يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل مخطط كهربية الشبكية من الاستجابة البصرية في الزرد اليرقات

15.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52662

⸱

مارس 16, 2015

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Ophthalmology, Duke University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم طريقة لتحليل تخطيط كهربية الشبكية (ERG) ليرقات الزرد باستخدام تقنيات المعالجة الدقيقة وتخطيط الشبكية الكهربائية. هذه طريقة بسيطة ومباشرة لفحص الوظيفة البصرية ليرقات الزرد في الجسم الحي.

الملخص

في مخطط كهربية الشبكية (أرج) هي طريقة الكهربية موسع لتحديد وظيفة الشبكية. من خلال وضع إلكترود على سطح القرنية، ولدت النشاط الكهربائي في استجابة للضوء يمكن قياسها واستخدامها لتقييم نشاط الخلايا الشبكية في الجسم الحي. توضح هذه المخطوطة استخدام أرج لقياس وظيفة البصرية في الزرد. منذ فترة طويلة تستخدم الزرد كنموذج للتنمية الفقارية بسبب سهولة قمع الجينات التي أليغنوكليوتيد] morpholino والتلاعب الدوائي. في 5-10 إدارة الشرطة الاتحادية، والأقماع فقط وظيفية في شبكية العين اليرقات. ولذلك، فإن الزرد، على عكس الحيوانات الأخرى، هو نظام نموذج قوي لدراسة مخروط وظيفة البصرية في الجسم الحي. يستخدم هذا البروتوكول التخدير القياسية، والمجهرية والبروتوكولات stereomicroscopy التي هي مشتركة في المختبرات التي تقوم بإجراء البحوث الزرد. الأساليب المذكورة الاستفادة من معيار الكهربية مكافئuipment وكاميرا الإضاءة الخافتة للاسترشاد بها في وضع تسجيل مسرى مكروي على القرنية اليرقات. وأخيرا، علينا أن نظهر كيف أن يتوفر تجاريا أرج مشجعا / مسجل مصممة أصلا للاستخدام مع الفئران يمكن بسهولة أن تتكيف للاستخدام مع الزرد. أرج من الزرد اليرقات يوفر وسيلة ممتازة لمعايرة مخروط وظيفة البصرية في الحيوانات التي تم تعديلها من قبل morpholino الحقن قليل النوكليوتيد وكذلك أحدث التقنيات الهندسية الجينوم مثل الزنك فنجر Nucleases (ZFNs)، النسخ المنشط على غرار المستجيب Nucleases (TALENs)، و تتجمع بانتظام Interspaced قصيرة المتناوب يكرر (كريسبر) / Cas9، والتي زادت بشكل كبير من كفاءة وفعالية استهداف الجينات في الزرد. وبالإضافة إلى ذلك، علينا أن نستفيد من قدرة وكلاء الدوائية لاختراق اليرقات الزرد لتقييم المكونات الجزيئية التي تساهم في photoresponse. ويعرض هذا البروتوكول الإعداد التي يمكن تعديلها واستخدامها من قبل الباحثينمع أهداف التجريبية المختلفة.

المقدمة

مخطط كهربية الشبكية (ERG) هو طريقة فيزيولوجية كهربية غير جراحية تم استخدامها على نطاق واسع في العيادة لتحديد وظيفة شبكية العين في البشر. يتم قياس النشاط الكهربائي استجابة لمحفز الضوء عن طريق وضع أقطاب تسجيل على السطح الخارجي للقرنية. تحدد خصائص نموذج التحفيز وشكل موجة الاستجابة الخلايا العصبية الشبكية التي تساهم في الاستجابة. تم تكييف هذه الطريقة للاستخدام مع عدد من النماذج الحيوانية بما في ذلك الفئران وأسماك الزرد. تتكون استجابة ERG النموذجية للفقاريات من أربعة مكونات رئيسية: الموجة A ، وهي إمكانات سلبية للقرنية مشتقة من نشاط الخلية المستقبلة للضوء. الموجة B ، وهي إمكانات إيجابية للقرنية مشتقة من الخلايا ثنائية القطب ON ؛ الموجة D ، وهي إمكانات إيجابية للقرنية تفسر على أنها نشاط الخلايا ثنائية القطب OFF ؛ والموجة C ، التي تحدث بعد عدة ثوان من الموجة b وتعكس النشاط في Müller glia وظهارة صبغة الشبكية1-4. مراجع إضافية لفهم تاريخ ومبادئ تحليل ERG في البشر النموذجية هي الكتاب المدرسي عبر الإنترنت ، Webvision ، من جامعة يوتا ونصوص مثل مبادئ وممارسات الفيزيولوجيا الكهربية السريرية للرؤية4،5.

