مقالة منهجية

طريقة موحدة لتحليل خلايا الكبد خاص بالمنحنى البطانية وFenestrations من خلال المجهر الإلكتروني

DOI:

10.3791/52698

⸱

أبريل 30, 2015

 ,  ,  , 
1Centre for Education and Research on Ageing & ANZAC Research Institute, University of Sydney and Concord Hospital, 2Ageing and Alzheimers Institute, Concord Hospital, 3Charles Perkins Centre, University of Sydney

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلية البطانية الجيبية للكبد هي نظام ترشيح مهم بيولوجيا يتأثر بشدة بالأمراض والسموم والحالات الفسيولوجية المختلفة. هذه التغييرات تؤثر بشكل كبير على وظائف الكبد. نصف طرق توحيد قياس حجم وعدد الفتحات في هذه الخلايا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا البطانية الجيبية الكبدية هي بوابة الكبد ، وتسمح فتحاتها عبر الخلايا بالنقل دون عوائق للمواد الصغيرة والمذابة من الدم إلى حمة الكبد لعملية التمثيل الغذائي والمعالجة. Fenestrations هي هياكل ديناميكية - يمكن تغيير كل من حجمها و / أو عددها استجابة لمختلف الحالات الفسيولوجية والأدوية والأمراض ، مما يجعلها هدفا مهما للتعديل. يتطلب فهم كيفية تأثر مورفولوجيا LSEC بالحالات المرضية والسامة والفسيولوجية المختلفة وكيف تؤثر هذه التغييرات على وظائف الكبد قياسا دقيقا لحجم وعدد الفتحات. في هذه الورقة ، نصف تقنيات تثبيت ومعالجة الفحص المجهري الإلكتروني المستخدمة في مختبرنا لضمان تحضير العينة القابلة للتكرار والتفسير الدقيق. تشمل الطرق تثبيت التروية ، والتثبيت الثانوي والجفاف ، والتحضير للمجهر الإلكتروني الماسح والتحليل. أخيرا ، نقدم طريقة خطوة بخطوة لتحليل الصور الموحد الذي سيفيد جميع الباحثين في هذا المجال.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكبد الخلايا البطانية الجيبية (LSECs) هي غاية الخلايا البطانية المتباينة التي تبطن جدار جيبي الكبدي. ومثقبة LSECs مع fenestrations التي هي غير diaphragmed، العابر للالمسام 50-250 نانومتر في القطر. ما يصل الى 20٪ من سطح LSECs تغطيها fenestrations، التي عادة ما تكون في مجموعات من عشرات إلى مئات دعا لوحات غربال 1-3 (الشكل 1). Fenestrations سماح نقل البلازما وnanosubstrates بين الدم وخلايا الكبد، وخلق نظام الترشيح الفائق كفاءة عالية. Fenestrations هي البنى الدينامية - سواء من حيث الحجم و / أو رقم يمكن تغييرها استجابة لمختلف الدول الفسيولوجية، والمخدرات، والمرض. على سبيل المثال، fenestrations هي أكبر في صمت مما كانت عليه في الدولة التي تغذيها 4؛ 2-دي-iodoamphetamine يزيد عدد تنوفذ، 5،6 وانخفاض في حجم وعدد fenestrations في حدوث خلية في الشيخوخة والمرض العديد من الدول 13/7 . قياس دقيق لحجم وعدد fenestrations مهم لفهم كيفية تأثر LSEC التشكل المرض المختلفة، وسامة، والدول الفسيولوجية. تأثيرها على وظائف الكبد. ومن أجل تطوير تنوفذ تحوير التدخلات العلاجية 1.

