مقالة منهجية

و، الفحص السلوكية قابلة غير مكلفة لقياس الإيثانول التخدير الحساسية والتسامح السريع في

10K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/52676

⸱

أبريل 15, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Human and Molecular Genetics, Virginia Commonwealth University, 2VCU Alcohol Research Center, Virginia Commonwealth University

في هذه المقالة

ملخص

المقايسات المباشرة لقياس حساسية الإيثانول والتسامح السريع في ذبابة الفاكهة تسهل استخدام هذا الكائن الحي النموذجي للتحقيق في هذه السلوكيات المهمة المتعلقة بالإيثانول. هنا ، يتم وصف اختبار بسيط نسبيا وقابل للتطوير لقياس حساسية الإيثانول والتسامح السريع في الذباب.

الملخص

اضطراب تعاطي الكحول (AUD) هو التحدي صحية خطيرة. وعلى الرغم من عنصر وراثي كبير لAUD، وعدد قليل من الجينات قد تورطت بشكل لا لبس فيه في المسببات الخاصة بهم. ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة، هو نموذج قوي لاستكشاف الآليات الجزيئية الوراثية الكامنة وراء السلوكيات المتعلقة بالكحول، وبالتالي يحمل وعدا كبيرا لتحديد وفهم وظيفة الجينات التي تؤثر AUD. استخدام نموذج ذبابة الفاكهة لهذه الأنواع من الدراسات يعتمد على توافر فحوصات لقياس موثوق الاستجابات السلوكية لالايثانول. ويصف هذا التقرير مقايسة مناسبة لتقييم حساسية الايثانول والتسامح السريع في الذباب. ويتأثر حساسية الايثانول قياس في هذا الاختبار من خلال حجم وتركيز الإيثانول المستخدم، ومجموعة متنوعة من التلاعب الجيني ذكر سابقا، وأيضا طول الوقت ويعيش الذباب دون طعام مباشرة قبل الاختبار. في المقابل، الإيثانول الصورةلا يتأثر ensitivity قياس في هذا الاختبار من قبل قوة من معالجة الطاير، جنس الذباب، ومكملات متوسطة النمو مع المضادات الحيوية أو الخميرة الحية. وصفت ثلاث طرق مختلفة لquantitating حساسية الإيثانول، كل يؤدي إلى نتائج حساسية الإيثانول يمكن تمييزها بشكل أساسي. طبيعة قابلة للمن هذا الاختبار، جنبا إلى جنب مع بساطته الشاملة لانشاء ومنخفضة نسبيا حساب، وجعلها مناسبة لتحليل الصغيرة والكبيرة الحجم الوراثي للحساسية الايثانول والتسامح السريع في ذبابة الفاكهة.

المقدمة

اضطراب تعاطي الكحول (AUD) هو مشكلة صحية هائلة في جميع أنحاء العالم (مراجعة في 1). على الرغم من أن آليات القيادة وتطوير AUD معقدة، هذه الاضطرابات لها عنصر وراثي كبير (على سبيل المثال، 2). والتوريث كبير من AUD والاستجابات السلوكية الحفظ إلى الايثانول عبر العديد من الأنواع (التي استعرضت في 3،4) قد ولدت اهتماما كبيرا في استخدام الكائنات نموذج الجينية للتحقيق في تورط جينات معينة في السلوكيات المرتبطة الايثانول نحو فهم أفضل لالأساس الجزيئي لل AUD. ذبابة الفاكهة، ذبابة الفاكهة، برزت كشركة رائدة كائن نموذج لاستكشاف الآليات الجزيئية الوراثية من السلوكيات المرتبطة الإيثانول (استعراضها في 3،4). وقد أبرزت الدراسات في الذباب الأدوار لعدة مسارات إشارات في الاستجابات السلوكية لالإيثانول (استعراضها في 5). يثير الاهتمام والفضول، وبعض من الجينات والممرات التي تؤثر على رد و السلوكيةكما تم توريط وفاق لالايثانول في الذباب في السلوكيات المرتبطة الايثانول القوارض و / أو AUD البشري (على سبيل المثال، 6-14). الحفاظ على آليات القيادة السلوكيات المرتبطة الإيثانول عبر الأنواع، إلى جانب مجموعة من الأدوات الجينية المتاحة في نظام نموذجي ذبابة الفاكهة، تؤكد فائدة نموذج ذبابة الفاكهة للتحقيق في علم الوراثة من الاستجابات السلوكية لالايثانول.

