مقالة منهجية

تزامن العنيقاء Crescentus للتحقيق في دورة الخلية البكتيرية

DOI:

10.3791/52633

⸱

أبريل 8, 2015

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تزامن الخلايا البكتيرية ضروري لدراسات دورة الخلية البكتيرية وتطورها. الهلال الرديبي قابل للمزامنة من خلال الطرد المركزي الكثافة مما يسمح بأداة سريعة وقوية لدراسات دورة الخلية البكتيرية. نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لمزامنة خلايا الكرس

.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دورة الخلية مهمة للنمو وتكرار الجينوم والتطور في جميع الخلايا. في البكتيريا ، ركزت دراسات دورة الخلية إلى حد كبير على الخلايا غير المتزامنة مما يجعل من الصعب ترتيب الأحداث الزمنية المطلوبة لتقدم دورة الخلية ، وتكرار الجينوم ، والانقسام. يوفر الهلال الكرسي نظاما نموذجيا ممتازا لدورة الخلية البكتيرية حيث يمكن مزامنة الخلايا بسرعة في حالة G0 عن طريق الطرد المركزي الكثافة. تم استخدام تجارب تزامن دورة الخلية لإنشاء الأحداث الجزيئية التي تحكم تكرار الكروموسوم وفصله ، لرسم خريطة لشبكة تنظيمية وراثية تتحكم في تقدم دورة الخلية ، ولتحديد إنشاء مجمعات الإشارات القطبية المطلوبة لانقسام الخلايا غير المتماثل. نقدم هنا بروتوكولا مفصلا للمزامنة السريعة لخلايا Caulobacter NA1000. يمكن إجراء التزامن بتنسيق واسع النطاق لتنميط التعبير الجيني ومقايسات اللطخة الغربية ، بالإضافة إلى تنسيق صغير النطاق للفحص المجهري أو فحوصات FACS. إن قابلية التزامن السريعة وإنتاجية الخلايا العالية للكولوباكتر تجعل هذا الكائن الحي نظاما نموذجيا قويا لدراسات دورة الخلية البكتيرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسيطر على دورة الخلية البكتيرية كل من تكرار الجينوم وتقسيم الخلايا الوليدة. الأهم من ذلك، كما مقاومة المضادات الحيوية تشكل تهديدا متزايدا على الصحة العامة، تقدم دورة الخلية البكتيرية هدفا غير مستغلة للتنمية المضادات الحيوية.

في بكتيريا العنيقاء crescentus، كل دورة الخلية يؤدي إلى تقسيم غير المتماثلة، مما أسفر عن خليتين ابنة مصائر مختلفة (الشكل 1A) 1،2. خلية ابنة واحدة يرث السوط وهي متحركة في حين أن ابنة أخرى يرث ساق وهي اطئة. دائرة الوراثية متكاملة تسيطر تقدم دورة الخلية ومصير الخلية عن طريق تنظيم النسخي، الفوسفات، مما يشير، والتحلل البروتيني المنظم 3. وبالإضافة إلى ذلك، وتكرار كروموسوم وخلايا ابنة العائد الفصل المتزامنة التي تحتوي بالضبط نسخة واحدة من كروموسوم 4. الأهم من ذلك، هذه أنواع الخلايا اثنين يمكن فصلها بسرعة عن طريق كولوايدال السيليكا الجسيمات كثافة الطرد المركزي في سلالة synchronizable NA1000 5-7 السماح للعزل الخلايا مخابئ عن بقية السكان مع عوائد عالية (الشكل 1B). عزل مخابئ خلايا ثم المضي قدما بشكل متزامن من خلال انقسام الخلايا غير المتماثلة. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول يستخدم لمزامنة العنيقاء سلالة NA1000. ونحن نقدم البروتوكولات ونصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها المشتركة لكلا الكبيرة والصغيرة الحجم تزامن. يوفر هذا الإجراء التجريبي أداة قوية لاستجواب السيطرة الزمانية المكانية من دورة الخلية العنيقاء ومصير الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. على نطاق واسع التزامن - الأمثل لالبقعة الغربية، ميكروأري / RNA تسلسل، وغيره فحوصات مكثفة مواد