دراسة fenestrations صعبة. قطر fenestrations يكمن تحت قرار من المجهر الضوئي التقليدي، لذلك فقد كان الوحيد سابقا الملاحظة باستخدام المجهر الإلكتروني في كل من أنسجة الكبد أو مثقف LSECs سليمة ممكن. وأكثر ما تم استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لدراسة حجم تنوفذ والتردد والمسامية (النسبة المئوية للغشاء LSEC التي مخترقين fenestrations) لSEM يسمح لمراقبة مناطق واسعة من سطح البطانية وقياس الآلاف، إن لم يكن عشرات الآلاف من fenestrations. على الرغم من فائدتها، والنتائج التي أبلغ عنها من دراسات SEM المستندة لالمعلمات LSEC مثل حجم تنوفذ، عدد وتواتر والمسامية وتختلف على نطاق واسع في الأدب (الجدول 1).

Fenestrations ولوحات غربال هي الهياكل الهشة التي العقد، كسر، تمدد أو تلتحم خلال إعداد العينات، لا بد من معالجة بالتالي الحذر للحفاظ على سلامتهم. ارتفاع ضغط التروية 14؛ الأسمولية غير صحيحة من تثبيتي، ومخازن 15؛ عدم كفاية التثبيت أو التثبيت الزمن؛ وسرعة الجفاف بعد تثبيت وتجفيف كلها مجالات تجهيز لSEM التي قد تنتج القطع الأثرية التي تتداخل مع الحفاظ على التركيب الدقيق (الشكل 2). فقدان fenestrations ('القذف من النافذة') وتنوفذ انكماش يمكن أن يحدث نتيجة لسوء التثبيت، مما أدى إلى انخفاض قطرها تنوفذ والمسامية الخلية. وقد وصفت وسائل لتحسين الحفاظ على عينات لتحليل SEM سابقا 15-17 وسيتم مناقشتهاهنا مع نصائح إضافية حول كيفية تحسين الحفاظ على العينة. الأهداف الرئيسية لحفظ العينات هي لإزالة الدم من الجيوب بحيث يمكن تصور سطح LSEC وتجنب الضرر LSEC إما من ارتفاع ضغط أو تأخير التثبيت. نضح الكبد كاملة من تثبيتي عبر الوريد البابي هو الأسلوب المفضل لتثبيت الكبد. كما هو موضح بالتفصيل في مكان آخر يجب القيام 16،18 نضح تحت ضغط منخفض (على سبيل المثال 10 سم من H 2 0) لتجنب القطع الأثرية نضح المتعلقة الضغط والأضرار التي لحقت LSEC، والذي تجلى عادة فجوات كبيرة كما ضمن في غشاء الخلية. ومع ذلك، يمكن في كثير من الأحيان الحصول على تثبيت معقول باستخدام إبرة نضح من خزعات الكبد من البشر والحيوانات، كما هو موضح بالتفصيل في مكان آخر (19). تتضمن هذه التقنية عن طريق الحقن مباشرة تثبيتي إلى الأنسجة حتى يتم مسح الدم من العينة والنسيج حازم وثابت. تثبيت العينات للفحص المجهري الإلكترون يجب أن يكون الأداء الإقتصادي الأداءormed في أسرع وقت ممكن بعد وقف تدفق الدم لمنع التغييرات التركيبية التي تحدث نتيجة للكبد عمليات الانحلال الذاتي سريعة للغاية.

كما نقدم طريقة لتحليل الصور التي تقلل إدراج القطع الأثرية، وتوحد قياس fenestrations. وقد أدى الاختلاف في اختيار الجيوب لالميكروسكوب، تحليل الصور من القطع الأثرية، وقياس مساحة الخلية لالمسامية وتنوفذ تردد إلى تناقضات كبيرة في نشر النتائج. نهج موحد لتقييم وقياس fenestrations ومتطلبات الحد الأدنى لعرض البيانات لم يتم التطرق بوضوح في الأدب سابقا 4،10،20-31.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام الحيوانات وتنفذ وفقا للتشريعات المحلية. الموافقة على عملنا من قبل لجنة رعاية الحيوان منطقة الصحة سيدني المحلي. ووصف الإجراءات المسموح بها في وثائق الترخيص للمشروع ومتابعة مبادئ توجيهية لضمان رفاهية الحيوان في جميع الأوقات. ضمان الالتزام التشريع على التجارب على الحيوانات من البلاد حيث يتم تنفيذ العمل.

