت جميع الإجراءات للفئران في الامتثال مع المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وبروتوكول الحيوان وافقت عليه جامعة بايلور رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام. تم اختبار الفئران في وقت متأخر من صباح / بعد الظهر. لجميع الإجراءات أدناه المحقق يجب ارتداء قفازات للقضاء على الروائح ومنع التلوث.

1. إعداد الروائح غير الاجتماعية

  1. إعداد الروائح غير الاجتماعية الطازجة كل يوم من الاختبار.
    ملاحظة: المحقق يجب استخدام قفازات لإعداد الروائح.
    1. ملء 3 أنابيب الطرد المركزي مع 10 مل من الماء لكل منهما.
    2. ماصة 100 ميكرولتر من استخراج الموز إلى 15 مل & #160؛ أنبوب مخروطي و 100 ميكرولتر من استخراج اللوز في الثانية 15 مل أنبوب مخروطي ل1: 100 التخفيف.
      ملاحظة: سوف الثالث أنبوب 15 مل تحتوي على الماء فقط.

2. إعداد الروائح الاجتماعية

  1. إعداد الروائح الاجتماعية الطازجة على اختبار الصباح سوف تحدث. الحصول على الروائح الاجتماعية من اثنين من الأقفاص التي لم يتم تنظيفها لمدة ثلاثة أيام على الأقل ويحتوي على عدد متساو من الفئران. الحصول على الروائح الاجتماعية من الفئران من نفس الجنس كاختبار الموضوع.
    ملاحظة: هذه هي ليتم تخزينها في RT وينبغي أن تستخدم في غضون 4-6 ساعة للحفاظ على رائحة قوية وثابتة.
    1. تحديد عدد رائحة الاجتماعية مسحات القطن تحتاج إلى إنشاء: سيتم تقديم كل فأر يجري اختبارها مع ثلاث مسحات من رائحة الاجتماعية 1، وثلاثة من رائحة الاجتماعية 2.
    2. إعداد الروائح الاجتماعية من خلال مسح مسحة القطن بطريقة متعرج عبر الجزء السفلي من القفص القذرة. تخلص من أي فراش الزائد التشبث الحافة.
    3. متجر مسحات في عبوات زجاجية كبيرة مع أغطية الأكواب أو في تغطيتها مع parafilm. تعيين حاوية واحدة لرائحة الاجتماعية (1) والثانية لرائحة الاجتماعية 2.
  2. الحفاظ على أقفاص مصدر الرائحة خارج قاعة الاختبار التجريبية.

3. التأقلم للماوس اختبار

  1. وضعت على قفازات وتزن الماوس لفحصها ووضع على حدة في قفص نظيفة مع غطاء الأسلاك على رأس وزجاجة مياه إزالتها.
  2. السماح الماوس ليتأقلم إلى قفص جديد لمدة 45 دقيقة في غرفة أخرى غير غرفة الاختبار. ضمان عدم وجود أي روائح غير عادية أو ضوضاء في الغرفة.
  3. كما الاختبار يستغرق حوالي 45 دقيقة، وارباك مرات التأقلم عن طريق وضع الماوس المقبل لفحصها في قفص نظيفة للتأقلم الحق قبل اختبار الماوس الحالي.

4. إعداد غرفة الاختبار

  1. وضع مسحة جديدة من القطن، الشريط المختبر، والزجاجات التي تحتوي على مسحات رائحة الاجتماعية، وأنابيب نعلى اساس الاجتماعية الروائح، وmicropipette، واثنين من أجهزة ضبط الوقت، وزجاجة النفايات مع غطاء في قاعة الاختبار.
  2. تأكد من أن غرفة الاختبار مجانية معقول من الروائح، والضوضاء الصاخبة، والضوء الساطع. لا ترتدي كولونيا معطرة أو المستحضرات.
    ملاحظة: يجب أن لا يكون المراقب العلكة أو الحلوى خلال فترة الاختبار، وينبغي محاولة للحد من تعرضهم للأطعمة رائحة قوية.