ويرتبط حساسية 15،16 والتسامح (استعراضها في 17) إلى الإيثانول في البشر في تطوير AUD. كل من هذه الاستجابات السلوكية لالإيثانول يمكن أن تكون على غرار في الذباب عن طريق مجموعة متنوعة من فحوصات المختبر (استعراضها في 3،4). تعتمد كل من المقايسات ذبابة معروفة للمؤلفين على أي تعتمد على الوقت الإيثانول الناجم عن التخدير / اتناسق أو الانتعاش تعتمد على الوقت من الإيثانول التخدير.

في مقال سابق من مجموعتنا على الوراثة من حساسية الايثانول و rالتسامح APID في ذبابة الفاكهة، تم استخدام الفحص السلوكي على أساس الايثانول التخدير الناجم عن بخار من الذباب (18). وقد بدأ اختبار في هذا الاختبار عن طريق نقل الكبار يعيش الذباب بدون تخدير لتفريغ قارورة الغذاء، ومحاصرة الذباب في قارورة مع المكونات خلات السليلوز، مضيفا الإيثانول إلى الأعلى (أي الجانب غير الطيران) من السليلوز خلات المكونات، و ختم القارورة التي تحتوي على الذباب، والسليلوز خلات التوصيل والايثانول مع سدادة سيليكون (انظر التخطيطي في الشكل S3، مرجع 18). تم تقييم قوارير متعددة تمثل مجموعات مختلفة من الذباب في موازاة ذلك، زيادة الإنتاجية من هذا الاختبار. أعطيت قارورة رمز المجهولين وتم أعمى المجربون لمجموعة العلاج لمنع التحيز غير المقصود في تقييم التخدير. في تجربة القياسية، الذباب في قارورة تم استغلالها بلطف في 6 دقائق فترات، وبعد الشفاء 30 ثانية، وقد أحصى عدد الذباب مخدرا في كل قارورة والمحولد أن الذباب النشطة في المئة. استوعبت الذباب الإيثانول بخار من المكونات خلات السليلوز بطريقة تعتمد على الوقت، مما تسبب في زيادات تدريجية في الإيثانول الداخلي 18 والتخدير (المرجع CF 18 و الشكل 1A و 1B في هذا التقرير). وقد تم تعريف التخدير في هذا الاختبار عمليا كما الذباب (ط) مكانة في غياب المشي أو (ب) الكذب على ظهورهم مع أو بدون ترفرف أجنحتها. هنا، يتم وصف هذا الإيثانول التخدير فحص بالتفصيل، يتم توفير مزيد من التحسين التشغيلي ذات الصلة لاستخدامه، ويستخدم في فحص لمعالجة مساهمة خيارات مكملات الغذائية على حساسية ذبابة التخدير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. يوم قبل الفحص

  1. جمع الذباب في قوارير المواد الغذائية الطازجة في مجموعات من 11 (جنس واحد) تحت جيزة (1-5 دقيقة) CO 2.
  2. السماح الذباب لاستعادة O / N في قارورة الغذاء في المساحات الخاضعة للسيطرة للبيئة (عادة 25 درجة مئوية والرطوبة النسبية 60٪، و 12 ساعة ضوء / دورة الظلام).
  3. يعد حل الإيثانول (ق) عن طريق تمييع النقي (100٪) الايثانول في تنقية (≥18 MΩ) الماء إلى التركيز النهائي (ق) المناسب للتجربة المخطط لها. تسمح الحل (ق) للعودة إلى RT O / N.
    ملاحظة: التخفيف من الايثانول هو طارد للحرارة.