1. بروتوكول لإعداد EM تثبيتي

  1. 100 مل من تثبيتي، وإعداد بارافورمالدهيد بإضافة 2 غرام من مسحوق امتصاص العرق إلى 25 مل من الماء المقطر في دورق مخروطي، والحرارة إلى 65 درجة مئوية مع التحريك باستمرار مع محرك مغناطيسي.
    ملاحظة: غلوتارالدهيد، لامتصاص العرق والصوديوم العازلة كاكوديلات كلها مواد خطرة ويجب دائما أن تعالج في fumehood.
  2. الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم يترك ليبرد. إذا لزم الأمر، إضافة محلول هيدروكسيد الصوديوم dropwايسي مع التحريك لمسح حل تماما.
    ملاحظة: هيدروكسيد الصوديوم الخطرة، التعامل مع الرعاية.
  3. إضافة 10 مل من EM الصف الأسهم غلوتارالدهيد، 50 مل من 0.2 M الصوديوم العازلة كاكوديلات و 2 غرام من السكروز واثارة مع محرك مغناطيسي. إضافة 2 مل من 1.0 M CaCl 2.
  4. ضبط لدرجة الحموضة 7.4 قبل اتخاذ حل ما يصل الى 100 مل بالماء المقطر. يحتوي تثبيتي النهائي 2.5٪ غلوتارالدهيد، 2٪ لامتصاص العرق، 2 ملمول CaCl 2، 2٪ السكروز في 0.1 M عازلة كاكوديلات. تأكد من أن الأسمولية إجمالية تبلغ 440 mOsmol / L. استخدام في غضون 24 ساعة من التحضير.

2. الإرواء التثبيت الكبد

  1. دافئ العازلة نضح وتثبيتي إلى 35-37 درجة مئوية. درجة الحرارة الصحيحة المخزن المؤقت استنزاف وتثبيتي يساعد على ضمان سلامة الأنسجة.
  2. تخدير الحيوان مع حقن داخل الصفاق واحدة من 50 ملغ / كغ الكيتامين و 5 ملغ / كغ زيلازين.
  3. وبمجرد أن الحيوان هو تحتالتخدير العميق، والمقررة من قبل انسحاب هند أطرافهم وقرصة الذيل، يتم إجراء شق Y مع حادة انتهت المقص في بطن الحيوان لفضح الكبد والوريد البابي.
    ملاحظة: تأكد من أن المعدات نظيفة لتجنب تلوث العينات مع الكائنات الحية الدقيقة والحطام العام والتي سينظر إليها بسهولة على SEM.
  4. ربط اثنين من الغرز فضفاضة جدا حول الوريد البابي الأقرب إلى الكبد، والآخر أكثر بشكل أقصى للكبد.
  5. يقني؛ يدخل القنية الوريد البابي مع قنية بحجم مناسب الرابع (18 G للفئران، 22 G للفئران) الغرز .Tighten لتأمين قنية.
  6. بدء نضح مع الفوسفات مخزنة المالحة درجة حرارة 37 درجة مئوية، وتحت ضغط من 10 سم من H 2 0. مطلوب عادة بين 5 و 20 مل من برنامج تلفزيوني ليستنزف الكبد.
    ملاحظة: لا يسمح لفقاعات الهواء بدخول الكبد من خلال أنابيب متصلة قنية لأنها تحفز التحف الثانوية لالانصمام والضغط؛ الأضرار التي لحقت خلايا الكبد، سيnusoids وfenestrations LSEC يحدث إذا كان ضغط التروية مرتفع جدا.
  7. قطع والبطن والصدر الوريد الأجوف للسماح المخزن المؤقت للخروج بحرية من الكبد. هذا يمنع الضرر ارتفاع ضغط الخلفي لLSECs.
  8. وبمجرد أن الكبد هو خال من الدم، استبدال برنامج تلفزيوني مع EM تثبيتي، ويروي ما يقرب من 5 دقائق، حتى هو صلابة الكبد وشاحب جدا.
  9. وقف نضح وقطع الكبد الثابتة إلى 1-2 ملم 3 كتل باستخدام مشرط حاد.
  10. الأنسجة بعد الإصلاح في EM تثبيتي ل24-72 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بشكل عام، underfixation يؤدي إلى مزيد من القطع الأثرية من overfixation.
  11. تغيير تثبيتي بعد فترة ما بعد الإصلاح إلى 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات للتخزين عند 4 درجات مئوية.
    سيتم الحفاظ على العينات المخزنة بهذه الطريقة لفترة طويلة من الزمن (تصل إلى 12 شهرا)، تثبيت الثانوي ولكن في الوقت المناسب ويوصى فحص حصول على أفضل النتائج: ملاحظة.

3. إبرة Perfusion

ملاحظة: إبرة تثبيت هو البديل من نضح تثبيت ينطوي على حقن تثبيتي مباشرة إلى أنسجة الكبد تحتاج فحص. والهدف من ذلك هو لتثبيتي إلى أن يتم مسح من خلال الأوعية الدموية من أجل يستنزف منهم وفضح كل من كتلة الأنسجة لتثبيتي. يجب توخي الحذر للحفاظ على ضغط الحقن منخفض لتجنب الإصابة الضغط 18،19.

  1. إزالة قطعة صغيرة من الكبد من الحيوانات أو الموضوع، وشطف في المياه المالحة لإزالة الدم والحطام.
  2. رسم ملحي في حقنة مزودة إبرة قياس غرامة (عادة حقنة الأنسولين).
  3. حقن محلول ملحي ببطء شديد في الكبد حتى يتم مسح الدم من الأنسجة. قد تكون هناك حاجة الحقن متعددة.
  4. رسم تثبيتي EM إلى حقنة أخرى مزودة إبرة قياس غرامة (عادة حقنة الأنسولين).
  5. حقن تثبيتي ببطء شديد في الكبد حتى يصبح من الصعب وتأن في اللون. حقن متعددةالصورة قد تكون مطلوبة.
  6. قطع الكبد الثابتة إلى 1-2 ملم 3 كتل باستخدام مشرط حاد. احتضان في تثبيتي EM عن 24-72 ساعة 4 ° C. يغسل 3 مرات في 0،1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات قبل البدء في تثبيت الثانوي.

4. التحضير للالمجهر الإلكتروني

  1. غسل العينة 3 مرات في 0،1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات. لإصلاح الدهون، وبعد إصلاح العينة في 2٪ رباعي أكسيد الأوزميوم في 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: أكمل الغسيل مهم جدا حيث تتفاعل عبر غلوتارالدهيد ورباعي أكسيد الأوزميوم وتولد القطع الأثرية في SEM.
  2. شطف عينات في زيادة تركيزات الإيثانول لبدء الجفاف. شطف الأولى في الايثانول 50٪ لمدة 5 دقائق. ثم 3 مرات لمدة 5 دقائق مع 70٪ من الإيثانول. شطف 3 مرات لمدة 5 دقائق مع 90٪ من الإيثانول. شطف 2 مرات لمدة 5 دقائق في الإيثانول بنسبة 100٪. وأخيرا شطف 2 مرات لمدة 10 دقيقة في الإيثانول بنسبة 100٪ (المنخل الجزيئي).
  3. إزالة جميع الإيثانول من العينات واستبدالها مع hexamethyldisilazane (HMDS) في fumehood ويترك لمدة 10 دقيقة. إزالة HMDS من عينات الأنسجة والسماح لتتبخر.
    ملاحظة: HMDS هو استرطابي للغاية عندما الباردة وبالتالي السماح للوصول إلى RT قبل استخدام لخطوة الجفاف النهائية.
  4. اختياريا، جبل العينات على الفور أو وضعها في مجفف حتى جاهزة للتحميل لSEM.

5. تركيب

ملاحظة: سيتم تصحيح العينة تصاعد تحقيق أقصى قدر من عدد من الجيوب محددة بوضوح المتاحة للتحليل تحت SEM.

  1. تسمية قاعدة معدنية بذرة SEM وتطبيق الوجهين الشريط الكربون الموصلة إلى الجزء العلوي من بذرة.
  2. تصور العينات باستخدام المجهر تشريح لتحديد السطح مع أفضل الجيوب لاحق SEM. وضع هذا السطح صعودا على سطح الشريط الكربون من كعب.
  3. العينات عصا بحزم كعب، العينات جاهزة الآن لتفل الطلاء.
ove_title "> 6. طلاء

ملاحظة: طلاء العينة مع فيلم جيد من معدن موصل (الذهب أو البلاتين) في أسباب تفل المغطي العينة ويحميها من التلف من شعاع الالكترون. إذا كان طلاء يجوز حجب هياكل سميكة جدا من الفائدة.

  1. مكان بذرة في فراغ الغرفة التلقائي تفل على ما يرام المغطى، ووضع للتناوب وتلقائية طلاء بالرش تعيين لمدة 45 ثانية. استخدام البلاتين طلاء لتفصيل أدق، ولكن الذهب هو أيضا مناسبة.
  2. تطبيق طبقة رقيقة من الطلاء الكربون على الأسطح الخارجية للعينات الكبد شنت، مع الحرص على عدم معطف السطوح الجيبية.
  3. مرة واحدة والمغلفة العينات مع البلاتين والطلاء قد جفت الكربون انهم مستعدون للمراقبة على SEM. ويمكن تخزين العينات في المجفف.

7. باستخدام مجهر المسح الإلكتروني

  1. المكان العينات إلى مجهر المسح الإلكتروني والعودة المجهر لفراغ.
  2. باستخدام إجراءات التشغيل القياسية المجهر لرؤية العينات التي تبدأ في تضخم منخفض، وزيادة التكبير تدريجيا.
  3. ضمان يتم ضبط المجهر بشكل مناسب للعمل عن بعد، حجم البقعة والاستجماتيزم.
  4. تحقق من سلامة تثبيت. إذا كان LSEC غير مجانا معظمهم من الثغرات ويحتوي fenestrations قياس 30-250 نانومتر قطر هذا من شأنه أن يشير عموما كان أن إعداد العينات ناجحة.
  5. إذا كانت الجيوب مليئة الثغرات أو خالية من fenestrations لم يكن تحضير العينة ناجح أو أن هناك أمراض كبير. في هذه الحالة، شريحة العينة بشفرة حلاقة دقيقة جدا، وقطع السطوح recoated وتحليلها لالجيوب الثابتة بنجاح.
  6. وفي حوالي 15،000-20،000 × التكبير تحديد السطوح LSEC مسطحة بحيث تكون خالية من الحطام مع التثبيت الجيد وحيث fenestrations واضحة للعيان (عادة تحتوي على 10 على الأقل fenestrations).
  7. حفظ الصور لا يقل عن 10 الجيوب في الكبد، من مناطق مختلفة من الكتل، وذلك باستخدام اثنين على الأقل من كتل في الكبد. أخذ العينات 10 الميكروسكوب في 15000 - 20000 × التكبير لكل حيوان غير كافية بشكل عام لتقدير حجم fenestrations لتكون ممثلة للكبد كامل.

تحليل 8.

ويستخدم برنامج يماغيج التي يمكن تحميلها مجانا من المعاهد الوطنية للصحة لقياس قطرها تنوفذ وتردد (ملاحظة: www.imagej.nih.gov/ij ).

  1. فتح صورة J ووضع جدول باستخدام شريط نطاق وجزءا لا يتجزأ في الصورة (لقطة الشاشة 1).
  2. باستخدام أداة المضلع في يماغيج، أثر في جميع أنحاء منطقة مسطحة بالكامل من LSEC بما في ذلك المناطق منوفذة وdefenestrated. لا مجرد تتبع لوحات غربال حيث سيؤدي ذلك إلى تضخيم زورا المسامية. استبعاد أي قطعة كبيرة من الحطام التي هي على سطح الخلية التي قد تكون obscurifenestrations نانوغرام.
  3. لقياس قطرها تنوفذ، وتتبع خط من خلال أطول قطر كل تنوفذ عن طريق اختيار أداة سطر، ثم اضغط على "م" لقياس الخط، و "د" (رسم) لرسم خط على الصورة بشكل دائم. ويعرف هذا الخط كما قطر تنوفذ. فإن طول الخط تكون متاحة الآن في مربع نتائج يماغيج (لقطة الشاشة 2).
  4. قياس كل الثغرات التي هي أكبر الثقوب في السيتوبلازم LSEC أكثر من 250 نانومتر، وكذلك fenestrations. الثغرات غالبا ما تكون القطع الأثرية التي تعكس ضعف التروية أو التثبيت، لكن ثغرات يمكن أن يحدث أيضا نتيجة المرض وسمية. سيتم استبعاد البيانات عن الثغرات من حساب المعلمات تنوفذ في وقت لاحق في التحليل.
  5. ينبغي أن تحسب مجال الثغرات التي لا التعميم عن طريق تتبع حول الثغرات وحساب منطقتهم على يماغيج.
  6. لصق البيانات من مربع النتائج في يماغيج إلى جداول البيانات إكسل لابعد من ذلكتحليل ص.

9. الحسابات

  1. متوسط ​​تنوفذ قطرها = متوسط ​​جميع أقطار نوفذة (وليس بما في ذلك الثغرات، حيث الفجوات ≥ 250 نانومتر).
  2. منطقة التثقب = πr 2، حيث يتم احتساب ص، نصف القطر، من fenestrations قطر الفردي (ص = د / 2)، وليس بما في ذلك الثغرات.
  3. المسامية (٪) = (Σ (πr 2) / مساحة إجمالية حلل - Σ (منطقة الثغرات =)) (ميكرون 2)) × 100.
  4. تردد تنوفذ = العدد الكلي للfenestrations / (مساحة إجمالية تحليل-Σ (منطقة الثغرات) (ميكرون 2).

10. عرض التثقب البيانات

وينبغي أن تتضمن كلما كان ذلك ممكنا، بما في ذلك المطبوعات الكمي للبيانات تنوفذ المعلومات التالية: ملاحظة

  1. تنوفذ القطر، مع بيان يؤكد ما أقطار الحدود حيث تستخدم لتحديد fenestrations (عادةبين 50-250 نانومتر)، وتردد التثقب (رقم / ميكرون 2) والمسامية (٪).
  2. وقال بيان يؤكد ما إذا كان قد تم إدراج ثغرات في التحليل، وينبغي أن تدرج الرسم البياني توزيع الترددات من قطر تنوفذ وعدد الأكباد، وكتل والصور وfenestrations في التحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصور الأولي في التكبير المنخفض عن طريق المسح الضوئي المجهر الإلكتروني يكشف سطح مستو للعينة الكبد وتبلغ مساحتها يتعرض كبيرة بما يكفي لمراقبة العديد من السفن الكبد الكبيرة والجيوب (الشكل 1A). ضمان الصحيح وضع كتلة الكبد على كعب متزايدة من الضروري للحصول على صور واضحة من الجيوب وكبسولة غليسون الكبد يجب تجنبها لهذا السبب (الشكل 1B). زيادة التكبير يسمح توثيق التفتيش من الأوعية الدموية كثيفة من الكبد ويكشف عن لوحات خلية واحدة من خلايا الكبد التي تقسم ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على بدقة وبتكاثر قياس حالة الكبد البطانة الجيبية هي خطوة هامة في فهم بيولوجيا هذه الخلايا المتخصصة للغاية. والتقنيات الحديثة مثل منظم إضاءة المجهر 32، قوة المجهر الذري 33 و D-STORM (مباشر الاستوكاستك البصرية Reconstrucion الميكروسكوب) 34 نقل المعلومات الهامة فيما يتعلق مورفولوجيا هذه الخلايا في المختبر لكنها لا تزال SEM المنهجية الأساسية لتصور وقياس بنيتها في الموقع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم أي اعترافات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
25٪ من الدرجة EM GlutaraldehydeProSciTechC001قم بتخزين المخزون عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لحين الحاجة ، وتجنب إعادة تجميد
مسحوق بارافورمالدهيدSigma Aldrich158127قم دائما بإعداد مسحوق كاكوديلات الصوديوم الطازج Paraformaldehyde
Sigma AldrichC0250تحضير مخزون 0.2 M ، درجة الحموضة 7.4 عن طريق إذابة المسحوق في dH2< / sub>O ، يستخدم في الغالب عند 0.1 متر عن طريق تحضير التخفيف 1: 2
كلوريد الكالسيومSigma AldrichC1016تحضير 1 M CaCl2عن طريق إذابة المسحوق في dH2< / sub>O
الأوزميومProSciTechC011اغسل الأمبولات في حمض ضعيف قبل الاستخدام لتجنب التلوث. تحضير 2 ٪ مخزون في زجاجة زجاجية
من الإيثانول - AbsoluteSigma Aldrich459836 أن يكون الإيثانول 100٪ عالي الجودة وتخزينه مع المنخل الجزيئي
درجات أخرى من الإيثانولLabtechEL5إعداد الإيثانول المتدرج مع dH2< / sub>
O HexamethyldisilazaneSigma Aldrich52619   ؛اتركيه للوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام
CannulasTerumoTSROX1832C ، TSROX2225C ، TSROX2419C18 G مناسب لمعظم الفئران ، 22 G مناسب لمعظم الفئران ، ولكن من الجيد أن يكون لديك عدد قليل من 24 G في متناول اليد في حالة الفئران الصغيرة
جدا شريط الكربون الموصلProSciTechIA0201
طلاء الكربونProSciTechI003
الكيتامينالحصول عليه بموجب ترخيص
Xylazineيجب الحصول عليها بموجب ترخيص
المنخل الجزيئيSigma Aldrich208647يزيل الماء من الإيثانول بنسبة 100٪
ثلاثي أكسيد يجب يجب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., et al. The Liver: Biology and Pathobiology. Arias, I. M., et al. , John Wiley & Sons, Ltd. 387-404 (2009).
  2. Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
  3. Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).
  4. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).
  5. Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).
  6. Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).
  7. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).
  8. Le Couteur, D. G., et al. Calorie Restriction, Aging and Longevity. Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R., et al. , 191-216 (2010).
  9. McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).
  10. Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).
  11. Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).
  12. Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).
  13. Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).
  14. Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).
  15. Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).
  16. Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).
  17. Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).
  18. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  19. Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).
  20. Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).
  21. Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. , (2014).
  22. May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6 (7), e21478(2011).
  23. Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).
  24. Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).
  25. Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).
  26. Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).
  27. Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).
  28. Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).
  29. Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).
  30. Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).
  31. Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).
  32. Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
  33. Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).
  34. Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Liver Sinusoidal Endothelial CellsScanning Electron MicroscopyFenestration AnalysisPerfusion FixationTissue DehydrationSputter CoatingImage J AnalysisFenestration DiameterFenestration FrequencyPercent Porosity

مقالات ذات صلة