هنا، نقدم بروتوكول لافتعال السقالات electrospun ألياف نانوية مع منظمة على مراحل من الألياف واستكشاف تطبيقاتها في تنظيم التشكل خلية / التوجه. التدرجات فيما يتعلق الخواص الفيزيائية والكيميائية للالسقالات ألياف نانوية تقدم مجموعة واسعة من التطبيقات في مجال الطب الحيوي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Electrospun ألياف نانوية السقالات مع التدريجات في منظمة الألياف
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الهدف من هذا البروتوكول هو الإبلاغ عن طريقة بسيطة لتوليد سقالات من الألياف النانوية مع تدرجات في تنظيم الألياف واختبار تطبيقاتها المحتملة في التحكم في مورفولوجيا / اتجاه الخلية. يتم التحكم في تنظيم الألياف النانوية من خلال جهاز تصنيع جديد يتيح الانخفاض التدريجي لتنظيم الألياف في السقالة. يتم تغيير محاذاة الألياف من خلال تقليل وقت ترسيب الألياف العشوائية المغزولة كهربائيا على حصيرة ألياف محاذاة أحادية المحور. من خلال تغطية المجمع بحاجز / قناع متحرك ، على طول نفس محور ترسيب الألياف ، يمكن التحكم في الهيكل التنظيمي بسهولة. لأغراض هندسة الأنسجة ، يمكن زرع الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون في هذه السقالات. تخضع الخلايا الجذعية لتغيرات مورفولوجية نتيجة لموقعها على الهيكل التنظيمي المتنوع ، ويمكن أن تتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا اعتمادا على مواقعها. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التنظيم المتدرج للألياف يعزز التقليد الحيوي لسقالات الألياف النانوية بحيث تشبه إلى حد كبير التوجهات الطبيعية لألياف الكولاجين النانوية في موقع إدخال الأوتار إلى العظام مقارنة بالسقالات التقليدية. من خلال التغليف النانوي ، تتيح الألياف المتدرجة أيضا إمكانية بناء تدرجات كيميائية في سقالات الألياف ، وبالتالي تعزيز تطبيقاتها المحتملة في الفحص السريع للتفاعل بين الخلايا والمواد وتجديد الأنسجة البينية. تتيح هذه التقنية إنتاج سقالات متدرجة مستمرة ، ولكن يمكنها أيضا إنتاج ألياف بخطوات منفصلة من خلال التحكم في حركة الحاجز / القناع المتحرك بطريقة منفصلة.
المقدمة
ألياف النانو هي أداة شعبية لهندسة الأنسجة بسبب قدرتها على تقليد المصفوفة خارج الخلية في هيكلها والحجم النسبي 1. ومع ذلك، بعض واجهات الأنسجة الأم، مثل موقع الإدراج وتر إلى العظم، وتحتوي على ألياف الكولاجين، والتي تظهر على الهيكل التنظيمي المتغير الذي يزيد في محاذاة نحو وتر والنقصان في الموقع العظام 2-5. لذلك، على تجديد الأنسجة فعالة هناك حاجة الى افتعال السقالة التي يمكن أن تحاكي بشكل فعال هذا التدرج الهيكلي.