2. يوم من الفحص

  1. لكل قارورة من الذباب لفحصها، وإعداد (ط) نظيفة، فارغة قنينة الغذائي؛ أي اختبار قنينة، (ب) الجديد المكونات خلات السليلوز، (ج) سدادة سيليكون و (د) 1 مل من محلول الإيثانول (انظر الجدول 3).
  2. إعداد غرفة الاختبار عن طريق ضبط درجة الحرارة إلى 20-25 درجة مئوية والرطوبة النسبية إلى 55-65٪.
  3. هل لديك عامل آخرتعيين رمز فريد لكل مجموعة من قارورة وتسجيل رمز في وقت لاحق. ضع قارورة مشفرة مع الذباب في غرفة الاختبار حتى يتأقلم لدقائق قليلة.
  4. تسمية قارورة اختبار فارغة لمطابقة الرموز على قارورة ذبابة من 2.3.
  5. بناء الصعب سجل اختبار نسخة عن طريق إدخال رموز في أعمدة (عمود واحد / قارورة) في جدول بيانات مشابهة لجدول 1.
  6. باستخدام السجل اختبار كدليل، وترتيب قارورة الغذاء مشفرة مع الذباب وقارورة اختبار فارغة إلى مطابقة صفائف في قاعة الاختبار.
    ملاحظة: الحد الأقصى معقول من قارورة لاختبار هو 24 (أي 6 مجموعات من 4 قوارير لكل منهما).
  7. نقل الذباب من قوارير الطعام إلى مطابقة / وصفت قارورة اختبار فارغة وإدراج فورا السليلوز المقابس خلات في قارورة الاختبار حتى السليلوز المقابس خلات هي 2 سم تحت قمم القارورة.
  8. الآخرة، والتعامل مع كل صف من أربعة قوارير كمجموعة في متداخلة 1 دقيقة فترات.
  9. لتقييم الوقت 0، فهم كل قارورة بشكل فردي ثالإبهام والسبابة إيث، اضغط بلطف على الطاولة ثلاث مرات لضرب الذباب إلى أسفل القارورة، وانتظر 30 ثانية ثم حساب عدد من الذباب التي هي غير متحرك / الأموات. تسجيل عدد غير متحرك / الذباب الميت لكل قنينة في الساعة 0 دقيقة في سجل الاختبار الورقية.
  10. بدء الموقت تعول بشكل مستمر في الوقت 0 وتبدأ على الفور بإضافة 1 مل من الإيثانول إلى السليلوز المقابس خلات في قارورة لأول صف / مجموعة من 4 قوارير. إضافة 1 مل من الايثانول إلى المقابس خلات السليلوز في قارورة في 5 فترات ثانية بالترتيب الذي سيتم اختبار. إضافة الإيثانول إلى المقابس خلات السليلوز في حركة دائرية بحيث يتم استيعاب الإيثانول بالتساوي في جميع أنحاء المقابس خلات السليلوز. عندما تمت إضافة الإيثانول إلى كل قارورة اختبار 4 في المجموعة، وإدراج المكونات سيليكون في كل قارورة لختم عليه.
  11. وفي بعض الأحيان 1، 2، 3، 4 و 5 دقائق، إضافة 1 مل من الايثانول إلى الثالثة والرابعة والمجموعتين الثانية والخامسة والسادسة من 4 قوارير، على التوالي. مواصلة إدخال سدادات سيليكون بعدمضيفا الإيثانول إلى كل مجموعة من 4 قوارير.
  12. في وقت 6 دقائق، واختبار أول مجموعة من 4 قوارير من استيعاب كل قارورة مع الإبهام والسبابة، والتنصت بلطف على الطاولة ثلاث مرات لضرب الذباب إلى أسفل القارورة، والانتظار 30 ثانية ثم عد وتسجيل العدد الإجمالي لل الذباب التي يتم مخدرا. النتيجة الذباب كما مخدرا إذا كانوا (ط) الوقوف على أرضية القارورة ولكن لا يمشي أو (ب) الاستلقاء على ظهورهم مع أو بدون ترفرف أجنحتها.
  13. التعامل مع كل قارورة ضمن مجموعة في 5 فترات ثانية باستخدام الجدول الزمني في الجدول 2.
  14. في أوقات 7 و 8 و 9 و 10 و 11 دقيقة، واختبار المجموعتين الثانية والثالثة والرابعة والخامسة والسادسة من قوارير، على التوالي، كما فعلت لمجموعة العشرين.
  15. في وقت 12 دقيقة، واختبار أول مجموعة من 4 قوارير مرة أخرى كما هو موضح في 2.12 ومواصلة اختبار الثالثة والرابعة والمجموعتين الثانية والخامسة والسادسة من قارورة في 13 و 14 و 15 و 16 و 17 دقيقة على التوالي.
  16. مواصلة الذباب الاختبار كما هو موضح في 2.12 حتى كل الذباب هي الصورةedated.
  17. أدخل عدد من الذباب في كل قارورة في سجل الصعب اختبار نسخة. فرض رقابة متحركة / الذباب الميت في وقت و0 من إجمالي عدد الذباب.
  18. حساب الذباب النشطة في المئة في كل مرة التقييم نقطة والبيانات مؤامرة كما الذباب النشطة٪ (المحور الصادي) مقابل الوقت (محور س). Quantitate الإيثانول التخدير عن طريق التحريف التخدير الوقت 50 القيم (ST50، والوقت ل50٪ التخدير) من ثالث ترتيب منحنى متعدد الحدود أو السيني يناسب أو حساب المساحة تحت منحنى.
  19. تجميع البيانات من قارورة فك الشفرة وإجراء التحليلات الإحصائية (على سبيل المثال، في اتجاه واحد ANOVA مع Bonferroni التجارب المقارنة متعددة) بما يتناسب مع التصميم التجريبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