< p class = "jove_content" > دانيوريريو (الزرد) مفضل منذ فترة طويلة كنموذج لنمو الفقاريات ، نظرا لنضجه السريع وشفافيته ، مما يسمح بالتحليل المورفولوجي غير الغازي لأنظمة الأعضاء ، والمقايسات السلوكية والشاشات الجينية الأمامية والعكسية (للمراجعة ، انظر Fadool and Dowling6). يرقات الزرد قابلة للعلاج الجيني والدوائي ، والتي ، عندما تقترن بخصوبتها العالية ، تجعلها نموذجا حيوانيا ممتازا للتحليلات البيولوجية عالية الإنتاجية. النسبة الأعلى من المخاريط إلى القضبان في يرقات الزرد - حوالي 1: 1 مقارنة بالفئران (~ 3٪ مخاريط) - تجعلها مفيدة بشكل خاص لدراسة وظيفة المخروط7-9.

< p class = "jove_content"> في شبكية الفقاريات ، تتطور المخاريط قبل القضبان10. ومن المثير للاهتمام أن مخاريط أسماك الزرد تعمل في وقت مبكر يصل إلى 4 dpf ، مما يسمح بإجراء تحليل فيزيولوجي كهربي انتقائي للمخاريط في تلك المرحلة6،11،12. في المقابل ، تظهر استجابات ERG في القضبان بين 11 و 21 dpf13. لذلك ، تعمل يرقات الزرد عند 4-7 dpf وظيفيا كشبكية مخروطية بالكامل. ومع ذلك ، فإن استجابة ERG الضوئية الأصلية ل 4-7 dpf تهيمن عليها الموجة b. تطبيق العوامل الدوائية ، مثل حمض L- (+) -2-amino-4-phosphono-butyric (L-AP4) ، ناهض لمستقبلات الغلوتامات الأيضية (mGluR6) التي تعبر عنها الخلايا ثنائية القطب ON ، يمنع بشكل فعال توليد الموجة b ويكشف عن إمكانات مستقبلات الكتلة المخروطية المعزولة ، ("الموجة A") 14-17.

نصف هنا طريقة بسيطة وموثوقة لتحليل ERG باستخدام معدات ERG المتاحة تجاريا والمصممة للاستخدام مع الفئران التي تم تكييفها للاستخدام مع يرقات أسماك الزرد. يمكن استخدام هذا النظام على يرقات الزرد ذات الخلفيات الجينية المختلفة ، وكذلك تلك المعالجة بالعوامل الدوائية ، لمساعدة الباحثين في تحديد مسارات الإشارات التي تساهم في الحساسية البصرية والتكيف مع الضوء16. ستوجه الإجراءات التجريبية الموضحة في هذا البروتوكول الباحثين في استخدام تحليل ERG للإجابة على مجموعة متنوعة من الأسئلة البيولوجية المتعلقة بالرؤية ، وإثبات بناء إعداد ERG مرن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على صيانة والبروتوكولات التجريبية من قبل اللجان المؤسسية لرعاية واستخدامه بجامعة نورث كارولينا في تشابل هيل ، وتفي بجميع متطلبات مكتب المعاهد الوطنية للصحة لرعاية المختبر وجمعية تقييم واعتماد رعاية المختبر الدولية.
ملاحظة: للحصول على اليرقات لتحليل ERG ، تم استخدام البروتوكولات المنشورة لتربية أسماك الزرد القياسية وصيانتها18. يتم الحصول على اليرقات من خلال التكاثر الطبيعي ويتم إيواؤها تحت دورة ضوء 14 ساعة / 10 ساعات مظلمة. تم تحسين هذا البروتوكول لليرقات بعد 5-7 أيام من الإخصاب (dpf) ، ولكن يمكن إجراؤه بشكل مثالي على الأسماك الأكبر سنا مع تعديلات طفيفة على الإجراء. هنا ، استخدم سلالة TL من يرقات الزرد من النوع البري عند 5 dpf.