بحث في السابق، كان هناك أجريت على تغييرات تدريجية في تكوين الألياف، وتحديدا، المحتوى المعدني 6. ومع ذلك، وإعادة العنصر الهيكلي للأنسجة الضامة لا تزال غير مستكشفة إلى حد كبير. وتناولت دراسة سابقة التدرجات المورفولوجية من خلال دراسة تأثير السيليكا سطح كثافة الجسيمات على انتشار الخلايا بانية العظم قبي الفئران وجدت في إنفرحد ذاتها العلاقة بين كثافة الجسيمات السيليكا وتكاثر الخلايا 7. ولكن التغييرات الشكلية التي تتوسط تكاثر الخلايا في الأعمال السابقة كانت في معظمها ذات الصلة إلى السطح خشونة تفتقر إلى القدرة في محاكاة التغييرات التنظيمية الألياف 7،8. حاولت إحدى الدراسات الأخيرة إلى افتعال سقالة تحاكي فريدة من نوعها توجهات ألياف الكولاجين باستخدام جامع رواية للغزل كهربائي 9. بينما نجحت هذه الدراسة في إنتاج سقالة مع ألياف كلا الانحياز وعشوائية، فإنه فشل في محاكاة التغيرات التدريجية عرضت في أنسجة الأم. أيضا، في إنتاج مكونات منفصلة، مع تغيير فوري من الانحياز إلى التوجه عشوائي، وخصائص النشاط الحيوي لهذه سقالة انخفضت بشكل ملحوظ. لم يكن هناك عمل سابق قادرة على إنتاج السقالات ألياف نانوية قابلة للتطبيق مع تدرجات المستمرة في توجهات الألياف من الانحياز وعشوائي. وقد أظهرت دراستنا الأخيرة الترفيه الناجح السقالات ألياف نانويةمع التدرج في المؤسسة الألياف التي يمكن أن يحتمل تقليد منظمة الكولاجين الأم في وتر إلى العظام الإدراج 10. ويهدف هذا العمل إلى تقديم البروتوكولات المستخدمة لإنتاج السقالات ألياف نانوية مع الهيكل الذي يشبه أن التنظيم الألياف في واجهة الأم الأنسجة وتر إلى العظام.
هياكل ألياف نانوية التدرج ويحتمل أن تكون التطبيقات عبر مجموعة متنوعة من المجالات بعيدة المدى. ركزنا على تطبيقات لهندسة الأنسجة للموقع الإدراج وتر إلى العظام عن طريق الجمع بين السقالات لدينا مع الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة (ADSCs) التي تستخدم بالفعل لتجديد الأنسجة على مختلف ركائز 11-14. وبالإضافة إلى ذلك، ADSCs متشابهة جدا في الطبيعة إلى الخلايا الجذعية نخاع العظام من حيث multipotency ومواردها وفيرة والتي يمكن حصادها باستخدام بسيط 15،16 إجراء شفط الدهون. بذر هذه الخلايا على السقالات على مراحل ألياف نانوية أخرى يعزز تيس بهممقاضاة التطبيقات الهندسية من خلال السماح لتوزيع رقابة من الخلايا التي يحتمل أن تفرق في الأنسجة المختلفة. بالإضافة إلى بذر الخلايا الجذعية، ألياف النانو يمكن أن تكون مغلفة مع الإشارة الجزيئات لتنظيم الاستجابة الخلوية. اقتران nanoencapsulation مع التدرج التنظيمي لهذه السقالات يسمح لدراسة السلوك الخلوي أو التصاميم والطلاء زرع الممكنة. يمكن تغليف جزيئات الوظيفية مثل العظام البروتين المخلق 2 (BMP2)، وهو ما ثبت للحث على بناء العظم التمايز 15،16، تزيد من تعزيز تطبيقات هندسة الأنسجة من هذه السقالات 10.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الحل
- يعد حل من بولي (ε-caprolactone) (PCL) (M ث = 80،000 جم / مول) في تركيز تقريبي من 100 ملغ / مل. حل PCL في خليط من ثنائي كلورو ميثان (DCM) وN، N-dimethlyformamide (DMF) بنسبة 4: 1 (ت / ت) مع تركيز 10٪ (ث / ت).
- وضع الحل في أنبوب زجاجي 20 مل لخلط. وضع أنبوب زجاجي في نظافة بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة، أو حتى الحل هو شفافة.
2. جهاز إعداد
- إضافة محلول PCL أعدت في حقنة 5 مل مع إبرة حادة 21 مقياس المرفقة.
- ضع ضخ حقنة في موقف غزل كهربائي العمودي، وفقا لشكل 1.