البيانات الخام من هذا الإيثانول التخدير الاختبار هي أعداد الذباب التي يتم مخدرا بوصفها وظيفة من بخار الإيثانول وقت التعرض. يتم تحويل البيانات الخام إلى الذباب النشطة في المئة بوصفها وظيفة من الزمن (البيانات الأولية، أرقام 1A، B، D - F). الحساسية للتخدير الإيثانول من البيانات الأولية يمكن quantitated كما التخدير الوقت 50 (ST50)، والوقت اللازم ل50٪ من الذباب لتصبح مخدرا أو AEA تحت المنحنى (AUC)، عن طريق الاستيفاء من منحنى يناسب. ذكرت سابقا 18

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

المقايسات واضحة أن quantitate بتكاثر الظواهر ذات معنى هي ذات قيمة كبيرة لتحليل السلوك. العمل الموصوف هنا يتناول عدة جوانب العملية لفحص لقياس حساسية الايثانول التخدير والتسامح السريع في ذبابة الفاكهة. على الرغم من عدم التركيز لهذا العمل، وتسهيل التحليلات السلوكية من خلال الحفاظ على البيئة وثابت الخلفية الوراثية للاختبار المواضيع ضمن الدراسة. وعلاوة على ذلك، ينبغي عادة أن إجراء مقارنات بين مجموعات من الذباب تربى واختبارها جنبا إلى جنب. تحقيقا لهذه الغاية، كان كل الذباب في ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذه الدراسات بمنح من المعاهد الوطنية للصحة ، والمعهد الوطني لإدمان الكحول وتعاطي الكحول إلى M.G. (P20AA017828 ، R01AA020634 ، P50 AA022537). يشكر المؤلفون جيل بيتينجر على المناقشات المفيدة وجاكلين ديلويت على المساعدة الفنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قوارير الطعامVWR89092-772العروضة الضيقة
Genesee / flystuff.com49-102
سدادة سيليكونفيشر Scientific09-704-1L# 4
الإيثانولPharmaco-Aaper111000200200 دليل
ضيقة

المراجع

  1. Rehm, J., et al. Global burden of disease and injury and economic cost attributable to alcohol use and alcohol-use disorders. Lancet. 373, 2223-2233 (2009).
  2. Prescott, C. A., Kendler, K. S. Genetic and environmental contributions to alcohol abuse and dependence in a population-based sample of male twins. The American journal of psychiatry. 156, 34-40 (1999).
  3. Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annual review of neuroscience. 36, 121-138 (2013).
  4. Scholz, H., Mustard, J. A. Invertebrate Models of Alcoholism. Current topics in behavioral neurosciences. 13, 433-457 (2011).
  5. Rodan, A. R., Rothenfluh, A. Functional Plasticity and Genetic Variation: Insights into the Neurobiology of Alcoholism. Reilly, M. T., Lovinger, D. M. 91, Elsevier. (2010).
  6. Schumann, G., et al. Genome-wide association and genetic functional studies identify autism susceptibility candidate 2 gene (AUTS2) in the regulation of alcohol consumption. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7119-7124 (2011).
  7. Corl, A. B., et al. Happyhour, a Ste20 family kinase, implicates EGFR signaling in ethanol-induced behaviors. Cell. 137, 949-960 (2009).
  8. Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93, 997-1007 (1998).
  9. Scholz, H., Franz, M., Heberlein, U. The hangover gene defines a stress pathway required for ethanol tolerance development. Nature. 436, 845-847 (2005).
  10. Riley, B. P., et al. Alcohol dependence is associated with the ZNF699 gene, a human locus related to Drosophila hangover, in the Irish affected sib pair study of alcohol dependence (IASPSAD) sample. Molecular psychiatry. 11, 1025-1031 (2006).
  11. Morozova, T. V., et al. Alcohol sensitivity in Drosophila: translational potential of systems genetics. Genetics. 183, 733-745 (2009).
  12. Ogueta, M., Cibik, O., Eltrop, R., Schneider, A., Scholz, H. The influence of Adh function on ethanol preference and tolerance in adult Drosophila melanogaster. Chemical senses. 35, 813-822 (2010).
  13. Han, S., et al. Integrating GWASs and human protein interaction networks identifies a gene subnetwork underlying alcohol dependence. American journal of human genetics. 93, 1027-1034 (2013).
  14. Lind, P. A., et al. A genomewide association study of nicotine and alcohol dependence in Australian and Dutch populations. Twin Res Hum Genet. 13, 10-29 (2010).
  15. Schuckit, M. A. Low level of response to alcohol as a predictor of future alcoholism. The American journal of psychiatry. 151, 184-189 (1994).
  16. Schuckit, M. A., Smith, T. L. An 8-year follow-up of 450 sons of alcoholic and control subjects. Archives of general psychiatry. 53, 202-210 (1996).
  17. Tabakoff, B., Cornell, N., Hoffman, P. L. Alcohol tolerance. Ann Emerg Med. 15, 1005-1012 (1986).
  18. Chan, R. F., et al. Contrasting Influences of Drosophila white/mini-white on Ethanol Sensitivity in Two Different Behavioral Assays. Alcohol Clin Exp Res. 38, 1582-1593 (2014).
  19. Eddison, M., et al. arouser reveals a role for synapse number in the regulation of ethanol sensitivity. Neuron. 70, 979-990 (2011).
  20. Wen, T., Parrish, C. A., Xu, D., Wu, Q., Shen, P. Drosophila neuropeptide F and its receptor, NPFR1, define a signaling pathway that acutely modulates alcohol sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 2141-2146 (2005).
  21. Bhandari, P., Kendler, K. S., Bettinger, J. C., Davies, A. G., Grotewiel, M. An assay for evoked locomotor behavior in Drosophila reveals a role for integrins in ethanol sensitivity and rapid ethanol tolerance. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1794-1805 (2009).
  22. Bhandari, P., et al. Chloride intracellular channels modulate acute ethanol behaviors in Drosophila, Caenorhabditis elegans and mice. Genes, brain, and behavior. 11, 387-397 (2012).
  23. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
  24. Chen, J., Wang, Y., Zhang, Y., Shen, P. Mutations in Bacchus reveal a tyramine-dependent nuclear regulator for acute ethanol sensitivity in Drosophila. Neuropharmacology. 67, 25-31 (2013).
  25. Lasek, A. W., Giorgetti, F., Berger, K. H., Tayor, S., Heberlein, U. Lmo genes regulate behavioral responses to ethanol in Drosophila melanogaster and the mouse. Alcohol Clin Exp Res. 35, 1600-1606 (2011).
  26. Maples, T., Rothenfluh, A. A simple way to measure ethanol sensitivity in flies. J Vis Exp. , e2541(2011).
  27. Rothenfluh, A., et al. Distinct behavioral responses to ethanol are regulated by alternate RhoGAP18B isoforms. Cell. 127, 199-211 (2006).
  28. Nohronha, A. Ch. 23. Neurobiology of Alcohol Dependence. 23, Elsevier. 467-495 (2014).
  29. Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Experimental gerontology. 46, 320-325 (2010).
  30. Martin, I., Grotewiel, M. S. Oxidative damage and age-related functional declines. Mechanisms of ageing and development. 127, 411-413 (2006).
  31. Devineni, A. V., Heberlein, U. Acute ethanol responses in Drosophila are sexually dimorphic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 21087-21092 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila Melanogaster 50

مقالات ذات صلة