فئة

1. إنتاج الماصات الدقيقة

  1. اسحب العديد من الماصات الدقيقة باستخدام شعيرات دموية زجاجية من البورسليكات مصقولة بالحريق مقاس 1.5 × 0.86 مم مع خيوط (درجة حرارة الانصهار، 821 درجة مئوية) ومجتذب ماصات دقيقة مشتعلة/بنية اللون P-97 مزودة بخيوط حرارية صندوقية. استخدم البرنامج لتشكيل الماصات الدقيقة الموضحة في الجدول 1.
  2. افحص كل ماصة دقيقة تحت المجهر باستخدام مسطرة graticule مناسبة للتأكد من أن الأطراف يبلغ قطرها 10-15 ميكرومتر ولها فتحة طرف ناعمة (أي بدون حواف خشنة).
  3. قم بتخزين الماصات الدقيقة بعناية لمنع تلف الأطراف والتعرض للغبار. تشمل خيارات التخزين أطباق بتري مع شريط مختبر أو صناديق مبطنة بالرغوة أو حاويات تخزين الماصات الدقيقة المتوفرة تجاريا.
    ملاحظة: يمكن استخدام ساحبات الماصات الدقيقة والشعيرات الدموية الزجاجية الأخرى طالما تم تحقيق القطر الصحيح للماصة الدقيقة وطرف عالي الجودة.
ضغط حرارة سحب السرعه الوقت 500 جنيه 560 ريال - 30 200 ريال 500 جنيه 450 ريال - 30 200 ريال 500 جنيه 410 55 40 200 ريال

الجدول 1: برنامج لإنتاج الماصات الدقيقة باستخدام مجتذب الماصات الدقيقة P-97 Flaming/brown المزود بخيوط حرارية صندوقية. تصنع الماصات الدقيقة باستخدام شعيرات دموية زجاجية من البورسليكات مصقولة بالحريق مقاس 1.5 × 1.0 مم2 (القطر الخارجي حسب القطر الداخلي) مع خيوط (درجة حرارة الانصهار، 821 درجة مئوية).

< p class = "jove_title" >2. إعداد المخزن

المؤقت
  1. استخدم المخزن المؤقت19 للسمكة الذهبية المؤكسجة المفلترة في الشعيرات الدموية الكهربية الدقيقة ولتشبع إسفنجة كحول البولي فينيل (PVA) التي توضع عليها اليرقات للتجارب. بدلا من ذلك ، استخدم وسائط الجنين E3 أو محلول الملح المتوازن من Hank.
  2. قم بإعداد محلول Ringer للسمكة الذهبية 10x كما هو موضح في الجدول 2. اضبط على درجة الحموضة 7.8 ، وقم بتعقيمها باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر وقم بتخزين مخزون 10x عند 4 درجات مئوية.
  3. قم بإنشاء حل عملي في يوم التجربة عن طريق تخفيف محلول Ringer 10x إلى 1x بالماء المقطر منزوع الأيونات. قم بالتصفية باستخدام نظام تصفية 0.22 ميكرومتر. أكسجة عن طريق الفقاعات مع 95٪ O2/5٪ غاز ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 10 دقائق. قم بالغطاء بإحكام بعد ذلك للتأكد من بقاء المحلول مؤكسجا.
كلوريد الصوديوم 1.25 م كيه سي إل 26 ملم كلوريدالهواء 2 25 ملم مغنكلوريد2 10 ملم الجلوكوز 100 ملم هيبس 100 ملم < p class = "jove_content" >الجدول 2: تحضير محلول Ringer للسمكة الذهبية 10x.