- استخدام الفولاذ المقاوم للصدأ الفجوة جامع مع فضاء مفتوح 2 سم × 5 سم للألياف الركيزة الانحياز. ضع جامع 12 سم من رأس الإبرة.
- توصيل الجهد العالي التيار المباشر (DC) إمدادات الطاقة إلىالمطحون إبرة وجامع. تأكد من أن جامع يرتكز بشكل فردي مع أي اتصال مع غيرها من المعدات المخبرية.
3. غزل كهربائي
- يتم استبدال مجموعة ضخ حقنة إلى 1.50 مل / ساعة، حتى قطرات تشكيل في طرف الإبرة فورا عند إزالتها. ثم، تعيين معدل تدفق إلى 0.50 مل / ساعة.
- تحويل المشغل الجهد إلى 12 كيلو فولت.
- Electrospin حتى الألياف الانحياز أحادى المحور تغطي تماما الفجوة على جامع.
- تطبيق الغراء على حواف لوحة زجاجية صغيرة ونقل الألياف من جامع الفجوة إلى لوحة زجاج. وضع لوحة زجاجية على رأس قطعة من رقائق الألومنيوم الذي يحتوي على نفس حجم لوحة من الزجاج والارض.
- ضع جامع حقنة الثاني وفقا لالشكل 3.
- إرفاق قناع من البلاستيك لضخ حقنة الثانية وضعه 2 مم فوق جامع.
- إضافة الكومارين 6 في 1٪ (وزن / وزن) إلى PCL حل إذا نانoencapsulation هو desired- وتخلط حتى الحل هو شفافة.
- تحميل PCL أو PCL / الكومارين 6 الحل في إبرة 5 مل مع إبرة حادة 21 قياس. ضبط مضخة عمودية إلى 0.50 مل / ساعة والأفقي لسحب في 9 مل / ساعة أو في سرعة التقريبية من 1 مم / دقيقة.
- انتقلت Electrospin حتى القناع تماما تقريبا قبالة جامع، ولكن مع منطقة حافة تزال تحت القناع.
4. الألياف توصيف
- مكان العينات مع الوجهين شريط موصل إلى مسمار معدني ومعطف مع البلاتين لمدة 40 ثانية باستخدام المغطي تفل في 40 مللي أمبير.
- فحص الألياف من خلال المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) وفقا لدراساتنا السابقة 17،18.
- جمع الصور في الجهد المتسارع لل15 كيلو فولت.
- أداء سريع تحويل فورييه (الاتحاد الفرنسي للتنس) التحليل على عينة من الألياف منفصلة لقياس محاذاة الألياف. معلومات مفصلة على قياس محاذاة الألياف التي كتبها الاتحاد الفرنسي للتنس يمكن أن يشير رس دراسات سابقة 19،20.
5. الخلايا الجذعية البذر.
- تعقيم العينات الألياف عن طريق نقع في محلول الإيثانول 70٪ لمدة 2 ساعة. ثم يغسل الألياف مع الماء المقطر لإزالة أي ملوثات.
- الحصول ADSCs البشرية وخلايا الثقافة في 25 سم 2 قارورة عند 37 درجة مئوية في جو من 95٪ الهواء / 5٪ CO 2. تغيير مستنبت خلية كل يوم 10.
- يعرض للتريبسين الخلايا وحساب عدد الخلايا. على وجه التحديد، وإزالة جميع مستنبت من قارورة زراعة الخلايا وغسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مرتين. ثم يضاف 1 م لتر من محلول 0.25٪ التربسين-EDTA (ما قبل الحار في حمام مائي إلى 37 درجة مئوية) لتغطية أحادي الطبقة الخلية واحتضان القارورة في الحاضنة زراعة الخلايا لمدة 2-3 دقائق. إضافة 4 مل مستنبت وتغسل جميع الخلايا من السطح قبل pipetting المتوسطة في جميع أنحاء السطح. عشر الطرد المركزي تعليق خلية وإعادة تفريقالبريد بيليه خلية في المتوسط الثقافة. عدد الخلايا عبر عدادة الكريات. البذور حوالي 1 × 10 4 الخلايا إلى سقالة ألياف نانوية وضعها في طبق ğ ثقافة 35 ملم واحتضان لمدة 3 و 7 أيام.