  1. من مخزون الثلاجة أو لوحة، وتنمو 5 مل O / N ثقافة سلالة NA1000 عن طريق هز في 28 ° C في PYE المتوسطة.
  2. تطعيم 0.5 مل من الخلايا من الخطوة 1 في 25 مل من M2G (الجداول 1-2) ويهز عند 28 درجة مئوية حتى تصل الثقافة إلى OD 600 بين 0.5 و 0.6.
  3. تطعيم الخلايا في 1 لتر من M2G ويهز في 28 ° C.
  4. مرة واحدة OD 600 يصل 0،5-0،6، تأكد من وجود مخابئ الخلايا باستخدام السائل شنت المرحلة المجهري. بقعة 1 ميكرولتر من الخلايا على شريحة زجاجية، وتغطي مع انزلاق الغطاء، وصورة من المرحلة المجهري. تأكيد وجود خلايا مخابئ من خلال وضع تصور خلايا السباحة بسرعة بين السكان.
  5. تدور الخلايا لمدة 15 دقيقة في 7 kxg في 4 درجات مئوية في الدوار JA-10.
  6. تجاهل طاف وإضافة 180 مل من M2 البارد (الجداول 1-2) والدقة بلطفuspend جميع الخلايا باستخدام الماصة المصلية. تجاهل الخلايا مكعبات فضفاضة. فهي خلايا predivisional ومطاردة.
  7. إضافة 60 مل من البرد حل السيليكا الغروية (تأكد من خلط السيليكا تعليق صمغي جيدا قبل إضافة إلى الخلايا)، ومزيج تعليق خلية أيضا.
  8. صب تعليق خلية في ثمانية 30 مل أنابيب وتدور لمدة 30 دقيقة في 6.4 kxg في 4 درجات مئوية في JA-20 الدوار.
    ملاحظة: يجب للمرء أن يرى شريطين مميزة؛ الفرقة مخابئ هي أقل الفرقة بينما مطاردة / خلايا predivisional هي في أعلى الفرقة (الشكل 1B).
  9. نضح بعناية الفرقة أعلى قبالة وإزالة السائل إلى ~ 1 سم فوق الفرقة مخابئ (أقل من الفرقة).
  10. (الحرجة) باستخدام الماصة باستور، وإزالة بعناية الفرقة مخابئ ووضع في أنبوب نظيفة. ليغسل السيليكا الغروية، أعلى الأنبوب قبالة مع M2 البارد وتدور لمدة 10 دقيقة في 6.4 kxg في 4 درجات مئوية في JA-20 الدوار.
  11. تجاهل بعناية طاف و resuspendالخلايا في 20 مل من M2 البارد وتدور لمدة 10 دقيقة في 6.4 kxg في 4 درجات مئوية في JA-20 الدوار.
  12. و resuspend جميع الكريات في 30 مل من M2 البارد وقياس OD 600 باستخدام مقياس الطيف الضوئي وفارغة باستخدام البارد المتوسطة M2. حفظ 1 ميكرولتر للمرحلة التصوير للتحقق من مخابئ الخلايا. يجب أن يكون 90-95٪ من خلايا swarmers.
  13. تدور باستمرار خلايا لمدة 5 دقائق عند 6.4 kxg في 4 درجات مئوية في JA-20 الدوار. Resuspend الخلايا في 28 ° C M2G المتوسطة بحيث A 600 غير ~ 0.3-0.4 والبدء اهتزاز في 28 ° C.
    ملاحظة: غلة النموذجية هي ما بين 30 و 60ML من مخابئ ثقافة خلية من خلايا 1L غير المتزامنة.
  14. البدء في اتخاذ نقاط زمنية (لن ​​ثقافة نوع البرية تأخذ حوالي 135-140 دقائق لتقسيم) 8،9. في كل نقطة زمنية، وقياس OD 600. تأكد من أن OD 600 بعد تقسيم ما يقرب من 2X وOD الأولي 600.
  15. لالغربية لطخة أو التعبير الجيني المقايسات، وإزالة مأخوذة من 1mL من مكعبlture عند نقاط الوقت المطلوب، وتدور إلى أسفل في أقصى سرعة في جهاز للطرد المركزي الطاولة لمدة 30 ثانية، وبسرعة صب أو نضح المتوسط، وفلاش تجميد بيليه خلية في النيتروجين السائل. تخزين الخلايا عند -80 درجة مئوية حتى تحليل المصب.