5. اختبار الإجراءات

  1. جلب الماوس تأقلم في قفصه إلى غرفة الاختبار ووضع القفص على العداد في الارتفاع الذي هو مريح للعرض أثناء الجلوس.
  2. تقديم كل رائحة 3 مرات على التوالي لمدة 2 دقيقة في كل مرة. استخدام النظام العرض التي يمكن العثور عليها في الجدول رقم 1.
    1. ماصة 50 ميكرولتر من الرائحة في رائحة لفحصها إلى غيض من مسحة القطن وإعادة الغطاء مصدر الرائحة. رفع الجزء العلوي من سلك القفص وإدراج نسكينتيد، نهاية خشبية للمسحة في افتتاح زجاجة المياه، pushinز طول طريق من الجانب السفلي من السلك إلى الأعلى. تجنب لمس طرف القطن إلى أي شيء، بما في ذلك الأصابع، وذلك لتجنب التلوث رائحة.
    2. الاستمرار في رسم مسحة من خلال فتح زجاجة الماء حتى حوالي 1 بوصة من نهاية القطن يتدلى إلى القفص. يضعوا نهاية خشبية من مسحة إلى جانب القفص باستخدام الشريط المختبر.
      ملاحظة: يجب الحرص على عدم ترك غطاء تقع مرة أخرى إلى القفص، مما تسبب ضوضاء الصاخبة التي من شأنها أن تعكر صفو اختبار الماوس.
    3. تبدأ على الفور توقيت لمدة 2 دقيقة. استخدام توقيت واحد لآخر عرض 2 دقيقة. تسجيل الوقت التراكمي قضى شم رائحة أثناء المحاكمة 2 دقيقة. عد السلوك استنشاق الحيوان باستخدام مراقبة وقف منفصلة. ويعرف استنشاق نشط عندما توجه أنف الحيوان نحو الطرف القطن مع لالأنف ~ 2 سم أو أقرب إلى الحافة.
    4. بعد الانتهاء من كل محاكمة، ورفع غطاء الأسلاك وإزالة قطعة من القطن عن طريق سحبها إلى الأسفل من خلال الأمم المتحدةderside من غطاء (هذا يتجنب التلوث رائحة عن طريق منع غيض من القطن لمس الأسلاك). ختم مسحة المستخدمة في زجاجة النفايات 500 مل.
    5. إعداد وإدراج مسحة القادمة والبدء في التوقيت. السماح حوالي 1 دقيقة بين كل فاصل زمني بين المحاكمة. تستمر حتى تم عرض كل رائحة ثلاث مرات على التوالي، لمدة 2 دقيقة في كل مرة.
  3. وبمجرد الانتهاء من جميع المحاكمات الماوس، إفراغ زجاجة من النفايات التي تحتوي على مسحات القطن المستخدمة في سلة المهملات خارج الغرفة الاختبار. عودة الماوس إلى قفص وطنه.

تحليل 6.

  1. تحليل البيانات لكل مجموعة في حالة رائحة باستخدام اثنين من طريقة المتبعة ANOVA التي كتبها نيومان Keuls أو اختبار مماثل آخر مخصص لتحديد التعود كبير (أقل وقت استنشاق نفس الروائح متتالية)، وdishabitutation (المزيد من الوقت استنشاق رائحة جديدة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد بروتوكول صفها، وقد سجلت النتائج باستخدام عشرة الكبار (يوم بعد الولادة 90-120) من الذكور C57BL / 6J الفئران وثمانية من الذكور FVB سلالة مختلطة الخلفية (يوم بعد الولادة 50-70). وأجري الاختبار من قبل محقق واحد أكثر من عدة أيام. كل نقطة على الرسوم البيانية تمثل متوسط ​​الوقت الذي يقضيه التحقيق رائحة.

