يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير تستقيم من

7.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52636

⸱

مارس 13, 2015

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County

في هذه المقالة

ملخص

تسمح طريقة التصوير المستقيم الموضحة في هذا البروتوكول بالتصور التفصيلي لأقطاب ذبابة الفاكهة السوداء النامية. يوفر هذا العرض النهائي منظورا جديدا لترتيبات وأشكال أنواع الخلايا المتعددة في الظهارة المسامية.

الملخص

ذبابة الفاكهة يعطي تكوين البويضات السياق المثالي لدراسة العمليات التنموية المتنوعة نظرا لأن المبيض بسيط نسبيا في الهندسة المعمارية ، ويتميز جيدا ، وقابل للتحليل الجيني. تتكون كل غرفة بويضة من خلايا الخط الجرثومي محاطة بطبقة ظهارية واحدة من خلايا البصيلات الجسدية. تخضع مجموعات فرعية من خلايا البصيلات للتمايز خلال مراحل محددة لتصبح عدة أنواع مختلفة من الخلايا. تسمح التقنيات القياسية في المقام الأول برؤية جانبية لغرف البويضات ، وبالتالي رؤية محدودة لتنظيم خلايا البصيلات وهويتها. يصف بروتوكول التصوير العمودي تقنية تركيب تتيح رؤية رأسية جديدة لغرف البويضات باستخدام مجهر متحد البؤر القياسي. يتم تركيب العينات أولا بين طبقتين من هلام الجلسرين في وضع جانبي (أفقي) على شريحة مجهر زجاجي. ثم يتم تقطيع الهلام مع غرف البيض المغلفة إلى كتل ، ونقله إلى غطاء ، وقلببه لوضع غرف البيض في وضع مستقيم. يمكن تصوير غرف البيض المثبتة إما على مجهر متحد البؤر المستقيم أو المقلوب. تتيح هذه التقنية دراسة مواصفات خلايا الجريب ، والتنظيم ، والعلامات الجزيئية ، وتطور البويضات بتفاصيل جديدة ومن منظور جديد.

المقدمة

وقد وفرت دراسة ذبابة الفاكهة البطن رؤى كبيرة في التنظيم الجيني للمجموعة واسعة من الظواهر. على وجه الخصوص، لم يكن هناك بحوث واسعة النطاق على التنمية البيض، لأن مراحل تكوين البويضات يوفر طريقة الانقياد للتحقيق في العديد من العمليات التنموية المختلفة، بما في ذلك الزخرفة الأنسجة، والتغيرات قطبية الخلية، دورة الخلية التبديل، وتنظيم متعدية 1،2،3،4. حدث واحد morphogenic المهم خلال مراحل تكوين البويضات هي مواصفات، اكتساب القدرة على الحركة، والهجرة من مجموعة من الخلايا تسمى خلايا الحدود (استعراضها في 5). منذ الهجرة الخلية هو سمة أساسية من سمات التشكل الحيوان، ولأن التنظيم الجيني لهذه العملية يتم حفظها جيدا، وآليات تحدد في الذباب من المحتمل أن تكون مهمة في سياقات أخرى. وبالتالي، نحن نحقق في السيطرة الجزيئية للهجرة الخلايا الحدود. لدراساتنا، قمنا بتطوير طريقة جديدة لمراقبة القطبين الأمامية تطوير البيض،حيث تنشأ خلايا الحدود، لدراسة كيفية تطوير بالتفصيل.

داخل المبيض، وتوجد غرف البيض في مراحل النمو المختلفة على امتداد سلاسل دعا ovarioles، والتي المغطى في غمد رقيقة (الشكل 1A). وسيكون لكل غرفة البيض على المضي قدما لتشكيل بيضة واحدة. خلال مراحل تكوين البويضات، يجب عدة أنواع مختلفة من الخلايا تتطور بطريقة منسقة. وD. وتتكون غرفة البطن البيض من 16 خلايا خط الجرثومية، بما في ذلك بويضة واحدة، وتحيط بها طبقة واحدة ظهارة مسامي 6. تنشأ هناك عدد صغير من الخلايا المتخصصة، تسمى خلايا القطبية، في الأمامي والخلفي أقطاب ظهارة. الخلايا الحدود 6-8 تنشأ في الظهارة الأمامية للغرفة البيض، والناجمة عن الخلايا القطبية 5،7. في منتصف مراحل تكوين البويضات (المرحلة 9)، والخلايا الحدود فصل من جيرانهم وتهاجر بين الخلايا الممرضة للوصول إلى البويضة في الخلفي من الغرفة البيض 5،7. يجب إنجاز هذه الحركةبينما تبقى الخلايا الحدود في كتلة المحيطة خليتين القطبية غير متحركة، مما يجعل هذا النوع من الهجرة الخلية الجماعية. الهجرة الناجحة من الكتلة خلية الحدود يضمن التنمية السليمة للبويب من قشرة البيضة، وهو أمر ضروري للإخصاب.

الخلايا القطبية الأمامية إرشاد مصير خلية الحدود من خلال تفعيل شلال نقل الإشارة. الخلية القطبية تفرز السيتوكينات، المفردة (UPD)، التي تربط لمستقبلات عبر الغشاء، Domeless (القبة)، وعلى خلايا بصيلات المجاورة خلال المرحلة 8 من تطوير بويضة 8،9. ربط UPD يسبب يانوس التيروزين كيناز (JAK) إلى الفوسفات ومحول الإشارات والمنشط من النسخ (STAT) 8،10،11. STAT ثم ينتقل إلى النواة لتفعيل النسخ. خلايا الحدود بطيئة (SLBO) هو عامل النسخ هذا هو الهدف النسخي المباشر للSTAT ومطلوب أيضا للهجرة الخلايا الحدود 12. إطلالة جانبية على غرف بيضة تشير روينظم قبعة النشاط STAT في التدرج عبر الظهارة الأمامية 8،11،13. خلايا بصيلات الأقرب إلى الخلايا القطبية وتحتوي على أعلى مستويات تنشيط STAT، وبالتالي فإنها تصبح خلايا الحدود وتغزو الأنسجة خط الجرثومية المجاورة.

أن نفهم كيف يتم تحديد الخلايا الحدود داخل وفصل من ظهارة، نحن بحاجة لمراقبة كيفية تنظيم الأنسجة. وإذا نظرنا إلى غرف البيض من منظور الأمامي على ذلك، فإننا نتوقع التماثل شعاعي من النشاط STAT في خلايا بصيلات المحيطة الخلايا القطبية. ومن شأن نهاية على وجهة نظر أيضا تظهر بشكل أكثر دقة الاختلافات في بروتينات الغشاء واجهات خلية خلية قبل وأثناء مفرزة من مقارنة الخلايا في طائرات التنسيق المختلفة. لأن غرف البيض هي مستطيل وتعلق على بعضها البعض من خلال خلايا ساق، يحلون على الشرائح أفقيا، مما يجعل من الصعب مراقبة العمارة الأمامية. وبالتالي، الكثير من المعلومات عن الخلايا في القطبين من الغرفة بيضة لهاتم استنتاجها من وجهات نظر الاطراف. ورغم أن بعض المعلومات التي يمكن الحصول عليها من خلال حسابي اعادة البناء 3-D من المقاطع البصرية، تشتت الضوء، photobleaching من، وحدود الفقيرة القرار في محور Z جعل هذه المعلومات أقل تفصيلا ويمكن الاعتماد عليها في غياب تقنيات باهظة الثمن مثل فائقة قرار المجهري 14 . أنواع أخرى من التصوير القائم على القسم (على سبيل المثال، المجهر الإلكتروني أو مشراح باجتزاء) تتطلب التلاعب واسعة من الأنسجة، بما في ذلك الجفاف، مما يزيد من احتمال عن القطع الأثرية. وهكذا، قمنا بتطوير طريقة جديدة لصورة D. غرف البطن البيض في حين تستقيم. هذه الطريقة أثبتت بالفعل مفيدة في توضيح كيفية الحظ خلايا متحركة (انظر ممثل النتائج ومانينغ وآخرون، قيد الاستعراض)، ومن المرجح أن يكون أكثر قيمة على نطاق واسع في الدراسات لجوانب أخرى من مراحل تكوين البويضات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تشريح Ovarioles

  1. نقل حوالي خمسة عشر الذباب الإناث القديمة 2-4 يوما وعدد قليل من الذكور لذبابة القارورة الغذاء الطازج مع إضافة الخميرة الجافة النشطة. استخدام القطن باعتبارها المكونات لقارورة، وإضافة بضع قطرات من الماء إلى القطن للحفاظ على رطوبة عالية.
  2. مكان قارورة في C حاضنة 25 درجة ل14-16 ساعة لتحقيق أقصى قدر من عدد من المرحلة 8-10 غرف البيض.
    ملاحظة: فترة حضانة يختلف باختلاف درجة الحرارة والمرحلة المطلوبة.
  3. إعداد وسائل الاعلام تشريح، 0.1M KPO 4 و NP40 الحلول حسب الحاجة لليوم التالي (انظر المواد).
  4. تخدير الذباب باستخدام CO 2، ووضع تحت المجهر تشريح. الماصة عدة قطرات من وسائل الإعلام تشريح في كل تجويف في الشريحة الزجاجية الاكتئاب.
  5. عقد ملقط في كل يدوية على ما يقرب من 30 درجة زاوية إلى الأعلى الطاولة وتوجيه ذبابة واحدة أنثوية الأجنحة إلى أسفل. مع جهة غير المهيمنة الخاص بك، والتقاط الأنثى باستخدام ملقط، واستيعاب لها في لnterior من البطن، بالقرب من القفص الصدري، وغمر لها في وسائل الإعلام تشريح في الشريحة الاكتئاب (الشكل 1A الشكل).
  6. مع زوج آخر من ملقط، فهم الهيكل الخارجي في الخلفية البطنية من البطن ويخترق من خلال. الاستيلاء على المبايض في نهاية الخلفي، ثم سحب لهم للخروج من البطن ووضعه في وسائل الإعلام الطازجة على الجانب الآخر من الشريحة الاكتئاب. (الشكل 1A الشكل). تجنب سحب بعيدا القناة الهضمية. تجاهل الذبيحة.
  7. كرر مع غيرها من الذباب الإناث حتى يتم تشريح جميع المبايض. تجاهل الذكور.
  8. مع زوج واحد من ملقط، عقد المبيض في نهاية الخلفي (بالقرب من أكبر غرف البيض)، وباليد الأخرى استخدام زوج من ملقط لقرصة إحدى الغرف البيض الأكثر الأمامية (germarium). (الشكل 1A).
  9. ببطء ولكن بثبات، وسحب سلسلة ovariole من غمد المبيض. الاستمرار في تشريح خارج ovarioles بشكل فردي حتى كل غرف البيض المرجوة هي صemoved.
  10. كرر الخطوات من 1،7-1،8 لجميع المبيضين تشريح.
  11. مرة واحدة كاملة، ونقل ovarioles إلى أنبوب 0.6ml باستخدام ماصة نقل البلاستيكية.
  12. السماح ovarioles تستقر في قاع الأنبوب، ثم الانتقال إلى تحديد وتلطيخ الخطوات.

2. مناعي (IF) تلون Ovarioles

  1. إزالة بعناية وسائل الإعلام من تشريح ovarioles مع ماصة. تأكد من عدم إزالة أي ovarioles أو غرف البيض. ترك ما يقرب من 50 ميكرولتر من ovarioles وسائل الإعلام تشريح.
  2. إضافة 50 ميكرولتر من 16٪ بارافورمالدهيد إلى 150 ميكرولتر من 0.1 M KPO 4 العازلة في أنبوب، وإضافة حل لغرف البيض لاصلاحها. احتضان بينما هزاز لمدة 10 دقيقة. تنبيه: بارافورمالدهيد هي سامة.
  3. إزالة تثبيتي، وشطف مرتين مع 0.5 مل غسل العازلة NP40.
  4. غسل مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما في RT.
  5. الرجوع إلى معيار IF بروتوكول 15 لخطوات لاحقة.
    1. لفترة وجيزة، وبعد التثبيت، إضافةالأجسام المضادة الأولية في التخفيفات المناسبة واحتضان O / N عند 4 درجات مئوية. يغسل في NP40 عدة مرات، ثم يضاف الأجسام المضادة الثانوية (1: 200 التخفيفات).
    2. يغسل عدة مرات في NP40، ثم إضافة دابي (1: 1،000) لمدة 10 دقيقة، ثم كرر يغسل. مرة واحدة IF البروتوكول هو كاملة، إضافة 200 ميكرولتر من 50٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني لغرف البيض وترك الجلوس في RT لمدة 2 ساعة.
    3. إزالة حل، يحل محله مع 70٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني، وتغطي مع احباط. وضع العينة في 4 ᵒC حتى جاهزة للتركيب. وفي الوقت نفسه، تواصل مع الخطوة 3.

3. إعداد المسبق من الغليسرين جيلي الشرائح

  1. قياس لا يقل عن 4 مل من الجليسرين جيلي باستخدام ملعقة وملء أنبوب ثقافة الخلية الزجاج إلى علامة منتصف الطريق. تذوب الجلسرين جيلي في حمام مائي عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. صب قطرة صغيرة من الجلسرين، ما يقرب من 300 ميكرولتر من محلول المخزون على شريحتين المجهر. باستخدام الأنسجة، وتنتشر في الجلسرين رقيقة لاYER عبر كل الشرائح. هذا يوفر قاعدة ويسمح لسهولة إزالة من الجلسرين جيلي في خطوة 5.6.
  3. قطع رأس الخروج من تصفيتها 1،000 ميكرولتر ماصة. استخدام قطع ماصة لنقل 1،000-1،500 ميكرولتر باب الحارة جيلي الجلسرين ببطء إلى كل شريحة المجهر. احرص على منع الفقاعات.
  4. السماح الشرائح الجلسرين جيلي الجلوس لمدة 5 دقائق على RT لتعيين.
  5. وضع كل شريحة الجلسرين جيلي في 60 مم × 15 مم طبق بتري، وتغطي مع غلاف بلاستيكي. مكان في 4 درجات CO / N. اختياريا، متجر الجليسرين الشرائح جيلي لمدة تصل إلى 5 أيام في 4 درجات مئوية.

4. تصاعد غرف البيض

  1. باستخدام عينات من الخطوة 2.5، ماصة عدة قطرات 3 ميكرولتر من غرف البيض في 70٪ الجلسرين عبر الجلسرين واحد جيلي الشريحة. مواصلة pipetting ل3 قطرات ميكرولتر حتى كل غرف البيض هي على هذه الشريحة. تأكد من كل قطرة يحتوي على الأقل عشرة غرف البيض. وفي الوقت نفسه، حرارة أنبوب ثقافة الجلسرين جيلي في 55 ° C حمام الماء.
  2. ضع الشريحة الجلسرين جيلي مع الغرف البيض تحت المجهر تشريح. ضبط التكبير بحيث قطرة واحدة فقط من غرف البيض في مجال الرؤية (الشكل 1B).
  3. باستخدام إبرة قياس 30 كما ملعقة، والتقاط غرفة مرحلة البيض المطلوب. عند الضرورة، منفصلة غرف البيض المرجوة من سلسلة ovariole باستخدام إبرة بمثابة سكين.
  4. لتجنب الحطام التي قد تتداخل مع التصوير، ونقل غرفة البيض إلى الشريحة الثانية الجلسرين هلام، ومع الأمامية التي تواجه اليسار (الشكل 1E -1). كرر حتى هناك اصطف لا يقل عن سبعة غرف البيض يصل في عمود (الشكل 1C).
  5. تشكيل أعمدة جديدة من سبع حتى يتم نقل جميع غرف البيض المطلوب إلى الشريحة الثانية الجلسرين جيلي.
  6. تمزيق قطعة صغيرة من الأنسجة وتطور. استخدم هذا لامتصاص فائض PBS-الجلسرين من غرف البيض عن طريق لمس طفيفة كل واحد. الحرص على عدم إزالة غرف البيض.
  7. قطعغيض من تصفيتها 200 ميكرولتر ماصة. استخدم هذا لنقل 150 ميكرولتر من الجلسرين جيلي لتغطية كافة الأعمدة من غرف البيض.
    ملاحظة: ويستند كمية من الجلسرين جيلي اللازمة لتغطية الأعمدة على البيض مراحل الغرفة وعدد من الأعمدة. ويمكن تعديل المبلغ.
  8. السماح غرف البيض شنت الجلوس لمدة 5 دقائق على RT حتى الطبقة العليا من الجلسرين جيلي وطدت تماما (1D الشكل).
  9. مكان الشريحة من غرف البيض شنت في 60 مم × 15 مم طبق بتري، وتغطي مع غلاف بلاستيكي. تخزينها في 4 درجات CO / N للسماح للطبقات الجلسرين جيلي ليصلب معا (مكان في الظلام إذا كان هناك قلق حول photobleaching من).

5. إعداد غرف البيض للتصوير

  1. ضع الشريحة من غرف البيض شنت تحت المجهر تشريح. ضبط التكبير بحيث عمود واحد فقط من غرف البيض في مجال الرؤية.
  2. باستخدام مشرط مصغرة بزاوية 45 درجة، وقطع straigخط حزب التحرير على طول الجانب الأيمن من العمود الأول من غرف البيض (وثيقة إلى الجانب الخلفي من غرف البيض). (الشكل 1D-E)
  3. المقبل، وقطع فوق أول غرفة البيض في أعلى وأسفل مشاركة الغرفة البيض في العمود. عند هذه النقطة يجب أن تقطع العمود الغرف البيض من ثلاث جهات.
  4. باستخدام microknife، شريحة على طول الجانب الأيسر من العمود، في أقرب وقت ممكن إلى الجانب الأمامي من غرف البيض (الشكل 1E -3).
  5. ماصة 100 ميكرولتر من البرد 1X PBT على عمود قطع.
  6. استخدام ملعقة فوز جولة لإزالة هلام الجلسرين الزائدة حول ثلاثة جوانب من العمود قطع من غرف البيض وتجاهل، وترك الباقي على الشريحة.
  7. تضاف ملعقة في خفض التي قدمت في الجانب الأمامي من غرف البيض وفصل عمود من كتلة الجلسرين جيلي الابتدائي.
  8. إعداد العينات إما مقلوب (5.8.1) أو تستقيم (5.8.2) المجهري.
    1. لمقلوب المجهر: نقل Tانه عمود من غرف البيض إلى ساترة مع الجانب الأمامي من غرف البيض أسفل. كرر الخطوات من 5،2-5،8 حتى يتم إزالة كافة الأعمدة من الجلسرين معقود الفواكه وتحميلها. إضافة بضع قطرات من 50٪ PBS-الجلسرين على كل كتلة من غرف البيض لمنعهم من الجفاف. غرف الصورة البيض مباشرة على ساترة.
    2. لالمجهر تستقيم: نقل عمود من غرف البيض إلى شريحة المجهر مع الجانب الأمامي مواجهة. كرر الخطوات من 5،2-5،9 حتى يتم إزالة كافة الأعمدة من الجلسرين معقود الفواكه والتي شنت على شرائح المجهر. إضافة بضع قطرات من 50٪ PBS-الجلسرين على كل كتلة من غرف البيض وكتل غطاء مع # 1 ½ ساترة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يسمح طريقة التصوير تستقيم لنا أن نرى بشكل مباشر على تنظيم الخلايا في ظهارة مسامي الأمامية في مرحلة 8. علامة العامة للمصير الخلايا المسام، وغابت عيون (EYA) بروتين، وكذلك DNA علامة النووية دابي، وأظهر حتى التعبير عبر هذا المجال من الخلايا، وأثبتت أن جميع الخلايا يمكن أن ينظر إليه مع شدة تلطيخ مماثلة (الشكل 2B "). البروتينات تنظم ردا على UPD خلوى، ومع ذلك، أظهر أنماط المتغيرة ومستويات التعبير. الخلية القطبية تطلق UPD apically قبل هذه المرحلة من تطور البويضة

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نحن هنا تصف طريقة لتركيب وصورة صغيرة، وتطوير غرف البيض من منظور نهاية جرا. يتم تحسين أساليب مشتركة لغرف البيض التصوير وجهات النظر الجانبية وتسمح في المقام الأول التصور الدقيق للخلايا بصيلات ميديو الاطراف عندما ملطخة الأجسام المضادة الفلورسنت. استخدام Z-مداخن أو 3-D إعادة البناء يساعد في عرض طائرات التنسيق متعددة، ولكن لا يزال غير كاف لقرار الفرعية الخلوي للأقطاب الدوائر البيض بيضاوي الشكل (الشكل 2D). في حين أن هذا يمكن التغلب عليها جزئيا مع أحدث تقنيات الفحص المجه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

نحن نقدر المساعدة المقدمة من أعضاء مجتمع الذباب ، ولا سيما الدكتورة دينيس مونتيل ، والدكتورة لين كولي ، والدكتور بيرنيل رورث ، للكواشف. نشكر Flybase ، ومركز Bloomington Tذبابة الفاكهة ، وبنك الدراسات التنموية Hybridoma على المعلومات وتوفير مخزون الذباب والأجسام المضادة ، على التوالي. يتم دعم LM من قبل منحة وزارة التعليم ، وزمالة تدريب مساعدة الخريجين في مجالات الاحتياجات الوطنية (GAANN) (P200A120017) ومن خلال مبادرة NIGMS لتعظيم منحة تنمية الطلاب (2 R25-GM55036). تم دعم جزء من أعمال الفحص المجهري من خلال منحة التصوير بالرنين المغناطيسي NSF DBI-0722569 ومرفق Keith R. Porter Core Imaging Facility. تم دعم البحث جزئيا من خلال جائزة NSF CAREER (1054422) وجائزة Basil O'Connor Starter Scholar من March of Dimes ، وكلاهما منح ل MSG.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.1 M عازلة فوسفات البوتاسيوم (KPO4 Buffer)أضف 3.1 جم من NaH2PO4• H2O و 10.9 جم من Na2HPO4 (اللامائية) إلى H2O المقطر لتكوين حجم 1 لتر. سيكون الرقم الهيدروجيني للمحلول النهائي 7.4. يمكن تخزين هذا المخزن المؤقت لمدة تصل إلى شهر واحد عند 4 درجات مئوية.
محلول مائي 16٪ بارافورمالدهايد ،علوم المجهر الإلكترونيEM 15710خالية من الميثانول للحفاظ على مضان GFP
30G × 1/2 بوصة إبرة   ؛VWRBD305106شطبة منتظمة
الخميرة الجافة النشطةجينيسي العلمية62-103لتسمين إناث الذباب
الأبقار مصل الألبومينPAA-cell استزراع شركةA15-701المستخدمة في NP40 Wash Buffer
Dumont # 5 FulpsFine ScienceTools 11295-10سبيكة Dumostar ، طرف بيولوجي ؛ نصائح حادة ضرورية لتشريح
المبيضDAPI (4 & prime ؛ ، 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)Sigma AldrichD95425 مجم / مل محلول مخزون   ؛  
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Life Technologies16140-071يضاف إلى وسيط تشريح المكملات الغذائية (10٪)  
أنبوب ثقافة الزجاجVWR47729-57614 مل
الاكتئاب الزجاجي VWR470019-0201.2 مم سميكة ، جيلي الجلسرين مزدوج التجويف
  ؛علوم المجهري الإلكترون17998-10تصاعد وسائل الإعلام
الجلسرينIBI العلميةIB15760 70٪ في PBS
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI3021-500ML(قابل للتبديل ل Nonidet P-40)   تستخدم في NP40 Wash Buffer   ؛
Leica مجسم الفلورسنت  Leica Microsystems
Leica SP5 مجهر متحد البؤرLeica Microsystems40x / 0.55NA هدف جاف  
صغيرة VWR82027-518من الفولاذ المقاوم
VWR16004-36875x25x1 مم
NP40 Wash Buffer50 mM TRIS-HCl ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.5٪ إيبيجال ، 1 مجم / مل BSA ، و 0.02٪ أزيد الصوديوم
بنسلين - ستربتومايسين - جلوتامينلايف تكنولوجيز10378-016يضاف إلى وسط تشريح المكملات الغذائية (0.6X)
Petridish- البوليسترين ، معقمVWR82050-54860 واط × 15 ارتفاع مم
عازلة الفوسفات الملحيةSigma AldrichP3813-10PAK10 عبوات من مسحوق
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةSigma AldrichP3786-500Gالمستخدمة في 0.1 M KPO4< / sub> Buffer  
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةSigma AldrichP9791-500Gالمستخدمة في 0.1 M KPO4< / sub> Buffer  
[header]
Schneider' s تقنيات الحشرات متوسطةالعمر
11720018		مع L-الجلوتامين وبيكربونات الصوديوم
أزيد الصوديومSigma AldrichS2002-25Gالمستخدمة في تلطيخ الأجسام المضادة الفلورية
كلوريد الصوديومSigma AldrichS3014-500Gالمستخدمة في NP40 Wash Buffer
TRIS-HClIBI ScientificIB701441 M TRIS-HCl ، درجة الحموضة 7.4
Volocity 3D Image برنامج التحليلPerkinElmerلمعالجة مكدسات Z متحدة البؤر
من الدرجة شرائح ملعقة شريحة مجهر للصدأ

المراجع

  1. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  2. Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
  3. Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
  4. Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
  5. Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
  6. Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
  7. Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
  8. Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
  9. Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
  10. Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
  11. Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
  12. Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
  13. Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
  14. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
  15. McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
  16. Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
  17. Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
  18. Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
  19. Rørth, P., et al. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila). Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).
  20. Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
  21. Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
  22. Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
  23. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
  24. Belu, M., et al. Upright imaging of Drosophila embryos. J Vis Exp. (43), (2010).
  25. Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التصوير تستقيم من
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.