- خلايا وصمة عار باستخدام ثنائي الأسيتات فلوريسئين (5 ملغ / مل في الأسيتون) (FDA) ثم صورة العينات باستخدام المجهر الفلورسنت. على وجه التحديد، إضافة 100 ميكرولتر من حل FDA إلى الطبق الثقافة واحتضان لمدة 30 دقيقة. غسل الخلايا مع PBS ثلاث مرات قبل التصوير الفلورسنت. تحليل التوجه خلية باستخدام برنامج حصيرة-مختبر مخصص بناء على دراساتنا السابقة (10).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام هذا البروتوكول، تم تشكيل حصيرة الألياف مع التدرج التنظيمي. ويبين الشكل 3 صور SEM التي اتخذت في مواقع مختلفة على منصة الاعدام ألياف نانوية. نوعيا، فإنه يمكن تحديد أن هناك تطور من الألياف الانحياز أحادى المحور في 0 مم (الشكل 3A) إلى الألياف متنوعة عشوائية في 6 ملم (الشكل 3D). الاتحاد الفرنسي للتنس يعطي قيمة الكمية إلى محاذاة الألياف، تفاصيل عن العمليات الكمية هي مفصلة هنا 19. الألياف في 0 مم المعرض والاتحاد الفرن...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الجزء الأكثر أهمية في البروتوكول هو توليد سقالة التدرج. من الضروري أن يتحرك القناع الذي يغطي المجمع بسرعة ثابتة بحيث يكون هناك تغيير تدريجي داخل سقالة الألياف. يعد التحضير الصحيح لمحلول PCL أمرا مهما أيضا لضمان نجاح الغزل الكهربائي. يوصى بالتحقق من مورفولوجيا الألياف قبل الغزل الكهربائي ، خاصة بعد تغليف الكومارين -6 ، والذي قد يتطلب جهدا أعلى للدوران الكهربائي بشكل صحيح.
علاوة على ذلك ، يسمح البروتوكول بتصنيع تدرجات منفصلة في تنظيم الألياف. ومع ذلك ، ينتج عن هذا البروتوكول سماكات متغيرة عبر ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل جزئيا من أموال بدء التشغيل من جامعة نبراسكا المركز الطبي والمعهد الوطني للصحة (عدد المنح 1R15 AR063901-01).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| بولي كابرولاكتون | سيجما ألدريتش | 440744 | |
| N ، N-Dimethlyformamide | Fisher Chemical | D-119-1 | |
| ثنائي كلورو ميثان | فيشر كيميائي | AC61093-1000 | |
| Coumarin 6 | Sigma-Aldrich | 546283 | |
| الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون | تقنيات الهندسة الخلوية | HMSC. AD-100 | |
| تقنيات مصل الأبقار الجنينية | 26140-111 | ||
| الفلوريسين دياسيتات | سيجما ألدريتش | F7378 | |
| الإيثانول | سيجما ألدريتش | E7023 | |
| التربسين-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| & alpha ؛ -معدل النسر | Invitrogen | a10490-01 | |
| Acetone | Fisher Scientific | s25120a | |
| الفوسفات المخزنة الملحية | Invitrogen | 10010023 | |
| الشرائح الزجاجية VWR | الدولية، LLC | 101412-842 | |
| مضخة حقنة | فيشر Scientific | 14-831-200 | |
| حقنة واحدة بالموجات فوق الصوتية منظف | برانسون | 1510 | |
| عالية الجهد DC امدادات | الطاقةجاما أبحاث الجهد العالي | ES30 | |
| مجهر إلكتروني ماسح | FEI | Nova 2300 | |
| مجهر مضان | Zeiss | Axio Imager 2 |
المراجع
- Xie, J., Li, X., Xia, Y. Putting electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromol. Rapid Commun. 29 (22), 1775-1792 (2008).
