ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الخمول نموذج من الاستروجين تراعي سرطان الثدي في نخاع العظام: أداة للدراسات الآلية الجزيئية والجيل الفرضية

ملخص

< p class = 'jove_content'> قمنا بتطوير نموذج في المختبر للسكون في نخاع العظام لخلايا سرطان الثدي الحساسة للإستروجين. الهدف من هذا البروتوكول هو إثبات استخدام النموذج لدراسة البيولوجيا الجزيئية والخلوية للسكون ولتوليد فرضيات للاختبار اللاحق في الجسم الحي.

الملخص

تعد دراسة سكون سرطان الثدي في نخاع العظام مهمة صعبة للغاية نظرا لتعقيد تفاعلات الخلايا الخاملة مع بيئتها الدقيقة وندرتها والفائض الهائل من الخلايا المكونة للدم. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بتطوير نموذج استنساخ ثنائي الأبعاد في المختبر لسكون خلايا سرطان الثدي الحساسة للإستروجين في نخاع العظام. يتكون النموذج من بعض العناصر الرئيسية اللازمة للسكون. وتشمل هذه 1) استخدام خلايا سرطان الثدي الحساسة للإستروجين ، والتي من المحتمل أن تظل نائمة لفترات طويلة ، 2) حضانة الخلايا بكثافة استمخراضية ، حيث يكون التفاعل الهيكلي لكل خلية بشكل أساسي مع الطبقة السفلية ، 3) الفيبرونكتين ، وهو عنصر هيكلي رئيسي في النخاع و 4) FGF-2 ، وهو عامل نمو يتم تصنيعه بكثرة بواسطة الخلايا اللحمية لنخاع العظم ويترسب بشكل كبير في المصفوفة خارج الخلية. تشكل الخلايا المحتضنة ب FGF-2 نسخا نائمة بعد 6 أيام ، والتي تتكون من 12 خلية أو أقل لها مظهر مسطح مميز ، وهي أكبر بكثير وأكثر انتشارا من الخلايا النامية ولها نسب كبيرة من السيتوبلازم إلى النواة. في المقابل ، تشكل الخلايا المحتضنة بدون FGF-2 مستعمرات تنمو بشكل أساسي تتكون من >30 خلية صغيرة نسبيا. يمكن أن تؤثر اضطرابات النظام بالأجسام المضادة أو المثبطات أو الببتيدات أو الأحماض النووية في اليوم 3 بعد الحضانة بشكل كبير على الجوانب المظهرية والجزيئية المختلفة للخلايا الخاملة في 6 أيام ويمكن استخدامها لتقييم أدوار الجزيئات أو العوامل أو مسارات الإشارات الموضعية في الغشاء أو داخل الخلايا على حالة السكون أو بقاء الخلايا الخاملة. مع التعرف على الطبيعة المختبرية للفحص ، يمكن أن يعمل كأداة مفيدة للغاية لجمع معلومات مهمة حول الآليات الجزيئية اللازمة لإنشاء الخلايا الخاملة وبقائها. يمكن استخدام هذه البيانات لإنشاء فرضيات ليتم اختبارها في نماذج الجسم الحي.

المقدمة

خلايا سرطان الثدي metastasize إلى نخاع العظم قبل المرض قابلا للاكتشاف ^1، في أقرب وقت تتطور الاورام الصغيرة الأوعية الدموية ^2،3. عملية النقيلي سريعا ولكن غير فعالة. الخلايا تدخل الأوعية الدموية الجديدة بسرعة، في ملايين في اليوم الواحد ⁴ ولكن قلة البقاء على قيد الحياة في رحلة إلى أعضاء بعيدة ^5. ومع ذلك، فإن بعض micrometastases البقاء على قيد الحياة في العظام ويمكن العثور عليها كما الخلايا واحد أو كتل الخلايا الصغيرة في شفاطات نخاع العظام من المرضى الذين شخصت حديثا ^1. هذه الخلايا تقاوم العلاج الكيميائي المساعد، والتي تدار لغرض جدا القضاء عليها ^6. وهبت هذه المقاومة، ....