عندما يتم عرض قطعة من القطن مغموسة في الماء أولا، الفئران تنفق قدرا كبيرا من الوقت في التحقيق هذا الكائن رواية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

النتائج الواردة في هذه الورقة هي الأمثل بالنسبة للفئران. الفئران تظهر استجابة قوية لرائحة جديدة، ثم روض بسرعة. واحدة من الخطوات الرئيسية في هذه الطريقة هو إعداد الروائح. يحتاج المحقق إلى رعاية كبيرة لعزل الروائح عن بعضها البعض لمنع التلوث. جانبا رئيسيا آخر هو عرض من مسحة القطن. يحتاج المحقق إلى استكشاف أفضل موقع من طرف القطن حتى الماوس يمكن تحقيق غيض لكن لا المسيل للدموع على الحافة. عنصرا هاما من الاختبار هو اختيار الروائح. قدمنا ​​ثلاثة الروائح غير الاجتماعية لكنه لن يكون من الصع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

هذا العمل مدعوم بمنحة من مجلس أبحاث جامعة بايلور ومنحة بحثية من مؤسسة الصرع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قفص الماوسAllentownالماوس القياسي
غطاء سلكيAllentownBCU Mouse WBL 2500
الفراشHarlan7090 Sani-Chips
مسحات قطنيةVWR89031-2706 "مقبض خشبي
مستخلص الموزمستخلص اللوز ماكورميك
ماكورميك
شريط مختبرVWR89098-062
ساعة توقفVWR62374-000
قفازات النتريلVWR82026
جهاز التوقيتVWR61161-350
15 مل أنابيب مخروطيةVWR89003-294
2 لتر أكواب   ؛بيركس1003
بارافيلمبارافيلمPM-9924 × 250 بوصة
زجاجة 1 لتر مع غطاءVWR89000-240
قفص

المراجع

  1. Doty, R. L. Odor-guided behavior in mammals. Experientia. 42, 257-271 (1986).
  2. Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm Behav. 46, 247-256 (2004).
  3. Keverne, E. B. Importance of olfactory and vomeronasal systems for male sexual function. Physiol Behav. 83, 177-187 (2004).
  4. Gregg, B., Thiessen, D. D. A simple method of olfactory discrimination of urines for the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. Physiol Behav. 26, 1133-1136 (1981).
  5. Yang, M., Crawley, J. N. Simple behavioral assessment of mouse olfaction. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8 (Unit 8 24), (2009).
  6. Pan, Y. W., Kuo, C. T., Storm, D. R., Xia, Z. Inducible and targeted deletion of the ERK5 MAP kinase in adult neurogenic regions impairs adult neurogenesis in the olfactory bulb and several forms of olfactory behavior. PLoS ONE. 7, e49622(2012).
  7. Wesson, D. W., Levy, E., Nixon, R. A., Wilson, D. A. Olfactory dysfunction correlates with amyloid-beta burden in an Alzheimer's disease mouse model. J Neurosci. 30, 505-514 (2010).
  8. Fadool, D. A., et al. Kv1.3 channel gene-targeted deletion produces 'Super-Smeller Mice' with altered glomeruli, interacting scaffolding proteins, and biophysics. Neuron. 41, 389-404 (2004).
  9. Arakawa, H., Arakawa, K., Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Scent marking behavior in male C57BL/6J mice: sexual and developmental determination. Behav Brain Res. 182, 73-79 (2007).
  10. Baum, M. J. Sexual differentiation of pheromone processing: links to male-typical mating behavior and partner preference. Horm Behav. 55, 579-588 (2009).
  11. Ferguson, J. N., et al. Social amnesia in mice lacking the oxytocin gene. Nat Genet. 25, 284-288 (2000).
  12. Yang, M., et al. Low sociability in BTBR T+tf/J mice is independent of partner strain. Physiol Behav. 107, 649-662 (2012).
  13. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33, 1206-1215 (2008).
  14. Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2011).
  15. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nat Methods. 11, 629-632 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة