الفئران، نظرا لحجمها، وتوافر، وسلوكها سهلة الانقياد بدلا من ذلك، وقد استخدمت كنموذج البحث لسنوات عديدة. والهدف من هذا البروتوكول هو الاستفادة من الفئران باعتبارها الجلد الجرح نموذج الشفاء الدماغية لتوفير معلومات قيمة حول الفيزيولوجيا المرضية من الجروح المزمنة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مظاهرة في الجرذان الدماغية الجلد الجرح نموذج
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الميل للجروح المزمنة في البشر يزيد مع الشيخوخة، والحالات المرضية مثل مرض السكري ووظيفة القلب الوعائية ضعف، والضغط غير مرتاح بسبب الجمود. وقد تم تطوير نماذج حيوانية أن محاولة لتقليد هذه الظروف لغرض تعزيز فهمنا للتعقيد الجروح المزمنة. نموذج الموصوفة هنا هو فأر الجلد الدماغية نموذج رفرف الذي يسمح بتخفيض فترة طويلة من تدفق الدم مما أدى إلى الجروح التي تصبح الدماغية وتشبه النمط الظاهري المزمن الجرح (خفض الأوعية الدموية، وزيادة الالتهابات وتأخر إغلاق الجرح). وهو يتألف من رفرف الظهرية bipedicled مع 2 الجروح الدماغية وضعها مركزيا و2 الجروح غير الدماغية الوحشي للرفرف والضوابط. وثمة إضافة جديدة لهذا الدماغية نموذج رفرف الجلد هو وضع ورقة سيليكون تحت رفرف التي تعمل كحاجز وجبيرة لمنع إعادة التوعي والحد من انكماش مثل التئام الجروح. وعلى الرغم منمناقشة باستخدام الفئران لالتئام الجروح الدراسات بسبب الاختلافات التشريحية والفسيولوجية واضحة تماما وذلك مقارنة مع البشر (أي وجود العضلات السبلة العضلية، القصير العمر، وزيادة عدد بصيلات الشعر، وقدرتها على شفاء الجروح المصابة) التعديلات العاملين في هذا النموذج جعله بديلا قيما لنماذج رفرف الجلد الدماغية التي سبق وضعها.
المقدمة
تطوير العقاقير الفعالة وغيرها من التئام الجروح العلاجات تتطلب المناسبة في نماذج الجسم الحي، على الرغم من المشاكل المعروفة في ترجمة النتائج في نماذج حيوانية لعلاج الإنسان 1. ما يلي هو وصف لبروتوكول مفصلة لاستخدام نموذج الفئران من الجلد الدماغية التئام الجروح للتحقيق في الآليات التي تعزز فهم المرضية التئام الجروح. أنواع الفئران، وغالبا ما يعملون، نظرا لتوافر واسعة، وحجم ويستخدم طبيعة منصاع للدراسات التئام الجروح كما أنها كبيرة بما يكفي لتوفير مساحة الجلد مناسبة للجرح الجراحي واستئصالية، والتصوير وجمع الأنسجة 2. ومع ذلك فإنه ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار حذرا أن الجلد من الفئران والإنسان تختلف تشريحيا، مع الفئران التي أشار إليها الحيوانات فضفاضة البشرة كما. هذه سمة مميزة تسمح الجرح الانكماش، بدلا من الاندمال بتشكل النسيج الظهاري للمساهمة بشكل كبير في إغلاق الجلد الفئران ثounds 2. بالإضافة إلى ذلك، فإن وجود تحت الجلد السبلة العضلات عضلية في الفئران، ويسهم في الشفاء من قبل كل من انكماش الكولاجين وتشكيل 3،4. واعتبرت هذه الفروق التشريحية مهمة جدا في تطوير الفئران الدماغية نموذج الجرح الجلد ونفذت تعديلات محددة لخفض الجرح انكماش وتقليص نفوذ السبلة العضلية في العضلات 5.
في تقرحات القدم السكرية، وقرحة الساق الوريدية، وقرحة الضغط، تأخر الشفاء وتعتبر هذه الجروح المزمنة. وتتميز الجراح التي التهاب المفرط، والذي يمنع الجرح من التقدم إلى مراحل المقبلة من إصلاح الجرح 6. واحدة من العوامل الرئيسية في تطوير الجرح المزمن هو نقص التروية محلية الأنسجة (انخفاض تدفق الدم) 5 المساهمة في عدم القدرة على مسح الالتهاب. في الوقت الذي كان يجري تطوير هذا النموذج والتحقق من صحتها (في 2003-4)، لم تكن هناك نماذج حيوانية الموحدة التي يمكن أن توفر ما يكفي من الأنسجة لاختبار تحريض الأوعية الدموية في السرير الجرح، مرحلة أساسية خلال العادي التئام الجروح والدافع لتطوير هذا النموذج 5. ومع ذلك، فإن النموذج المقدم هنا هو تعديل للنموذج الجرح الدماغية ووصف في الأصل من قبل شوارتز وآخرون. (7) وبعد ذلك تستخدم في شكل معدل تشن وآخرون. 8
في النموذج الجرح الدماغية المعدلة، تم إجراء تغييرات للتحايل على الخصائص التشريحية المذكورة أعلاه من الفئران التي تؤدي إلى الشفاء من الانكماش بدلا من الاندمال بتشكل النسيج الظهاري: (1) يتم إنشاؤها اثنان بجروح استئصالية كاملة سمك ضمن bipedicled رفرف الجلد الظهرية و تتم إزالة العضلات عضلية السبلة من الجرح سرير من تشريح فقط فوق اللفافة العضلية. (2) رفرف نفسها له أبعاد أكثر ضيقة، وضمان أن إمدادات الدم هو عشوائي والجروح التي تقع في منتصف رانه لنقص تروية رفرف. تم إدراج (3) ورقة سيليكون تحت رفرف، ومنع readherence وضخه من رفرف من الأنسجة الكامنة وراءها. انكماش الجرح محدودة (لم يكن القضاء عليها) من خلال ترسيخ أو خياطة رفرف إلى ورقة سيليكون 5.
وقد تم مؤخرا استخدام النموذج في الدراسات التي تتراوح بين الآثار بالأكسجين تحت الضغط على الجرح الدماغية الشفاء 9،10 إلى نقص تروية التئام الجروح في الشباب الذين تتراوح أعمارهم بين 11 مقابل الفئران وثبت أن تكون نموذجا يمكن الاعتماد عليها من نقص تروية الأنسجة لفترة طويلة. كما تم تكييفها أبعاد رفرف bipedicled لسلالات الفئران مختلفة، بما في ذلك سبراغ داولي (11 سم طولا و 2 سم واسعة) والجرذان F344 (10.5 سم طولا و 3.0-3.5 سم واسعة) وغيرها من الأنواع، بما في ذلك الخنازير 12 والفئران 13،14. هذا الفيديو ويستخدم F344 سلالة الفئران الفطرية في المظاهرة من نقص تروية نموذج الجرح الجلد.
كان الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الواردة أدناه حصول علىإد من جامعة جنة رعاية الحيوان جنوب ولاية فلوريدا (IACUC) والالتزام بجميع متطلبات قانون رعاية الحيوان ودليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على الموافقة لجميع الإجراءات الحيوانية الواردة أدناه من جامعة جنة رعاية الحيوان جنوب ولاية فلوريدا (IACUC) والالتزام بجميع متطلبات قانون رعاية الحيوان ودليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية: ملاحظة.
1. إعداد ورقة سيليكون والأدوات الجراحية
- شرائط قبل القطع (10.5 سم × 3.0 سم) من غير عززت 0.01 سمك، سيليكون الصف الطبية والأغطية وتعقيم باستخدام الأوتوكلاف.
- تنظيف وتعقيم الأدوات الجراحية المناسبة (مقص، ملقط وستائر أو المناشف لإنشاء حقل معقمة أثناء الجراحة).
2. حيوانات التجارب
- استخدام الذكور البالغين أو إناث الفئران وزنها في نطاق 250-350 ز تم الحصول عليها من مربي التجاري. إذا تستخدم الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين، ينبغي أن تكون ≥350 ز من أجل ضمان البقاء على قيد الحياة أفضل بعد الجراحة. قبل بداية أي تجارب تأقلم جميع الحيوانات على الأقل7 أيام في ظل ظروف قياسية من الضوء الظلام دورة 12 ساعة مع الغذاء والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.
3. التخدير، تسكين ما قبل الجراحة وإعداد المنطوق
- لحث التخدير العام باستخدام الأيزوفلورين في 3٪ -4٪ عن طريق غرفة الاستقراء والحفاظ على (عبر استخدام مخروط الأنف) بنسبة 1٪ -2٪ مع O 2 أثناء إعداد الجلد والجراحة. رصد عمق التخدير عن طريق الملاحظة من معدل وعمق التنفس، قرصة بين الأصابع أو الجفني المنعكس طرفة.
ملاحظة: في هذا الوقت، يمكن وضع مرهم التعليم والتدريب المهني على العيون لمنع جفاف في حين أن الحيوان هو تحت التخدير. - في منطقة نائية موقع من منطقة العمليات الجراحية المعقمة، ووضع الفئران في وضعية الانبطاح وحلق ظهر مع كليبرز من قاعدة الرقبة إلى أسفل حوالي 11 سم. مرسام مع علامة دائمة، الخطوط العريضة ل3.0 سم x 10.5 سم رفرف (انظر الشكل 1A).
- نقل الفئران إلى surgica نظيفة، والمعينمنطقة لتر مجهزة سادة التدفئة المعتمدة والستائر الجراحية المعقمة أو المناشف. حقن 5 ملغ / كغ كيتوبروفين تحت الجلد قبل أول شقوق جراحية لإدارة الألم. سوائل إضافية (المالحة) يمكن أن يعطى (تصل إلى 5 سم مكعب) تحت الجلد حسب الحاجة.
- تحضير البشرة مزيدا من ينظف أولا مع 70٪ ايزوبروبيل والثانية مع 0.2٪ الكلورهيكسيدين، ثم تطبيق الستائر العقيمة لإنشاء حقل العقيمة. ويمكن أيضا أن 10٪ بوفيدون اليود (بتدين) يمكن استخدامها.
ملاحظة: مضاد حيوي (الأمبيسلين في 15 ملغ / كلغ) يمكن أن تدار تحت الجلد، ولكن إذا تم استخدام تقنيات العقيم جيدة ليس هو مطلوب منها.
4. إنشاء الجروح استئصالية وBipedicled رفرف
- باستخدام معقمة، يمكن التخلص منها 6 مم أداة خزعة لكمة، وإنشاء اثنين دائرية الجروح "الدماغية" في وسط منطقة رفرف المعينة (الشكل 1B). يجب أن يكون عمق الجرح أسفل إلى (ليس من خلال) اللفافة الكامنة وراء carno السبلةالعضلات سوس (الشكل 1B الشكل).
- باستخدام ملقط رفع الجلد في منتصف مخطط الجرح التي أنشأتها خزعة لكمة ومن ثم استخدام مقص القزحية (مع نصائح المنحنية) لاستئصال قطعة دائرية من نسيج (بما في ذلك العضلات عضلية السبلة). سوف تكون النتيجة سمك الكامل الجرح مع لفافة كقاعدة للجرح.
ملاحظة: الأنسجة استئصاله (المقابس الجرح) يمكن المفاجئة مجمدة في النيتروجين السائل أو ثابتة في 10٪ O-مخزنة الفورمالين / N للتجهيز لاحق عن السيطرة، والجلد العادي. - إنشاء رفرف bipedicled بجعل شقوق مع مشرط معقم على كل جانب من الجروح الدماغية على طول الخطوط المرسومة مسبقا (الشكل 1C) التي هي 10.5 سم في الطول و 3.0 سم عن بعضها البعض. يجب أن يكون عمق الشقوق وصولا الى العضلات paraspinous. باستخدام مقص القزحية، فصل لفافة السبلة العضلية من العضلات paraspinous، والحرص للحفاظ على لفافة سليمة مثل "القاعدة" من مم اللكمات 6 (Figure 1D).
- خذ 1 معقمة ورقة سيليكون قبل قطع ووضعها في بين لفافة السبلة العضلية والعضلات paraspinous (الشكل 1E) التأكد من أن ورقة لا ربط حزام الأمان أو طيها. باستخدام السوداء، خيوط غير قابل للامتصاص (حجم 4.0) إغلاق كل من شقوق خلال ترسيخ ورقة سيليكون على الجلد مع لا يقل عن 8 توقف غرز على كل جانب، على طول رفرف (الشكل 1F و1G).
- باستخدام العقيمة، خزعة يمكن التخلص منها أداة لكمة، وإنشاء اثنين من السيطرة الجروح الداخلية "غير الدماغية" (وصولا الى الواجهة الأمامية للعضلة عضلية السبلة) 1 سم الوحشي على الجروح الدماغية على جانبي رفرف (الشكل 1G).
- وضع مسطرة أدناه الجروح والتقاط الصور الرقمية لأغراض قياس الجرح (انظر الشكل 3A). في هذا الوقت، وتدفق الدم (التروية) يمكن رصدها عن طريق استخدام الليزر دوبلر أو معالجات أخرى (التنسيب المخدرات الموضعية) التي يؤدونها.
- تطبيق لاصقة السائل وافق كل من الجمجمة والذيلية للالجروح وفيلم شفافة خلع الملابس للحفاظ على بيئة الجرح رطبة ونظيفة (عقيمة). ويمكن وضع لخلع الملابس إضافي في نهاية الذيلية للرفرف لمنع الحيوانات من إزالة الغرز الأكثر الذيلية.
5. إجراءات ما بعد المنطوق
- وضع الحيوانات في أقفاص (يضم منفردة) مجهزة مغذيات الضحلة وذلك لمنع موقع الجراحية من فرك ضد وحدة التغذية. لا ينبغي أن تترك الحيوانات غير المراقب أو إعادتها إلى الشركة من الحيوانات الأخرى حتى يستعيد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية وعرض حركة هادفة. يجب وضع الحصير التدفئة أقل من نصف القفص لمدة تصل إلى 2 أيام خلال الانتعاش.
- لإدارة الألم بعد العملية وإدارة كيتوبروفين (5 ملغ / كلغ) تحت الجلد للحيوانات الصباح و1X في اليوم التالي لمدة تصل إلى 48 ساعة بعد الجراحة. وينبغي أيضا مراقبة الحيوانات يوميا لعلامات طويلة من الألم، وفقدان الوزن أو التهابات الموقع الجراحية.
6. القياسات الجرح اللاحقة والتغييرات خلع الملابس
- قياس الجروح الدماغية وغير الدماغية في كثير من الأحيان تحت التخدير العام باستخدام الأيزوفلورين في 3٪ -4٪ عن طريق غرفة الاستقراء وحافظت (عبر مخروط الأنف) بنسبة 1٪ -2٪ مع O 2 كما في الخطوة 3.1.
- إزالة خلع الملابس بلطف حتى لا سحب لاصقة من الجلد. في هذا الوقت يتم أخذ الصور الرقمية إضافية لقياسات الجرح، والعلاجات الموضعية إعادة تطبيق، التصوير دوبلر الليزر (LDI) أو معالجات أخرى أجريت لتلائم الاحتياجات المحقق.
- تطبيق لاصق وخلع الملابس نظيفة والسماح للحيوان لاسترداد كما في الخطوة 5.1.
7. الجرح جمع والقتل الرحيم
- الدماغية الحصاد والجروح غير الدماغية (في الأيام يرى المحقق المناسب) في حين أن الحيوان هو تحت التخدير العام باستخدام الأيزوفلورين بنسبة 3٪ -4٪ عن طريق دائرة الهجرة والجنسيةغرفة uction وحافظت (عبر مخروط الأنف) بنسبة 1٪ -2٪ مع O 2 كما في الخطوة 3.1.
- باستخدام مشرط، وجعل الختان على شكل مربع حول الجرح لتشمل بعض الأنسجة السليمة حول الجرح. وضع الختان إلى 1.5 مل المفاجئة أنبوب سقف والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل (مخزن في -80 ° C) للتحليل الجزيئي في المستقبل أو احتضان في 10٪ من الفورمالين مخزنة O / N في RT لمعالجة النسيجي.
ملاحظة: يمكن أيضا قطع الختان الجرح في نصف لتوفير مزيد من العينات لتحليلها. - بعد إزالة الأنسجة الجروح، والموت ببطء الحيوان باستخدام أسلوب معتمد من CO 2 الاستنشاق.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بروتوكول الفئران الدماغية الجرح نموذج الشفاء يجب أن تأخذ حوالي 20 دقيقة لكل حيوان إذا أجريت بكفاءة. قبل تطبيق خلع الملابس نموذج يجب أن تظهر ممثلة في الشكل 1G. وسيكون من المهم للتحقق من أن رفرف والجروح bipedicled هم فيه الدماغية. وقد تم قياس تحت الجلد توتر الأكسجين (PscO 2) على مستوى الجروح أثناء التحقق من الصحة لهذا النموذج 5 عن طريق وضع القطب البولاروجرافي في الأنسجة تحت الجلد بين اثنين من الجروح الدماغية. كانت PscO 2 القيم في الن...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وكان التئام الجروح في الفئران غالبا ما تكون موضع نقاش نظرا لقدرتها على شفاء الجروح المصابة وارتفاع معدل تقلب interanimal 5. كان واحدا من الأهداف الأصلية للنموذج أثناء تطورها لتقليل هذا الاختلاف. تعديلات على عرض رفرف، والحد من عدد من الجروح مع وضع معين (تركزت على رفرف مع ثابت موقع القحف الذيلية) وإدخال ورقة سيليكون أنجزت هذا الهدف. كما تم تخفيض التئام الجروح والشفاء من الانكماش التي كتبها الاندمال بتشكل النسيج الظهاري، كما في البشر، هو نتيجة محسوبة. التكيف للنموذج ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يود المؤلفون أن يعرب عن تقديرهم لدعم التمويل من جامعة جنوب فلوريدا ، قسم الجراحة (ماك وو ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Sil-Tec الأغطية الطبية الصف | المنتجات التقنية Inc. | 500-3 | غير مقوى ، سمك 0.01 بوصة |
| مقص قزحية صغيرة ، 8 سم ، منحني ، SS | World Precision Instruments | # 503671 | |
| خيوط Ethilon Nylon | Ethicon | 1964G | أسود ، مقاس 4.0 ، PC-3 16 ؛ إبر مم (3/8 دائرة) |
| جهاز تصوير دوبلر ليزر | مستنقع أدوات | moorLDI2-IR | جهاز تصوير تدفق الدم القياسي: http://us.moor.co.uk/product/moorldi2-laser-doppler-imager/8 |
| ImageJ | للمعاهد الوطنية للصحة http://rsb.info.nih.gov/ij/ | ||
| Mastisol | Henry Schein | Cat # 7289210 | Fisher Scientific NC9774929 |
| Tegaderm | Medical Specials | 3M1624W | فيشر NC9922128 العلمي |
المراجع
- Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. Animal models of wound repair: Are they cutting it. Experimental dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).
- Dorsett-Martin, W. A. Rat models of skin wound healing: a review. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 12 (6), 591-599 (2003).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch Dermatol Res. 290 (S1-11), (1998).
- Finn, G., Magnus, S. A., Tonny, K. Models for use in wound healing research: A survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue). Wound Repair and Regeneration. 8, (2000).
- Gould, L. J., Leong, M., Sonstein, J., Wilson, S. Optimization and validation of an ischemic wound model. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 13 (6), 576-582 (2004).
- Loots, M. A., et al. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. The Journal of investigative dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
- Schwartz, D. A., Lindblad, W. J., Rees, R. R. Altered collagen metabolism and delayed healing in a novel model of ischemic wounds. Wound Repair Regen. 3 (2), 204-212 (1995).
- Chen, C., et al. Molecular and mechanistic validation of delayed healing rat wounds as a model for human chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 7, (1999).
- Zhang, Q., Chang, Q., Cox, R. A., Gong, X., Gould, L. J. Hyperbaric oxygen attenuates apoptosis and decreases inflammation in an ischemic wound model. The Journal of investigative dermatology. 128 (8), 2102-2112 (2008).
- Zhang, Q., Gould, L. J. Hyperbaric oxygen reduces matrix metalloproteinases in ischemic wounds through a redox-dependent mechanism. The Journal of investigative dermatology. 134 (1), 237-246 (2013).
- Moor, A. N., et al. Consequences of age on ischemic wound healing in rats: altered antioxidant activity and delayed wound closure. Age (Dordrecht, Netherlands). 36 (2), 733-748 (2014).
- Roy, S., et al. Characterization of a preclinical model of chronic ischemic wound). Physiological genomics. 37 (3), 211-224 (2009).
- Biswas, S., et al. Hypoxia inducible microRNA 210 attenuates keratinocyte proliferation and impairs closure in a murine model of ischemic wounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6976-6981 (2010).
- Winocour, S., Vorstenbosch, J., Trzeciak, A., Lessard, L., Philip, A. CD109, a novel TGF-beta antagonist, decreases fibrotic responses in a hypoxic wound model. Exp Dermatol. 23 (7), 475-479 (2014).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