البروتوكول

1. فحص مولد الرمع

1. إعداد تعليق خلية واحدة من خطوط خلايا سرطان الثدي تعتمد على هرمون الاستروجين خلايا MCF-7 وT47D باستخدام الخطوات المبينة أدناه
   1. نضح مستنبت (DMEM / 10٪ الحرارة المعطل مصل العجل الجنين / الجلوتامين والقلم / بكتيريا) من 10 سم الأنسجة صحن الثقافة وهو لا يزيد عن 50٪ متموجة مع MCF-7 أو خلايا T-47D. شطف مع برنامج تلفزيوني. احتضان مع التربسين 0.25٪ / 2.21 ملي EDTA الذائبة في DMEM ارتفاع نسبة الجلوكوز عند 37 درجة مئوية لمدة 1-4 دقيقة.

النتائج

وأجريت التجارب أن ألخص الفحص. يظهر مدار الساعة من التجربة في الشكل 2A. يتم تحضين الخلايا في كثافة مولد الرمع يوم -1، يضاف FGF-2 في متوسطة جديدة في اليوم 0 ويتم استزراع خلايا حتى يوم 6 عندما الملون أنها وتحسب المستعمرات. تدار أي اضطرابات للنظام في يوم 3 في 100 مجلدا ميكرولتر في 10X تركيزات النهائية المرجوة. ويوضح الشكل 2B مظهر نموذجي من النمو ونائمة المستعمرات. المستعمرات المتزايد تحتوي على> 30 الخلايا والمستعمرات نائمة تحتوي على 12 أو أقل.......

المناقشة

يتكون لدينا نموذج من عدة عناصر أساسية من السكون في نخاع العظام. وهو يتألف من الاستروجين الخلايا الحساسة، والتي هي نوع من المرجح أن تظل كامنة في نخاع لفترات طويلة ^10، وتتكون من فبرونيكتين، وهو العنصر الهيكلي الرئيسي للنخاع، FGF-2، وهو عامل نمو توليفها بوفرة من قبل سدى نخاع العظم وأودعت بشكل كبير في المصفوفة خارج الخلية من نخاع العظام ^31،32 والحضانة من الخلايا في كثافة مولد الرمع حيث تفاعلاتها هي في المقام الأول مع التحتية. بينما نخاع العظام المكروية هي أكثر تع.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
خلايا MCF-7	ATCC	HTB-22
T47D الخلايا   ؛	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom معالج TC لوحة متعددة الآبار	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 مم أطباق الثقافة	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 مم أطباق الثقافة	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm # 1 غطاء زجاجي مع تطبيق موحد للفيبرونيكتين	البشريكورنينج	354088
6 لوحة ثقافة الأنسجة الجيدة	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle متوسط ارتفاع الجلوكوز 10X مسحوق	Corning Life Sciences	50-013-PB
معطل الحرارة ، مصل الجنين	الأبقار مصدر مصل International	FB02-500HI
0.25٪ تريبسين / 2.21 ملي متر EDTA	Corning	25-053-CI
محلول البنسلين والستربتومايسين ، 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine ، 100x ، سائل	Corning	25-005-CI
مؤتلف FGF البشري   ؛ البحث الأساسي	D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	مثبط Chenical PI3K
C3 transferase   ؛	الهيكل الخلوي	CTO3	يثبط RhoA و RhoB و RhoC ، ولكن ليس GTPases ذات الصلة مثل Cdc42 أو Rac1
Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد   ؛	سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (أخضر)	المجسات الجزيئية	B607	Fluorochrome لتلوين الأكتين الليفي
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (أحمر)   ؛	المجسات الجزيئية	R415	Fluorochrome لتلوين الأكتين الليفي
Alexa Fluor 488 Donkey المضاد للفأر IgG المضاد ، كاشف ReadyProbes   ؛	المجسات الجزيئية	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant مع DAPI & nbsp ؛	المجسات الجزيئية	P-36931