2. على نطاق صغير التزامن - الأمثل للالمجهر

  1. من مخزون الثلاجة أو لوحة، وتنمو 5 مل O / N الثقافة تهتز عند 28 درجة مئوية في M2G.
  2. تمييع في 15 مل من M2G (الجداول 1-2) وتنمو حتى سجل منتصف (OD 600 = 0.5-0.6).
  3. تدور في 6.4 kxg لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في JA-20 الدوار، وresuspend في 1 مل الباردة M2 (الجداول 1-2) ونقل إلى أنبوب microcentrifuge 2 مل.
  4. تدور في 15 kxg لمدة 3 دقائق في أنبوب microcentrifuge لتكوير الخلايا، ونضح قبالة طاف، ووضع بيليه على الجليد، وresuspend في 900 ميكرولتر من M2 البارد.
  5. إضافة 900 ميكرولتر من PVP البارد المغلفة السيليكا الغروية وتدور لمدة 20 دقيقة في 15 kxg في 4 درجات مئوية في هيئة التصنيع العسكريأنبوب rocentrifuge.
  6. (الناقد) نضح أو الماصة قبالة رأس مطاردة / predivisional الفرقة الخلية وجمع أسفل مخابئ الفرقة في أنبوب microcentrifuge جديد.
  7. غسل الخلايا مخابئ مرتين في 1 مل من M2 البارد في حين الطرد المركزي في 15 kxg لمدة 3 دقائق.
  8. قبل تدور النهائي، نقل الخلايا في قبل المبردة 1 مل اختبار أنبوب زجاجي وقياس OD 600 من الخلايا مقارنة فارغة من M2.
  9. resuspend الكرية خلية النهائي إلى 28 ° C M2G في لOD بين 0،3-0،4 ويهز خلية / لفة في 28 ° C.
    ملاحظة: غلة النموذجية هي ما بين 2 و 4 مل من ثقافة الخلية مخابئ.
  10. للتجارب المجهري، في مكان المطلوب نقاط زمنية 1 ميكرولتر من الخلايا على لوحة agarose M2G للتصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تزامن عادة ينتج شريطين من الخلايا (الشكل 1B): الفرقة مخابئ، والتي لديها أعلى كثافة، ومطاردة / predivisional الفرقة خلية من أقل كثافة. لضمان وتشمل الضوابط المشتركة تزامن كفاءة مراقبة OD 600 وقياس مستويات البروتين CTRA التي كتبها طخة غربية في نقاط متميزة الوقت دورة الخلية. وOD 600 يجب زيادة بنحو 2 أضعاف خلال دورة الخلية (الشكل 2). لطخة غربية لدورة الخلية منظم سيد CTRA هو السيطرة مفيدة للتحقق من التزامن جيد (الشكل 2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دورة الخلايا البكتيرية هي عملية أساسية في الحياة وهي مهمة لدراسة النمو وكهدف للجيل التالي من المضادات الحيوية. هنا ، قمنا بتفصيل إجراءات المزامنة السريعة ل C. crescentus NA1000 ، وهو كائن حي نموذجي لدراسة دورة الخلية البكتيرية وانقسام الخلايا غير المتماثل. هذه الطريقة قابلة للتعديل إلى اللطخة الغربية ، وتوصيف التعبير الجيني ، ومقايسات الفحص المجهري الفلوري للتحقيق في التنظيم الزماني المكاني لدورة الخلية البكتيرية.

البروتوكول سريع وينتج عنه خلايا متزامنة صحية. تتطلب طرق المزامنة الأ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون أعضاء مختبر شابيرو وإيرين شريدر على التعليقات على المخطوطة. يقر المؤلفون بالدعم المالي من: زمالة ما بعد الدكتوراه في المعاهد الوطنية للصحة F32 GM100732 إلى JMS ومنح المعاهد الوطنية للصحة R01 GM51426 و R01 GM32506 إلى LS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
السيليكا الغروية المطلية ب PVP (بيركول)سيجما ألدريتشP4937
السيليكا الغروية (Ludox AS-40)سيجما ألدريتش420840
JA10 الدواربيكمان كولتر369687
JA20 الدواربيكمان كولتر334831
محلول مخلب كبريتات الحديدوزسيجما ألدريتشF0518
أنابيب الطرد المركزي 30 ملCorning8445
Na 2< / sub >HPO 4< / sub>EMDSX0720-1
KH2< / sub>PO4< / sub>VWRBDH9268-500G
NH4< / sub>ClAmresco0621-500g

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McAdams, H. H., Shapiro, L. System-level design of bacterial cell cycle control. FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).
  2. McAdams, H. H., Shapiro, L. The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry. J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).
  3. McAdams, H. H., Shapiro, L. A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space. Science. 301, 1874-1877 (2003).
  4. Ptacin, J. L., Shapiro, L. Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation. Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).
  5. Evinger, M., Agabian, N. Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells. J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).
  6. Tsai, J. W., Alley, M. R. Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway. J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).
  7. Marks, M. E., et al. The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).
  8. Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).
  9. Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division. Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).
  10. Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).
  11. Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).
  12. Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein. Cell. 84, 83-93 (1996).
  13. Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication. Methods. 48, 8-13 (2009).
  14. Degnen, S. T., Newton, A. Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus. J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).
  15. Bates, D., et al. The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle. Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).
  16. Abel, S., et al. Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle. PLoS Genet. 9, e1003744(2013).
  17. Johnson, R. C., Ely, B. Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus. Genetics. 86, 25-32 (1977).
  18. Britos, L., et al. Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus. PLoS One. 6, e18179(2011).
  19. Boutte, C. C., Crosson, S. The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment. Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CTRA

مقالات ذات صلة