< p class = "jove_title" >3. منصة مخطط كهربية الشبكية

  1. قم بإجراء تجارب ERG على طاولة مضادة للاهتزاز داخل قفص فاراداي لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. قم بتوصيل منصة فولاذية مخصصة بالطاولة المضادة للاهتزاز باستخدام الصواميل السداسية. ضع منصة بلاستيكية متحركة مع قاع ممتص للصدمات من بوليمر يوريثان لزج مرن على الطاولة أسفل مصدر الضوء.
  2. ضع الكاميرا بحامل ممغنط موجه لأسفل على المنصة البلاستيكية المتحركة. ضع المعالج الدقيق (الذي سيحمل القطب الصغير للتسجيل) بحامل ممغنط ثان على يمين المنصة البلاستيكية المتحركة. تأكد من عدم إزعاج الكاميرا وجهاز المعالجة الدقيقة من خلال حركة المعدات الأخرى وعدم إزعاجهما للإضاءة من مصدر الضوء.
  3. قم بتوصيل الكاميرا بشاشة فيديو ووضعها لعرض عين اليرقة لوضع القطب في الموضع المناسب.
  4. تأكد من تأريض الإعداد بشكل صحيح بالأسلاك النحاسية. للتحقق من الضوضاء، ضع القطب المرجعي وطرف القطب الصغير للتسجيل في طبق بتري مقاس 35 مم مملوء بمحلول رينجر. تحقق من مستويات الضوضاء الكهربائية للإعداد باستخدام راسم الذبذبات أو ميزة مدمجة في جهاز EG. يجب ألا تزيد مستويات الضوضاء عن ±10 ميكرو فولت من خط الأساس.
فئة < ص = "jove_title" >4. إعداد الإسفنج

  1. قم بقص مستطيل صغير من إسفنجة PVA الجافة التي تتناسب بشكل مريح مع طبق بتري مقاس 35 مم. يجب ألا يكون سمك الإسفنجة أكبر من عمق الطبق. استخدم سكينا متعدد الاستخدامات بشفرة حلاقة نظيفة للقطع.
  2. قم بعمل قطع إضافي في الإسفنجة لاستيعاب القطب المرجعي (إما قطع ضحل بالطول في الجزء السفلي من الإسفنج أو فراشة مقطوعة عموديا من خلال أحد الأطراف الأصغر).
  3. استخدم علامة مقاومة كيميائيا لتمييز نقطة صغيرة على الإسفنجة (حيث سيتم وضع اليرقة) يمكن استخدامها لوضع الكاميرا.
  4. انقعي إسفنجة PVA في محلول Ringer حتى تشبع. قم بإزالته ووصله بسرعة على منشفة ورقية 2-3 مرات. ضع الإسفنجة في طبق بتري نظيف مقاس 35 مم.
  5. ضع طبق بتري الذي يحتوي على الإسفنجة على المنصة البلاستيكية بحيث يمكن تصور العلامة بواسطة الكاميرا.
فئة

5. تحضير القطب الكهربائي

ملاحظة: يتكون إعداد الزرد من قطب مرجعي ملامس لإسفنجة PVA المشبعة بمحلول Ringer وقطب تسجيل ملامس للقرنية. يتكون القطب المرجعي من حبيبات Ag / AgCl. قطب التسجيل عبارة عن ماصة زجاجية مسحوبة مملوءة بمحلول Ringer ويتم تثبيتها بواسطة حامل قطب كهربائي صغير يحتوي على سلك Ag.

  1. كلوريد الأقطاب الكهربائية عن طريق نقعها في 6-9٪ هيبوكلوريت الصوديوم (المبيض) لمدة 5 دقائق (سلك القطب الصغير التسجيل) أو 15 دقيقة (القطب المرجعي). يجف في الهواء على Kimwipe لمدة 5 دقائق.
    1. اعتمادا على نمط القطع الذي تم إجراؤه في الخطوة 4.2 ، ضع حبيبات Ag / AgCl للقطب المرجعي في (لقطع الفراشة العمودية) أو أسفل (للقطع الضحل بالطول في الأسفل) الإسفنجة. قم بتوصيل سلك القطب المرجعي بنظام التسجيل.
    2. بدلا من ذلك ، إذا كان إعداد ERG يحتوي على قيود على مساحة أو كانت هناك قطع أثرية كهروضوئية قوية بشكل خاص من قطب Ag / AgCl ، فقم بتوصيل القطب المرجعي بالإسفنج عبر جسر ملح أجار لتحريك القطب الكهربائي خارج مسار الضوء.
  2. قم بتوصيل ~ 40 سم من الأنابيب ذات الحجم المناسب بحقنة قفل غير Luer سعة 5 مل. املأ المحقنة بمحلول رينجر. عادة ما يتم شحن حاملي الأقطاب الكهربائية الدقيقة التي تمتلك منافذ ضغط مع محولات لاستيعاب الأنابيب بأقطار داخلية 1/16 "أو 3/32" أو 1/8 "أو 5/32".
  3. املأ حقنة قفل غير Luer سعة 1 مل بمحلول Ringer ، وباستخدام Micro-fil ، املأ حامل القطب الكهربائي الدقيق بعناية. منع تكوين الفقاعات.
  4. قم بتوصيل المحقنة سعة 5 مل بمنفذ الضغط الخاص بحامل القطب الكهربائي الدقيق مع الأنبوب واستخدمه للتأكد من أن حامل القطب الكهربائي الدقيق مليء بمحلول Ringer. باستخدام حقنة Micro-fil و 1 مل مملوءة بمحلول Ringer ، املأ زجاج الماصة الدقيقة من الطرف وتأكد من عدم وجود فقاعات.
  5. قم بتوصيل الماصة الدقيقة الزجاجية بحامل القطب الكهربائي الدقيق، مع الحرص على إبقاء سلك القطب مستقيما. بمجرد تثبيتها ، استخدم المحقنة سعة 5 مل لإجبار محلول Ringer بعناية عبر القطب الكهربائي الدقيق حتى تظهر كمية صغيرة من المحلول على الحافة. سيؤدي الضغط العرضي على المحقنة (عند عدم تطبيقه على القرنية) إلى منع تكوين فقاعات الهواء ، وكذلك الانسدادات بسبب تراكم الغبار أو الملح ، في طرف الماصة الدقيقة.
    1. إذا خرج المحلول على شكل تيار ، فاستبدل الماصة الدقيقة الزجاجية ، لأن فتحة الطرف كبيرة جدا أو تالفة.
  6. ضع القطب الكهربائي الدقيق للتسجيل بعناية في جهاز المعالجة الدقيقة وقم بتوصيل السلك بنظام التسجيل.
فئة

6. تحليل مخطط كهربية الشبكية

ملاحظة: نظرا للهيمنة المخروطية لشبكية العين ، يمكن الحصول على نتائج ERG عالية الجودة عند إجراء الاستعدادات للتسجيل تحت مستويات منخفضة من الضوء الأبيض غير المباشر (<1 لوكس) أو بفترات قصيرة (<1 دقيقة) من ضوء العمل عالي الكثافة (≤250 لوكس). لا تزال هناك حاجة إلى فترة قصيرة من التكيف المظلم قبل التسجيل (انظر الخطوة 6.7). ومع ذلك ، يمكن إجراء التجارب تحت الضوء الأحمر الخافت أو الأشعة تحت الحمراء باستخدام كاميرا حساسة للأشعة تحت الحمراء. أجريت جميع التجارب في مياه نظام معقمة بالترشيح (0.22 ميكرومتر) من مرفق الاستزراع المائي لأسماك الزرد التابعة لجامعة نورث كارولينا ولكن يمكن استخدام وسائط جنينية بديلة.

  1. قطع مربعات المناشف الورقية بقياس حوالي 1 سم2.
  2. في حالة قياس إمكانات مستقبلات الكتلة المخروطية المعزولة ، احتضان 3-5 يرقات في ماء النظام مع 500 ميكرومتر (±) -2-أمينو-4-فوسفونوبوتيريك حمض (APB) لمدة 5 دقائق
    ملاحظة: في حين أن APB عبارة عن مزيج عرقي من الأشكال النشطة (L) وغير النشطة (R) من AP4 ، إلا أنها فعالة مثل L-AP4 وأقل تكلفة.
  3. قم بتخدير 3-5 يرقات في ماء النظام باستخدام 0.02٪ (وزن / حجم) تريكايين حتى لا يستجيب ، حوالي 1-2 دقيقة.
  4. استخدم ماصة باستور ومضخة ماصة لنقل اليرقات الفردية بعناية إلى مربعات المناشف الورقية تحت مجسم تشريح باستخدام الحد الأدنى من الإضاءة (≤250 لوكس لمدة <1 دقيقة). تحقق من موضع كل يرقة واختر مرشحا يكون الجانب الظهري لأعلى مع عين غير مسدودة.
    1. للتسجيلات الممتدة (>30 دقيقة) ، حافظ على رطوبة اليرقة عن طريق تزجيج الجسم حتى الرأس ولكن ليس بما في ذلك ميثيل السليلوز بنسبة 3٪ باستخدام فرشاة شعر الإبل الدقيقة.
  5. باستخدام الملقط ، انقل مربع المناديل الورقية مع اليرقة إلى إسفنجة PVA الرطبة.
    1. للتسجيلات الممتدة (>30 دقيقة) ، ضع تيارا مستمرا من غاز O2 المشبع بالماء بنسبة 100٪ على اليرقة عن طريق فقاعات الغاز عبر حجر هوائي في قارورة ذراع جانبية تحتوي على ماء مقطر. ضع الأنبوب الخارج من الذراع الجانبية للقارورة التي تنقل الأكسجين المرطب بالقرب من رأس اليرقة.
      ملاحظة: الخطوة 6.4.1 والخطوة 6.5.1 ستعمل على إطالة عمر السمكة16.
  6. تحت الحد الأدنى من الإضاءة ، استخدم الملاعب الدقيقة والكاميرا لوضع طرف القطب الكهربائي الدقيق عند نقطة المنتصف بين طرفي الأنف والذيلية للعين واضغط برفق على الحد الظهري للقرنية.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي وضع طرف القطب الخاطئ في المناطق البعيدة من القرنية إلى أشكال موجات ERG ذات قطبية عكسية.
  7. اسمح لليرقة بالتكيف مع الظلام لمدة 5-10 دقائق.
  8. سجل استجابات فلاش الاختبار للضوء المقدم من مصدر ضوء LED أو محفز بصري باستخدام معدات التحفيز والتسجيل المتاحة. اضبط معلمات البروتوكول مثل شدة الفلاش وطول الفلاش ولون الفلاش وكثافة الخلفية واللون وإعدادات المرشح لتناسب التجربة.
  9. عند الانتهاء من التجربة ، قم بالقتل الرحيم لليرقات وفقا لإرشادات AVMA / IACUC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عادةً ما يتم تسجيل مخططات كهربية الشبكية (ERGs) من يرقات سمك الزيبرا في اليوم الخامس بعد الإخصاب (5 dpf)، نظرًا لأن العديد من الدراسات نشرت تسجيلات ERG في هذه المرحلة9,16,20. تم قياس استجابات اليرقات في ظروف التكيف مع الظلام دون إضاءة خلفية باستخدام منبه من ضوء LED الأبيض لمدة 20 msec. استخدمنا نظام ERG متاحًا تجاريًا يتكون من محفز ضوئي من نوع Ganzfeld ووحدة تحكم/تسجيل حاسوبية. يستخدم المحفز نظام تعديل عرض النبضة (PWM) مملوكًا ومحكم التحكم للتحكم في نصوع كل من الخلفية ومنبه الومضات. سُجلت الاستجابات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول ، تم تفصيل إجراء بسيط لتسجيلات ERG لأسماك الزرد اليرقات. يسمح هذا الإجراء بفحص سريع وشامل للوظيفة البصرية. هناك العديد من الخطوات الحاسمة طوال الإجراء التي يجب وضعها في الاعتبار. يجب أن تكون يرقات الزرد صحية قبل التجربة لمنع الموت أثناء العلاجات الدوائية المحتملة وضمان سبل العيش لفترات طويلة أثناء تسجيلات ERG. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم أن تكون اليرقات المستخدمة في التجارب متطابقة بشكل وثيق مع العمر. ويرجع ذلك إلى التطور السريع لشبكية العين (أي التطور التفاضلي للأنواع الفرعية المخروطية) وكذلك ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر أعضاء مرفق الاستزراع المائي لأسماك الزرد في جامعة نورث كارولينا على صيانة أسماك الزرد. نود أيضا أن نشكر Diagnosys، LLC على المساعدة في إعداد جهاز ERG. شكر إضافي للدكتورة بورتيا ماكوي ومختبر الدكتور بن فيلبوت للمساعدة في الأساليب الفيزيولوجية الكهربية. نود أيضا أن نشكر ليزي جريفيث على توضيحها ليرقات الزرد. تم دعم هذا العمل من قبل جوائز المعاهد الوطنية للصحة F32 EY022279 (إلى JDC) و R21 EY019758 (إلى E.R.W).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قفص فاراداي80/20 Incالألومنيوم المصمم خصيصا "مجموعة نصب الصناعية" لإطار القفص
PVA الإسفنجAmazonB000ZOWG1Cيوفر منصة ناعمة ورطبة لوضع يرقات الزرد
150 مل أنظمة التصفية المعقمةحلول الترشيح 431154 Corningلمنع المفصليات الصغيرة من منع الماصات الدقيقة
Espion E2Diagnosys، LLCالاتصالبنظام الفيزيولوجيا الكهربية المعياري القادر على توليد محفزات بصرية لأي محفز وتسجيل رقمي وتحليل الاستجابات باستخدام برنامج اختصاصي ، مزيد من المعلومات في http://www.diagnosysllc.com
ColordomeDiagnosys، LLCcontactLight Stimulator مع RGB LED ومصادر ضوء زينون ل Ganzfeld ERG ، مزيد من المعلومات في http://www.diagnosysllc.com
MicromanipulatorDrummond3-000-024-Rإمساك ووضع القطب الكهربائي الدقيق للتسجيل
حامل الحلقة المغناطيسيةDrummond3-000-025-MBإمساك وتحديد موضع الكاميرا والقطب المرجعي
امتدادات الرصاصGrass TechnologiesF-LXكابلات الرصاص الاحتياطية من الإناث إلى الذكور 1.5 مم لتوصيل الأقطاب
الكهربائية دبوس ذكر بأنثى تقنيات محول SAFELEADGrassDF-215/10توصيل دبابيس 2 مم ب 1.5 دبابيس من اللوح
الأمامي إطار شاشة النافذة (معدني) وشريحةLowes أو Home Depotمختلفةلربط شبكة نحاسية بإطار قفص فاراداي
Steriflip 50 ملMilliporeSCGP00525حلول الترشيح لمنع المفصليات الصغيرة من حجب الماصات الدقيقة محول
BNCMonoprice4127توصيل الكاميرا بكابل BNC
كابل BNCMonoprice626توصيل الكاميرا بمحول الفيديو
عدسة الكاميراNavitar1582232تصور موضع القطب الصغير للتسجيل على قرنية اليرقات
مقرنة الكاميراNavitar1501149تصور موضع القطب الصغير للتسجيل على القرنية
Luna BNC إلى VGA + HDMIConverter SewellSW-29297-PROBNC إلى محول VGA يسمح لصورة الكاميرا بالعرض على شاشة الكمبيوتر
APBSigmaA1910mGluR6 ناهض ، يحظر الموجة b مما يسمح بتحليل مستقبلات كتلة المخروط المعزول
، زجاج البورسليكاتالمعزول SutterBF-150-86-10زجاج البورسليكات المصقول بالنار (درجة حرارة القياس = 821 درجة ؛ ج) مع خيوط وأبعاد 1.5 مم × 0.86 مم (القطر الخارجي بالقطر الداخلي)   ؛
P97 مجتذب مشتعل / براونSutterP97لسحب الماصات الدقيقة الزجاجية
ورقة السوربوتانThorlabsSB12Aبوليمر اليوريثان اللزج الاصطناعي ، الموضوعة تحت حوامل العزل السلبي ومنصة ERG لامتصاص الصدمات ومنع الانزلاق ، يمكن قطعها حسب الحجم
اللوحThorlabsB2436Fلوحة عزل الاهتزاز لمحفز ERG وعينة
أسماك الزردحوامل العزل السلبيThorlabsPWA074يوفر عزل الاهتزاز للوح التجارب
شبكة نحاسيةTWP022X022C0150W36Tلخط مضخة ماصة قفص فاراداي
VWR53502-233تستخدم مع ماصات باستور لنقل يرقات سمك الزرد بعناية
ماصات باستورVWR14672-608تستخدم مع مضخة الماصة لنقل يرقات سمك الزرد بعناية
الكاميراWatecWAT-902Bتصور وضع القطب الصغير للتسجيل على قرنية اليرقات
Tricaine (MS-222)ChemicalTricaine-Sمخدر من الدرجة الصيدلانية ،
حامل قطب كهربائي صغير Micro-filWPIMF28G-5وحامل قطب كهربائي صغير من الزجاج الكهربائي الصغير
WPIMEH2SW15يحمل قطبا كهربائيا صغيرا زجاجيا ، ويتصل بمعدات ERG
القطب المرجعيWPIDRIREF-5SHاقطع بعناية السنتيمتر الأخير من الغلاف لتصريف المنحل بالكهرباء وفضح قطب الحبيبات Ag / AgCl الملبد
القطب المرجعي (بديل)WPIEP1بديل ل DRIREF-5SH. قطب Ag / AgCl الذي يجب أن يكون سلكيا / ملحوما بتوصيل الرصاص
كابل منخفض الضوضاء لحامل القطب الكهربائيالدقيق WPI13620توصيل حامل microelctrode للتسجيل بالمحول / اللوح الأمامي
مخصص مرشحات Western