- Genin, G. M., et al. Functional grading of mineral and collagen in the attachment of tendon to bone. Biophys. J. 97 (4), 976-985 (2009).
- Thomopoulos, S., Marquez, J. P., Weinberger, B., Birman, V., Genin, G. M. Collagen fiber orientation at the tendon to bone insertion and its influence on stress concentrations. J. Biomech. 39 (10), 1842-1851 (2006).
- Thomopoulos, S., Williams, G. R., Gimbel, J. A., Favata, M., Soslowsky, L. J. Variation of biomechanical, structural, and compositional properties along the tendon to bone insertion site. J. Orthop. Res. 21 (3), 413-419 (2003).
- Thomopoulos, S., Genin, G. M., Galatz, L. M. The development and morphogenesis of the tendon-to-bone insertion - What development can teach us about healing. Musculoskelet Neuronal Interact. 10 (1), 35-45 (2010).
- Li, X., Xie, J., Lipner, J., Yuan, X., Thomopoulos, S., Xia, Y. Nanofiber scaffolds with gradations in mineral content for mimicking the tendon-to-bone insertion site. Nano Lett. 9 (7), 2763-2768 (2009).
- Kunzler, T. P., Huwiler, C., Drobek, T., Vörös, J., Spencer, N. D. Systematic study of osteoblast response to nanotopography by means of nanoparticle-density gradients. Biomaterials. 28 (33), 5000-5006 (2007).
- Huwiler, C., Kunzler, T. P., Textor, M., Vörös, J., Spencer, N. D. Functionalizable nanomorphology gradients via colloidal self-assembly. Langmuir. 23 (11), 5929-5935 (2007).
- Xie, J., et al. 'Aligned-to-random' nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
- Xie, J., Ma, B., Michael, P. L., Shuler, F. D. Fabrication of nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and their potential applications. Macromol. Biosci. 12 (10), 1336-1341 (2012).
- James, R., Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Balian, G., Chhabra, A. B. Tendon tissue engineering: adipose-derived stem cell and GDF-5 mediated regeneration using electrospun matrix systems. Biomed. Mater. 6 (2), 025011(2011).
- Bodle, J. C., Hanson, A. D., Loboa, E. G. Adipose-derived stem cells in functional bone tissue engineering: lessons from bone mechanobiology. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 195-211 (2011).
- Lee, J. H., Rhie, J. W., Oh, D. Y., Ahn, S. T. Osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells (hASCs) in a porous three-dimensional scaffold. Biochem. Biophys. Res. Commun. 370 (3), 456-460 (2008).
- Tapp, H., Hanley, E. N., Patt, J. C., Gruber, H. E. Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair. Exp. Biol. Med. 234 (1), 1-9 (2009).
- Gimble, J. M., Guilak, F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy. 5 (5), 362-369 (2003).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
- Xie, J., et al. The differentiation of embryonic stem cells seeded on electrospun nanofibers into neural lineages. Biomaterials. 30 (3), 354-362 (2009).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Li, X., Sakiyama-Elbert, S. E., Xia, Y. Neurite outgrowth on nanofiber scaffolds with different orders, structures, and surface properties. ACS Nano. 3 (5), 1151-1159 (2009).
- Ayres, C., et al. Modulation of anisotropy in electrospun tissue engineering scaffolds: analysis of fiber alignment by the fast Fourier transform. Biomaterials. 27 (32), 5524-5534 (2006).
- Ayres, C., et al. Measuring fiber alignment in electrospun scaffolds: a user’s guide to the 2D fast Fourier transform approach. J. Biomater. Sci. Poly. Ed. 19 (5), 603-621 (2008).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