المراجع

  1. Dowling, J. E. The retina: an approachable part of the brain. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1987).
  2. Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
  3. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. J Neurophysiol. 91, 1134-1142 (2004).
  4. Heckenlively, J. R., Arden, G. B. Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , 2nd edn, The MIT Press. Cambridge, MA. (2006).
  5. Perlman, I. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. , (1995).
  6. Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. ProgRetin. Eye Res. 27, 89-110 (2008).
  7. Doerre, G., Malicki, J. Genetic analysis of photoreceptor cell development in the zebrafish retina. Mech. Dev. 110, 125-138 (2002).
  8. Brockerhoff, S. E., et al. Light stimulates a transducin-independent increase of cytoplasmic Ca2+ and suppression of current in cones from the zebrafish mutant nof. J Neurosci. 23, 470-480 (2003).
  9. Rinner, O., Makhankov, Y. V., Biehlmaier, O., Neuhauss, S. C. Knockdown of cone-specific kinase GRK7 in larval zebrafish leads to impaired cone response recovery and delayed dark adaptation. Neuron. 47, 231-242 (2005).
  10. Harada, T., Harada, C., Parada, L. F. Molecular regulation of visual system development: more than meets the eye. Genes Dev. 21, 367-378 (2007).
  11. Branchek, T. The development of photoreceptors in the zebrafish, brachydaniorerio. II. Function. J Comp Neurol. 224, 116-122 (1984).
  12. Schmitt, E. A., Dowling, J. E. Early retinal development in the zebrafish, Daniorerio: light and electron microscopic analyses. J Comp Neurol. 404, 515-536 (1999).
  13. Bilotta, J., Saszik, S., Sutherland, S. E. Rod contributions to the electroretinogram of the dark-adapted developing zebrafish. Dev Dyn. 222, 564-570 (2001).
  14. Wong, K. Y., Adolph, A. R., Dowling, J. E. Retinal bipolar cell input mechanisms in giant danio. I. Electroretinographic analysis. J Neurophysiol. 93, 84-93 (2005).
  15. Nelson, R. F., Singla, N. A spectral model for signal elements isolated from zebrafish photopicelectroretinogram. Vis Neurosci. 26, 349-363 (2009).
  16. Korenbrot, J. I., Mehta, M., Tserentsoodol, N., Postlethwait, J. H., Rebrik, T. I. EML1 (CNG-modulin) controls light sensitivity in darkness and under continuous illumination in zebrafish retinal cone photoreceptors. J Neurosci. 33, 17763-17776 (2013).
  17. Gurevich, L., Slaughter, M. M. Comparison of the waveforms of the ON bipolar neuron and the b-wave of the electroretinogram. Vision Res. 33, 2431-2435 (1993).
  18. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Daniorerio). , 5th edn, University of Oregon Press. Portland, OR. (2007).
  19. Kim, D. Y., Jung, C. S. Gap junction contributions to the goldfish electroretinogram at the photopic illumination level. Korean J PhysiolPharmacol. 16, 219-224 (2012).
  20. Brockerhoff, S. E., Dowling, J. E., Hurley, J. B. Zebrafish retinal mutants. Vision Res. 38, 1335-1339 (1998).
  21. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from colour units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 536-555 (1966).
  22. Naka, K. I., Rushton, W. A. S-potentials from luminosity units in the retina of fish (Cyprinidae). J Physiol. 185, 587-599 (1966).
  23. Shao, X. M., Feldman, J. L. Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials. J Neurosci. Methods. 159, 108-115 (2007).
  24. Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. ProcNatlAcadSci. U S A. 92, 10545-10549 (1995).
  25. Fleisch, V. C., Jametti, T., Neuhauss, S. C. Electroretinogram (ERG) Measurements in Larval Zebrafish. CSH protocols. , (2008).
  26. Seeliger, M. W., Rilk, A., Neuhauss, S. C. Ganzfeld ERG in zebrafish larvae. Doc Ophthalmol. 104, 57-68 (2002).
  27. Kainz, P. M., Adolph, A. R., Wong, K. Y., Dowling, J. E. Lazy eyes zebrafish mutation affects Müller glial cells, compromising photoreceptor function and causing partial blindness. J Comp Neurol. 463, 265-280 (2003).
  28. Lewis, A., et al. Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina. PLoS. genetics. 7, e1002239(2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحليل مخطط كهربية الشبكية من الاستجابة البصرية في الزرد اليرقات
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.